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Two-Dimensional Gel Electrophoresis
  • 00:00Overview
  • 01:04Principles of 2D Gel Electrophoresis
  • 02:37Sample Preparation and Running Isoelectric Focusing
  • 04:08Running SDS-PAGE and Visualization/Analysis
  • 05:25Applications
  • 07:07Summary

二次元ゲル電気泳動

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Overview

二次元ゲル電気泳動法 (2DGE) は、生体分子の混合物からの何千もの問題を解決できる手法です。この技法が一緒に結合されている 2 つの明瞭な分離法: 等電集中 (IEF) とナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)。これは物理的に彼らの等電点 (電気化学的特性) と、分子量でゲルの 2 つの軸にまたがる化合物を分離します。

このビデオでは手順は、2DGE と複雑なタンパク質溶液の組成を特徴付けるための一般的な手順の主な概念を説明します。病気の発生と進展、治療、次の翻訳後修飾 (PTM) 蛋白質の調査の監視のためのバイオ マーカー検出を含むアプリケーションのセクションでこの技術の 3 つの例のとおりです。

2 次元、または 2 D、ゲル電気泳動法は単一の混合物からたくさんの蛋白質を分離する 2 つの異なる分離法を用いる。1 つの技術の SDS-PAGE やナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動は完全に複雑な混合物だけを切り離すことはできません。第 2 ゲルの電気泳動に 2 番目メソッド、等電点焦点またはライセート セル可能性がありますすべての蛋白質の解決を可能にする分離は、等電点に基づく、IEF SDS ページのカップルします。このビデオは、2 D の原則のゲルの電気泳動、一般的な手順といくつかの生物医学応用の表示されます。

第 2 ゲルの電気泳動は、最初の次元として IEF で始まります。すべての蛋白質は、等電点または pI、純充満がゼロと呼ばれる pH 値を持ちます。タンパク質は電界に服従する、反対の電荷を持つ電極に向かって移動します。興味のサンプルは、ampholytes、酸性および基本的なグループを含んでいる分子が埋め込まれているストリップ固定化 pH 勾配または IPG に読み込まれます。電界がネット、その電荷を失う彼らの pI を一致する pH 値に到達するまで移行するタンパク質の原因 pH 勾配のストリップに適用されます。

2 番目の次元を実行、する前に埋め込まれた蛋白質は sds のそれらの変化と均一否定的な充電を提供して扱われます。完了すると、IPG ストリップ、ポリアクリルアミド ゲル上に配置されます。適用された電界は大きい蛋白質のゲルを通ってもっとゆっくり移動と陽極に向かって蛋白質を描画します。

蛋白質の混合物は、pI と分子量に従って分離されている、一度汚れを用いてプロテオーム マップを可視化、興味の蛋白質が識別されます。

第 2 ゲルの電気泳動の原理について説明した、代表的な検査法に行きましょう。

実験を実行する前に、蛋白質はメディアに可溶化する必要があります。サンプルの可溶化脱水素結合相互作用、タンパク質の電荷、ジスルフィド結合を破るに還元剤の変更を防ぐために非イオン性洗剤を混乱させるためカオトロ ピック剤の組み合わせでタンパク質を集約することによって達成され、バッファーします。遠心分離、および結果として得られるペレット; のコレクションによって、干渉の豊富なタンパク質や他の分子を削除するには、材料を順番に抽出します。エンドヌクレアーゼに実験を妨げる DNA を使用する酵素処理後。

タンパク質を可溶化されている、一度 IPG ストリップがストリップのクリーニング液と洗浄によって調製し、乾燥する逆さまのまま。各ストリップ ストリップ ホルダー番号を割り当てられます。一度準備ができて、細胞のエキスがプラスの末尾に負からゆっくりと、スライド モーションのストリップ上に読み込まれます。電極上に、ゲルのストリップの下に湿気のあぶらとり紙を配置水分補給の目的IPG ストリップし、IEF 楽器の上に並んでいます。高電流を適用し、タンパク質が移行し始めます。

最初の次元が完了した後、SDS ページのゲルは、鋳造装置で用意しています。IPG のストリップは、SDS 含んでいる平衡バッファーにダウン顔を置くことによって扱われます。電気泳動装置、電気泳動バッファーの追加準備します。治療の IPG ストリップは、ピンセット、ゲル板の上に置かれ、agarose シール ソリューションで封を使用して収集されます。電圧源は、電界、最速の移動蛋白質はゲルの底から 1 cm まで保持されますを適用します。

電気泳動の終了後、タンパク質を視覚化する必要があります。従来この Coomassie 青いや銀の硝酸塩との汚損によって実行されます。興味の蛋白質はゲルから転送、西部のしみの分析を行ったことがあります。

2 番目の識別方法には、質量分析法で分析するよりも、それらを消化、ゲルからタンパク質の切除が含まれます。

今では我々 は、手順を確認したところ、第 2 ゲルの電気泳動の使用方法のいくつかを見てみましょう。

この手法の最も一般的な用途の 1 つは病気の開始そして進行に関与する分子の同定です。質量分析とつながれる第 2 ゲルの電気泳動は、健康なものと比較して病変部の特定の蛋白質のアップまたはダウン規制を検出できます。

さらに、第 2 ゲルの電気泳動は、次の潜在的な薬物治療に対する患者の反応の進行に便利です。供試体は、様々 な縦長の治療投与の患者から取られるかもしれない。この方法で西部のしみまたは質量分析と相まって第 2 ゲルの電気泳動することができます炎症; などの否定的な反応に関連付けられているタンパク質を検出または緩和状態で蛋白質の不在。

第 2 ゲルの電気泳動の別の用途は、次の翻訳の mRNA から蛋白質への追加は、タンパク質の構造と機能、翻訳後修飾や PTM の研究です。PTM のさまざまなタンパク質シグナル伝達、遺伝子発現を含む機能を調節するなったり、酸化的損傷があります。第 2 ゲルの電気泳動は、メチル化やアセチル化、pI として分子量の変化を引き起こすことができるなどの変更に敏感です。

第 2 ゲルの電気泳動のゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、テクニック、典型的な実験、生物医学分野への応用のいくつかの原則を説明します。

見てくれてありがとう!

Procedure

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Transcript

Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.

2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.

Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.

Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.

Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let’s go over a typical laboratory procedure.

Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins’ charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.

Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.

Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.

After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.

A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.

Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.

One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.

Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients’ response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.

Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM’s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.

You’ve just watched JoVE’s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.

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JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. Two-Dimensional Gel Electrophoresis. JoVE, Cambridge, MA, (2023).

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