Summary
이 프로토콜에는 그들의 눈 운동의 운동학을 측정 하는 체 외에서 고립 된 거북이 머리 준비를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 두개골에서 뇌의 제거 후, 두개골 신경 척도 회전 눈의 동 공 크기에 변화를 전류로 자극 수 있습니다.
Abstract
동물 안락사는 후 그들의 조직 죽을 시작 합니다. 거북 특히 온 혈 척추 동물에 비교 될 때 그들의 조직의 더 긴 생존 시간 때문에 이점을 제공 합니다. 이 때문에, 신경 신호를 조사 하는 시간의 연장된 기간 및 그들의 대상 작업의 제어에 대 한 거북에 생체 외에서 실험을 수행할 수 있습니다. 고립 된 머리 준비를 사용 하 여, 거북, 눈 운동의 운동학 측정 그리고 전기 신호에 의해 그들의 변조 두개골 신경에 의해 수행. 두뇌는 두개골에서 제거 되었다, 후 그대로 두개골 신경, 해 부 머리에에서 배치 했다 안구의 움직임을 보정 하려면 짐 벌. 유리 전극은 두개골 신경에 연결 된 (oculomotor, trochlear, 그리고 abducens) 안구의 움직임을 연상 하는 전류와 자극. 우리는 적외선 비디오 추적 시스템 및 눈의 계량된 회전 안구의 움직임을 모니터링. 전류 펄스의 진폭, 주파수, 범위 그리고 기차 기간 응답에 미치는 영향을 관찰 하는 데 사용 했다. 준비는 뇌에서 분리 하기 때문에 근육 대상에가 하는 원심 성 통로 중앙 처리 감각 정보의 부재에서 신경 신호를 조사 하는 절연에서 시험 수 있다.
Introduction
빨간 귀 슬라이더 거북 Electrophysiological 실험에 사용 하기 위한 근거:
빨간 귀 슬라이더 거북 (Trachemys scripta 선 충), 세계 최악의 침략 종1 중 하나 간주 됩니다 하 고 생태계 문제 임을 나타낼 수 있습니다. 왜 빨간 귀 슬라이더 거북은 그래서 성공 하는 이유는 제대로 이해 하지만 일부 했기 때문일 수도 있습니다 그들의 관용 생리학과 신경 조직의 hypoxic 조건2,3,4에서 살아남을 수 있는 소유 물 . 실험 그들의 숫자를 위협 하지 않습니다에 대 한 최소한의 노력으로 electrophysiological 준비 남아 있을 수 있는 실행 가능한 만큼 18 시간5,6연장된 기간 동안 그들을 사용 합니다. 혜택 또한 산소8의 낮은 레벨을 견딜 수 있는 대7, 같은 무척 추 동물 동물을 사용 하는 장점은 비슷합니다.
안구의 움직임을 측정 하기 위한 기법.
정면 eyed 동물 비 인간 영장류를 사용 하 여 안구의 움직임을 측정 하는 방법 잘 개발 된9되었습니다. 눈 회전 궤도 있는 3 개의 축: 수평, 수직, 및 비틀림. 마그네틱 검색 코일 방법 일반적으로 측정 회전에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 것으로 간주 하지만 침략, 동물10,11의 scleras에 삽입 하려면 작은 코일을 요구. 비디오 기반 시스템도 수 측정 회전 하 고 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 혁신적인 이미지 처리 함께 더 나은 카메라의 개발 비디오 기반 시스템12,,1314를 고려 하는 매력적인 대안을 만드는 그들의 기능을 강화 했습니다.
Nonmammals에서 안구의 움직임을 측정 하기 위한 개발 기술을 훨씬 덜 중요 한 되었습니다. 측정 중 낮은 해상도 또는 회전15,16,,1718의 일부 설명. 개발의 부족 시각적 대상에 따라 훈련 nonmammals에 어려움에 부분적으로 비난 받을 수 있다. 비록 눈 움직임 잘 빨간 귀 슬라이더 거북19,20,21,22,23,,2425 에서 연구 26,,2728,29,30, 대상 추적 훈련 동물에서 도전 때문에 그들의 눈 움직임의 정확한 운동학은 저조한 이해.
빨간 귀 슬라이더 거북은 일반적으로 척추 옆 눈 간주 됩니다 하지만 그들은 완전히 그들의 셸31에 그들의 머리를 철회 수, 때문에 등 딱지에 의해 측면 시각 필드의 중요 한 폐색 발생32. 결과 그들의 시각 가시 더 정면 눈 포유류 처럼 행동 그들 앞쪽 강제로. 따라서, 안구의 움직임을 측정 하기 위한 접근 방법을 개발 하기 위한 모델 사용은 또한 독특한 진화 관점을 제공 합니다.
이 작품에서 설명 하는 프로토콜 빨간 귀 슬라이더 거북의 눈 운동의 운동학을 식별 하는 생체 외에서 고립 된 머리 준비를 사용 합니다. 두뇌는 두개골 신경 그대로 두개골에서 해 부. 머리는 눈 근육 innervating 두개골 신경의 전기 자극에 의해 안구의 움직임을 보정 하 여 반응을 짐 벌에 배치 됩니다. 조치는 눈에 의해 회전의 어두운 눈동자와 아이리스의 표시를 추적 하는 소프트웨어 알고리즘을 사용 하는 비디오 기반 시스템에 의해 수행 됩니다. 운동학 extraocular 모두 (즉, 수평, 수직, 및 비틀림 회전)을 측정 하 기회를 제공 하는 준비32 및 안 구내 (즉, 눈동자 변화)33 움직임.
원심 성 신경 경로의 분석을 위한 모델 시스템:
접근 기회 공부 어떻게 원심 성 신경 신호를 생성 눈 움직임 근육 뇌32에 의해 처리 된 통합 감각 정보의 부재와 그들의 편안한 상태에서 시작 하는 조사를 제공 하는 더 일반적으로, 33. 따라서, 눈 운동학 있는 그들은 전적으로 원심 성 신경 통로 떠나 뇌와 근육에 synapsing에 의해 처리 되는 모델 시스템에서 시험 될 수 있다.
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Protocol
참고: 빨간 귀 슬라이더 거북, 둘 다 남성과 여성, 공급 업체 로부터 구입 했다. 거북이 따뜻한 동물 제품군 250 W 적외선 조명 아래 sunning 벽돌 제도 완비 두 60 갤런 통에에서 보관 되어 있었다. 환경 물 온도 22 ° c.에 14/10-h 명암 주기 유지 되었다 조명 오전 6시 켜져 있었고 오후 8시. 필터링 시스템 갖춘 탱크 매주 청소 했다 그리고 거북이 매일 광고 libitum 지 루 했다. 빨간 귀 슬라이더의 거북 그리고 다음 실험 절차 설명된 여기32,33 의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 라파예트 대학에 의해 승인 했다.
1. 장비 설치
- 터틀 벨의 솔루션을 준비 합니다. 이 순서 대로 증류수에 다음을 추가: 염화 나트륨 96.5 m m (58.44 g/mol), 2.6 m m (74.56 g/mol), 염화 칼륨 염화 마그네슘 2.0 m m (203.31 g/mol), 나트륨 중 탄산염 31.5 m m (84.01 g/mol), 포도 당 20.0 mM (180.16 g/mol), 집중 7.51, 및 염화 칼슘 4.0 m m (110.98 g/mol)에 pH를 조정 하는 염 산 ( 재료의 표참조). 각 솔트를 추가 하는 동안 솔루션을 믹스.
주의: 집중된 HCl은 위험한 (피부, 눈, 흡입 및 섭취 위험). - 5 cm 긴 모 세관에서 흡입 전극에 대 한 팁을 확인 하기 위해 다양 한 두께의 두개골 신경 내부 직경의 다른 크기에 화재 연마 하 여 ( 재료의 표참조)을 유리.
- 작은 파일을 사용 하 여 모 세관 유리의 조각에 걸쳐 선 엣지. 티슈 페이퍼에 놓고 반으로 휴식.
- 롤 천천히 분 젠 버너의 불꽃으로 유리 모 세관의 끝 중 하나를. 크기, 부드럽게, 그리고는 해 부를 사용 하 여 대칭에 대 한 팁을 주기적으로 검사 범위와 섬유 광섬유 빛 소스 ( 재료의 표참조).
참고: 20 그리고 30 밀리미터 사이 머리 폭 거북이, 최적의 피팅 내경 크기 일반적으로 0.4 oculomotor 신경 (nIII), 0.8 m m에 이르기까지 trochlear 신경 (nIV), 0.3에서 0.6 m m와 0.2에서 0.4 m m abducens 신경 (nVI)에 대 한.
- 깨끗 하 고 정리 Rongeurs, 무딘 해 부 조사, microscissors, 괜 찮 아 요 집게, 곡선된 겸 자, 그리고 메스 핸들 블레이드 ( 재료의 표참조) 해 부.
참고: 살 균 계기의 선택 사항입니다.
2. 마 취와 안락사
- 장소는 얼음에 거북이 양동이 cryoanesthetize 60 분 그것.
- 잘린 작은 동물 단두대를 사용 하 여 거북이 안락사 ( 재료의 표참조).
- 부드럽게 놀 리 려는 동물의 턱 작은 무게 주걱으로 후크를 삽입 하 고 위 턱의 끝 아래에 맞게 설정 수 있습니다.
- 단두대를 통해 동물의 머리를 연장 하는 꾸준한 압력 당겨. 신속 하 게 동물을 목을 벨.
- 거북이 머리를 해 부 접시에 놓습니다. 한편 관개 조직에 충분 한 거북이 벨의 해결책이. Oxygenize 95/5 O2/CO2 솔루션 ( 재료의 표참조).
- 얼음 접시의 외부 주위에 배치 하 여 4 ° C에서 조직을 유지 합니다.
3입니다. 해 부
- 섬유 광섬유 광원 절 개 범위를 사용 하 여 해 부를 수행.
- 아래 턱을 제거 합니다. 머리의 쉽게 처리를 제공할 것 입 통해 무딘 해 부 프로브를 배치 합니다. 메스와 두개골에 dentary 뼈 연결 관절을 잘라. 아래 턱은 두개골에서 뽑아 rongeurs를 사용 합니다. Rongeurs를 사용 하 여 두개골의 등 쪽과 측면 지역에서 피부와 근육이 그들의 첨부 파일에서 해 내.
- 척추 열을 제거 합니다.
- 두개골의 꼬리 끝에 척추 열을 식별 합니다. 척수를 ventrally 척추 열을 구 부. Microscissors를 사용 하 여 척수를 싹 둑. Rongeurs를 사용 하 여 caudally 당겨는 두개골에서 다른 조직과 척추 열을 제거 하.
- 두개골 신경 절단 후는 두개골에서 뇌를 제거 합니다.
- 구멍 매그넘에서 시작, 등 두개골에 두 개의 절 개를 잘라 rongeurs를 사용해. 상처 표면 아래 뇌의 손상을 방지 하려면 확인 합니다.
- Rongeurs를 사용 하 여 조심 스럽게 등 두개골 해 내. Microscissors를 사용 하 여 두뇌의 나머지 부분을 노출 meninx 제거. 후 각 전구 앞쪽 두개골 구멍에서 확인할 수 있습니다 때까지 충분 한 meninx 제거 ( 그림 1A참조). 터틀 벨의 솔루션을 필요에 따라 뇌를 관개를 계속 합니다.
- 굽은 집게를 사용 하 여 부드럽게 뇌 caudally 고 두개골 신경에 약간의 긴장을 생산. 신중 하 게 멀리 잘라 고 곡선된 겸 자와 후 각 전구 및 뇌를 제거 합니다.
- Microscissors를 사용 하 여 부드럽게 midbrain 두개골 신경; 폭로 중간 선 쪽으로 밀어 nIII, 약 0.6 m m, 이니라, 앞에서 볼 수 있다 그리고 직경 이니라의 약간 nIII 보다는 더 적은 있을 것입니다. 그들은 midbrain 연결할 이니라 nIII을 잘라 ( 그림 1B를 참조). 다른 측면에서이 반복 합니다.
- 왼쪽 및 오른쪽 시 신경 (nII)와 microscissors 잘라. 그런 다음 한쪽 brainstem 기울기. NVI는 폰 스 및 모 수의 교차점 근처 복 부 표면에서 신흥 관찰 ( 그림 1C참조). nVI의 직경은 작은 고 약 0.3 m m. 잘라내기 모두 왼쪽과 오른쪽 nVI.
- 좋은 집게와 microscissors 거북이에서 brainstem의 나머지 부분을 제거 합니다. 일단은 두개골에 두개골 구멍 바닥을 검사 합니다. NIII, nIV, 및 nVI를 식별 합니다.
- 위와 더 낮은 눈-뚜껑 미세 집게와 microscissors를 제거 합니다.
4입니다. 눈 움직임의 교정
- 딱딱한 테이블을 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 짐 벌 및 다른 계기의 배치를 지원 하기 위해. 머리의 등 쪽 표면 두개골에 걸쳐 작은 거품 수준 휴식을 사용 하 여 수평선에 평행 되도록 짐 벌 척으로 거북이 머리를 놓습니다. 대략 눈 중 하나을 짐 벌의 수평 및 수직 회전의 중심에 위치.
- 적외선 카메라는 적외선 발광 다이오드 (LED), 비디오 기반 눈 추적 시스템의 일부인 장착 장소 ( 테이블의 자료를 참조), 거북의 눈에서 약 12 cm의 보기 거리에.
- 카메라 눈의 시력의 라인 위에 45도 각도. 카메라 렌즈를 보면 LED 11 시 위치에 있어야 합니다. 눈의 광 축 센터 LED. 카메라는 (로 눈 위에서 본) 축에서 약간 있을 것입니다.
- 안구에 의해 극대로 채워진 카메라 보기는 눈에서 카메라의 거리를 조정 합니다. 가로 보기의 가장자리에 눈 (canthi)의 모서리를 확인 합니다.
- 추적 데이터를 처리 하는 시스템 비디오 기반 눈에 카메라를 연결 합니다. 원시 비디오를 캡처할 DVD 레코더에 신호를 분할. 눈의 깨끗 한 이미지를 카메라의 초점을 맞춥니다. 벌금-위치 (x, y, z) 선형 조정의 3도 사용 하 여 카메라 보기의 중심에 아이 짐 벌 제공 주의.
- 임계값 및 비디오 기반 눈 추적 시스템으로 제공 하는 프로그램을 사용 하 여 적절 하 게 대비를 설정 하 여 어두운 눈동자를 감지 합니다.
- 마우스를 사용 하 여 "비디오" 메뉴에서 클릭 하 고 "모드"에서 "높은 정밀도" 30 Hz (640 픽셀 x 480 라인의 해상도)의 샘플링 레이트에서 이미지를 선택. 또한 "비디오"에서 "학생 세분화 하는 방법"에 대 한 "눈동자 유형" 및 "타원 (회전된 타원)"에 대 한 "어두운 눈동자"를 선택 합니다.
- "EyeCamera" 창에서 "학생 검색 영역 조정" 아이콘 (가운데에 점이 작은 수직 사각형)를 클릭 합니다. 눈동자 주위 영역을 제한 하는 사각형 밖으로 드래그 하는 마우스를 사용 합니다. 눈동자와 혼동 될 수 있는 어두운 부분을 하지 마십시오.
- "컨트롤" 창에서 "자동 이미지"와 "긍정적인 잠금 임계값-추적" 상자 검사 됩니다 확인 합니다. "자동-임계값" 스캔의 밀도 최적화 하는 어두운 눈동자 녹색 점으로 표시 됩니다를 클릭 하십시오.
- 비디오 기반 눈 추적 프로그램 짐 벌 (+) 12.5 °의 회전을 수평 축을 중심 수직 축 중심 (+) 10 °의 비디오 디스플레이 보정.
- "컨트롤" 창에서 "디스플레이"를 클릭 합니다. "시선", "Calib 지역", 및 "기 표"에 대 한 "시선" 및 "Stim" 확인란. "기 표" 아래의 박스를 체크 후 창이 팝업 되며 말, "자극 디스플레이 형상을 해야 합니다 측정 전에 형상 그리드 표시 될 수 있습니다. 하 시겠습니까 지금 이렇게 "? 대 한 예 "Y"를 선택 합니다.
- 마우스를 사용 하 여 "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "자극"을 선택 합니다. "자극" 창이 디스플레이의 중심에 수직 및 수평 교차점을 보여주는 열립니다. "자극" 윈도우를 종료 하려면 키보드에 가까운 m m. 보도 "Esc" 라인의 길이 측정 합니다.
- 마우스를 사용 하 여 "자극" 메뉴에서 클릭 하 고 "형상을 설치"를 선택 합니다. 그냥 측정 하는 줄의 길이 입력 합니다. 도/라인 25 ° 수평 라인 및 20 ° 수직 라인에 대 한 동등한 시 거리를 조정 합니다. "저장" 버튼 클릭 하 고 창을 닫습니다.
- "EyeSpace" 창에서 교정 "9"를 "데이터 요소"로 선택 합니다. 거북이 눈 중앙에 위치, 클릭 센터 데이터 가리키고 "다시 제시" 버튼을 클릭 합니다.
참고: "자극" 창이 나타납니다, 그리고 "준비" 화면 중앙에 표시 됩니다. 상자 중심 위치에 표시 되며 다음 사라집니다. 그것의 실종에 "자극" 창이 닫힙니다. 센터 위치 이제 보정 한다. - 수평 유지 장치가 문제인 오른쪽/왼쪽, 12.5 ° /-12.5 °, 회전 및 업/다운 + 10 ° /-10 ° 나머지 데이터 요소를 보정 하는 절차를 반복 합니다.
- 비틀림 회전 보정, 피팅 알고리즘 프로그램 추적 비디오 기반 아이 함께 제공 된 템플릿을 사용 합니다. 알고리즘의 표시에 따라 제로 위치를 설정 하 고 표시는 눈동자의 중심에서 상쇄 될 때 회전의 각도 계산.
- 마우스 포인터를 사용 하 여 "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "염력"를 선택 합니다. "염력" 창에서 "시작" 버튼을 클릭 합니다. "EyeCamera" 창 호 눈의 이미지 위에 나타납니다.
- 반경, 각도, 그리고 불규칙 한 표 하기는 조리개에 존재 하는 위치에 있는 슬라이더를 사용 하 여 아크의 길이 조정 합니다. "실시간 그래픽"과 "후 자동 설정 조정"에 대 한 확인란을 선택. 필요한 경우 밝기를 조정 하 고 컨트롤 창에 다시 임계값 어두운 눈동자 대조 (4 단계 참조). "설정 서식 파일" 버튼을 클릭 합니다.
- 눈동자와 같은 초점 평면에 통치자를 놓고 전체 카메라 보기의 너비를 기록 합니다. 눈동자의 실제 너비를 결정 하는 값 나중 사용 됩니다.
5. 안구의 움직임을 연상 두개골 신경에 흡입 전극의 위치
- 신중 하 게 머리에 남아 있는 결합 또는 근육 조직으로 핀 참조 전극 장소.
- 흡입 전극 배치 ( 재료의 표참조) 두개골 신경에 호황에 탑재 micromanipulator 및 절 개 범위를 사용 하 여. 섬유 광섬유 광원을 사용 하 여 확인 하 고 위치 안내.
- 유리 모 세관 팁에 신경의 크기와 일치. 시행 착오는 최적 신경의 직경 주위를 얻기 위해 필요한 (크기 권장 사항에 대 한 1.2 단계 참조). 흡입 전극에 유리 팁을 놓습니다. 흡입 전극 벨의 솔루션 작성 및 약 주사기 내 볼륨을 조정 용량의 절반.
- 신중 하 게 선택 된 신경의 절단 끝 위에 위치 하는 micromanipulator를 사용 하 여 전극의 유리 팁을 이동 합니다. 벨의 솔루션 채우고는 두개골 표면 아래 팁은 확인 합니다. 필요한 경우 모델링 점토를 사용 하 여 위치 벨의 솔루션은 두개골 밖으로 새는 댐.
- 다시 주사기의 플런저를 당겨.
참고: 진공 모 세관 팁의 끝에 신경을 그릴 것입니다. 잘 맞는 거의 비슷하게 추가 진공 적용 팁 내 남아 있는 신경으로 표시 됩니다.
6. 자극의 두개골 신경 및 눈 운동의 분석
- 범용 신경/근육 자극 기를 사용 하 여 현재 격리 장치 ( 재료의 표참조) 흡입 전극을 통해 뇌신경을 자극 하.
- 흡입 전극 케이블을 사용 하 여 현재 격리 장치에 연결 합니다. 절연 장치의 접지 연결에 핀 참조 전극에서 리드를 연결 합니다.
- 선택 매개 변수는 다이얼을 사용 하 여 전류 자극 기 및 절연 장치에 전환 하 고. 1에서 100 µ A 전류 범위를 사용 하 여 10 400 Hz. 1 또는 2 ms 사용 열차 100, 500 또는 1000 ms 지속에 펄스의 주파수.
- Stimulations의 타이밍을 기록 합니다.
참고: 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 펄스는 자극에서 해류의 배달와 동기화와 통신 케이블 비디오 기반 눈 추적 시스템의 입력된 채널을 통해 실시간으로. 비디오 기반 안구 추적 프로그램 제어 통신 소프트웨어 모듈 제공.- 현재 응용 프로그램 및 눈 움직임에 그들 영향의 타이밍을 시각화 하려면 "PenPlots" 메뉴를 클릭 합니다. 선택 "X 시선 위치", "Y 시선 위치", "염력"와 "눈동자 너비" X 및 Y 위치, 비틀림, 및 학생 폭을 눈에 대 한 실시간으로 원시 데이터 플롯을 표시. 또한 타이밍 음모 1 s 간격에 표시 되는 눈금 표시를 표시 하려면 "PenPlots" 메뉴에서 "초 & 마커"를 선택 합니다.
참고: 대문자 "T" TTL 펄스, 동시에 발생 하는 현재 응용 프로그램의 개시를 표시 나타납니다. - 전류에 의해 갖는 눈 움직임의 데이터를 저장 하려면 "파일" 메뉴에서 클릭 하 고 "데이터" 아래 "새 데이터 파일"을 선택 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 "Enter" 키를 누릅니다. 저장 데이터는 일시 중지 될 수 있습니다 하 고 키 명령, "Ctrl" + "p"의 조합을 사용 하 여 다시 시작. 실험적인 세션이 완료 되 면 "데이터" 아래에서 "파일" 메뉴에서 "닫기 데이터 파일"을 선택 합니다.
- 적용의 종류의 추적을 유지 하기 위해, "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "데이터 패드"를 선택 합니다. "키패드/DataMarker" 창이 나타납니다. 편지 또는 신경에 전달 되 고 현재 stimulations의 매개 변수를 식별 하는 번호를 클릭 하십시오.
참고: 예를 들어, "X" 수 서 10 µ A. 클릭 "X"에 특별 게시물 분석을 위한 실시간으로 데이터 파일에 항목을 저장. 그것은 지속적인 관찰에 대 한 "초 & 마커"에 대 한 "PenPlot"에 나타납니다.
- 현재 응용 프로그램 및 눈 움직임에 그들 영향의 타이밍을 시각화 하려면 "PenPlots" 메뉴를 클릭 합니다. 선택 "X 시선 위치", "Y 시선 위치", "염력"와 "눈동자 너비" X 및 Y 위치, 비틀림, 및 학생 폭을 눈에 대 한 실시간으로 원시 데이터 플롯을 표시. 또한 타이밍 음모 1 s 간격에 표시 되는 눈금 표시를 표시 하려면 "PenPlots" 메뉴에서 "초 & 마커"를 선택 합니다.
- 눈 추적 시스템에서 데이터를 분석 합니다.
- 데이터를 정리 하 고 통계 분석을 수행 하는 선택의 스프레드 시트 프로그램으로 구분 된 텍스트 형식에 있는 저장 된 데이터 파일을 엽니다.
- Mm에서 실제 크기를 파일에 저장 된 눈동자 너비 값을 변환 합니다.
- X의 값을 변환 및 Y 위치와 정도의 단위에 torsions 눈 및 눈 움직임;을 설명 하기 위한 규칙을 사용 하 여 따라서, 회전의 긍정적인 방향: intorsion, 고도, 고 예증; 그리고 부정적인 회전의 방향: extorsion, 우울증, 그리고 납치.
- 헤더 정보를 새 워크시트에 복사 합니다. 이 화면 크기 (폭 및 높이)와 시 거리에 대 한 값을 포함 됩니다. 30 Hz의 속도로 수집 된 데이터의 8 열 머리글 정보 아래 따를 것 이다.
- 다시 원시 데이터가 포함 된 워크시트를 이동 합니다. "T", 현재 자극의 시작을 표시의 찾기 발생률 자극 10 µ A. 적용 된 찾을 "마커" 라는 마지막 열에 "X"에 대 한 "찾기"를 할. 15 행 복사 (0.5 s) 후에 "T" "T"와 90 프레임 전에 발생 하는 데이터 (3.0 s); 즉, 3.5 s 총입니다. 머리글 정보 아래 새 워크시트에 데이터를 붙여 넣습니다.
- "PupilWidth" 다음 빈 열을 삽입 합니다. 빈 열에서 mm에서 보정된 치수 변환:
수평 눈동자 직경 = "PupilWidth" × 카메라 보기 폭의 치수 - "X_Gaze"와 "Y_Gaze" 다음 2 빈 열을 삽입 합니다. 위치 보기 스크린의 크기를 표준화: 좌표 (0, 0) 상단에 왼쪽에 화면 확장 (1, 1) 오른쪽 하단에. 첫 번째 빈 열에 데 좌표계 위치 변환 (0, 0)는 스크린의 센터에서. 스크린의 크기를 변환 m m에 포함:
X = (0.5 × 폭)-("X_Gaze" × 폭); Y = (0.5 × 높이)-("Y_Gaze" × 높이)
참고: 왼쪽된 눈에 대 한 작업의 시퀀스가입니다. 순서는 오른쪽 눈에 대 한 납치에 대 한 부정과 예증에 대 한 양성의 규칙에 따라 위해 되돌릴 수 필요 합니다. - 두 번째 열에서 삼각 함수를 사용 하 여 회전의 각도 (°)로 변환:
수평 회전 = arctan (X/viewing 거리); 수직 회전 = arctan (Y/viewing 거리) - 비틀림 각도의 단위로 이미 표시 됩니다 하지만 왼쪽된 눈에 이루어집니다 측정 하는 경우에 intorsion에 대 한 양성의 규칙을 준수, 곱합니다-1. 오른쪽 눈에 대 한 아무 곱셈은 필요 합니다. 프로그램 코드 긍정적으로 시계 방향으로 회전 합니다.
- 시간의 기능으로 눈동자 직경 및 회전을 플롯 합니다.
- 데이터를 정리 하 고 통계 분석을 수행 하는 선택의 스프레드 시트 프로그램으로 구분 된 텍스트 형식에 있는 저장 된 데이터 파일을 엽니다.
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Representative Results
그림 1 에서는 해 부를 설명 하는 비디오에서 촬영 한 이미지의 스틸. 이미지는 두뇌에서 절단 전에 신경의 일반적인 위치를 제공합니다.
그림 1: 시 신경 (nII), oculomotor 신경 (nIII), trochlear 신경 (nIV), 및 abducens 신경 (nVI)의 위치를 표시 해 부 비디오에서 캡처한 이미지의 스틸. (A) 이미지는 meninx의 제거 후 뇌의 레이블이 지정 된 영역. 규모를 화이트 바 = 10 m m. (B) 이미지 쇼 위치 nII, nIII, nIV의 그들은 (후 각 전구 및 뇌의 제거) 후는 midbrain의 오른쪽에 연결. (C) 이미지 (은 midbrain의 제거) 후 brainstem의 왼쪽에 연결 nVI의 위치를 보여줍니다. 흰색 파선 신경 주위에 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 의 눈동자 직경 발생 후 평균 변화에서는 nIII를 자극. 외부 눈 움직임 또한 관찰 된다, 눈동자의 위치를 변경, 홍 채의 괄약근 pupillae에 의해 행동의 측정 신뢰성 남아 있다. 측정 한 준비에서 고 반복된 현재 stimulations 응답의 전형적인 변화를 보여주는. 1.60 ± 1.95 ± 0.01 m m에서에서 눈동자 직경 감소 의미 0.01 m m. 좁은 표준 편차 신경에 전극의 성공적인 적응을 나타냅니다. 다른 준비 사이에서 측정할 때 (N = 5), 일반적인 다양성은 ± 0.08 m m. 비록 여전히 상대적으로 좁은, 값은 단일 준비에서 관찰 된 변화 보다 약 8 배 큰.
그림 2: 전체 머리 준비에서 oculomotor 신경 (nIII)를 자극 하 여 갖는 동 공 수축의 예. 검은 추적 한 준비, 6 stimulations에서 평균 눈동자 직경 (PD) 이며 점선 표시 ± 표준 편차 (SD). X 축에 직사각형 파형 발병 및 50 µ A의 진폭 1 ms 펄스의 100 Hz 열차의 오프셋을 나타냅니다. 왼쪽 아래에 스케치 자극, 전에 눈에 아이리스 라인의 방향을 표시 하 고 하단에 이미지 표시 (B), 중 (A), 전에 대표 재판에서 여전히 프레임 전후 자극 (C). 규모를 화이트 바 = 1 밀리미터. 이 그림 사용 권한33와 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
학생 응답의 눈 회전;의 보정을 필요 하지 않습니다. 그러나, 외부 움직임을 측정 하는 경우에 짐 벌 머리의 배치 수행 되어야 합니다 신중 하 게 준비 (그림 3) 중 비교를. 머리 수평선과 평행한 짐 벌 두개골의 등 쪽 표면에 배치 됩니다, 아이리스 라인은 콧구멍으로 지평선에서 오프셋 됩니다. 그림 3D 는 준비에서 전형적인 오프셋 (28.6 °)을 보여 줍니다. 3 개의 다른 준비에 대 한 평균 오프셋 30.1 ± 9.0 ° 이었다. 표준 편차 내의 오프셋의 각도 수평 유지 장치에 맞게 허용 나타냅니다.
그림 3: 격리 된 거북이 머리 준비는 짐 벌에. 흰색 사각형의 (A) 지역 장비 설치의 사진에 거북 머리의 위치를 보여줍니다. (B) 확대 (7 시간) 흰색 사각형의 볼. 점선된 흰색 라인 이미지에 콧구멍에서 눈동자 센터 그려지고 수평선과 수준 이다. 흰색 실선은 겹쳐 고 아이리스 라인에 평행 하 게. 머리의 왼쪽의의 (C) 만화 (D) 비디오 기반 눈 추적 시스템의 카메라에 의해 촬영 된 눈의 이미지. 검은 눈금 막대: 5mm B; d에서1 m m입니다. 이 그림은 권한을32수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 는 10 준비 우량한 비스듬한 근육 것 이니라의 자극에 의해 갖는에서 눈의 평균 회전. Intorsion, 고도, 및 납치 (70 µ A, 오렌지 추적에 대 한 응답)에 대 한 일반적인 피크 회전은 10.0 ± 5.7 °, 2.8 ± 1.2 °, 및 3.0 ± 2.1 ° 각각. 크기 측정 회전 반복된 stimulations 단일 준비에는 유사 하지만 더 적은 가변성 (예를 들어, N = 5), 14.8 ± 1.0 ° intorsion, 3.2 ± 0.2 ° 상승, 및 2.4 ± 0.2 ° 납치에 대 한. 다른 준비는 단일 준비에 비해 중 variabilities의 패턴은 (하나의 로그 단위) 이내 무슨 동 공 변경의 조치에 대 한 관찰은: 6 배 더 큰 intorsion 및 고도, 11 번에 대 한 큰 납치입니다.
그림 4: 500 ms 100 Hz 열차 10 준비 (6 왼쪽 및 오른쪽, 다섯 시련 각 측정에 적용 하는 4에 적용)에 2-ms 펄스의 눈 회전 왼쪽된 trochlear 신경 (nIV) 자극 후 갖는 의미. 아래 그림의 x 축에 직사각형 파형 자극의 타이밍을 나타냅니다. 왼쪽 및 오른쪽 눈에서 응답 했다 서로 크게 다릅니다. Intorsion에 상승 및 납치 (거북이, 눈 움직임의 구성 요소를 요약 하는 그 화살표의 머리가 보기의 만화를 overlying 참조)가 동행 했다. 눈 운동 진폭 nIV 적용 7 현재 진폭에 해당 (범례 상자 코드 참조). 이 그림 허가32로 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
NIV, 우량한 비스듬한 근육에만는 달리 nIII 및 nVI 자극 여러 근육 움직임 더 도전 해석 되므로. 결과 안구의 움직임은 어떤 모터 단위 모집에 따라 달라 집니다 (그림 5) (참조 토론). 따라서, 변화 준비에서 준비 하는 중요 한 될 수 있다. 예를 들어 nVI 끝 intorsion, 고도, 및 납치 (그림 5C). 납치는 측면 곧바로;의 작업 추진 모터 단위에서 intorsion 및 상승 대신 견인 bulbi 또는 nictitating 막 등 대상에가 다른 모터 단위에서 유래한 다.
그림 5: 눈 운동 응답 10, 50, 100, 및 4 개의 준비에서 400 Hz 열차와 3 두개골 신경을 자극 하 여 갖는 의미. 모든 자극 열차 2 ms 펄스의 진폭, 임계값 값 70 µ A의 구성 된 기간에 500 ms를 했다. 눈 움직임 이전, 열 을-C 각각 nIII, nIV, 및 nVI, 자극에 대 한 응답을 보여주는 표시 됩니다. 이 그림 허가32로 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
NIII innervates 여러 대상 (우수한 곧바로, 열 등 곧바로, 열 등 한 비스듬한, 중간 곧바로 괄약근 pupillae), 때문에 갖는 움직임의 분석은 가장 복잡 합니다. 그림 5A의 예에서는 extorsion, 예증, 그리고 해발 고도 발생 합니다. 이에 따라, 합리적인 해석 작업은 대부분 열 등 간접에서에서 중간 곧바로에서 가능한 기여입니다. 탁월한 곧바로 고 열 등 곧바로 서로 취소할 수 있습니다. NIII 가능성에 대 한 작업의 높은 다양성 전극 피팅 컷의 위치와 신경의 큰 분기에서 유래한 다.
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Discussion
중요 한 단계:
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 해 부와 transected 신경;의 생존 능력을 유지 하 게 하는 치료 2)과 일치 하는 크기의 두개골 신경 하 일관 된;에 흡입 전극 그리고 3) 눈의 회전의 적절 한 보정을 제공 하는 짐 벌에 머리의 배치.
문제 해결:
해 부도 전하실 수 있습니다, 하지만 그것에 게 몇 번을 완료 단계는 상대적으로 곧장 앞으로 될 것. 신경 응답 하지 않는 경우, 가장 큰 원인은 해 부의 실패 이다. 두뇌의 제거 하는 동안 최소한의 긴장과 압력 적용 되어야 한다 신경에 그들의 절단 하는 동안. 금속 수술 도구와 신경을 건드리지도 피해 야 한다 가능한 만큼, 그리고 그래서 유리 후크 및 플라스틱 집게 대체할 수 있는 금속 도구에 대 한 문제가 계속34. 비록 거북이 조직 산소의 사용의 가변 수준을 생존 수 갓 만든 거북이 벨의 솔루션 95/5% O2/CO2 버블링와 냉장 하는 것이 좋습니다. 그러나, 이것은 덜 중요입니다. 모든 후, 준비를 사용 하 여의 장점은 다양 한 산소 수준 및 온도 변동2,3,,435에서 생존. 더 중요 한 이다 거북이와 준비의 정기적인 관개 벨의 조직에 밖으로 건조 하지 않도록.
실험 수행에 앞서 흡입 전극에 대 한 다양 한 크기의 팁의 집합을 만드는 신경에 잘 맞는의 기회를 향상 됩니다. 해 부와 마찬가지로 화재 연마 팁 연습을 걸립니다. 이전 실험에서 신경 머리를 보존 도울 수 팁을 제작 하는 동안 참조로 그것을 사용 하 고. 큰 직경 크기에서 작은 팁을 준비 하 고 일부 모델링 점토에 저장 하는 실험 동안 빠른 피팅 수 있습니다. 작은 팁, 더 많은 시간을 화 염으로 팁을 압 연이 필요 합니다. 팁 균열의 무료 하 고 신경에 좋은 인감 수 있도록 부드러운 가장자리를 소유 해야 합니다.
짐 벌에서 머리의 방향을 적절 한 해야 합니다. 그렇지 않은 경우에 측정의 축 비우는 것입니다. 예를 들어, 왼쪽에 동일한 증가 보다 크면 오른쪽 회전 눈의 중심 오프셋을 오른쪽으로 이동 될 필요가 나타냅니다. 또한 일부 문제는 회전 하는 동안 눈동자에서 신뢰할 수 있는 신호를 유지 발생할 수 있습니다. 눈동자의 조명 led가 약간 더 나은 결과 달성을 도울 수 있다 적외선에 의해 조정.
제한 사항:
준비의 단점은 특정 근육 동작의 운동학을 식별 어려움입니다. 이것은 특히 nIII 및 nVI stimulations 후 측정 하는 움직임에 대 한 사실입니다. 개별 근육 동작을 해결 하려면 한 가지 방법은 특정 근육에 여행 경로 분리 하기 위하여 신경 분 지의 체계적인 transections를 만드는 것입니다. 예를 들어 우리는 절단 nIII 속눈썹 중추를 자극 하는 짧은 속눈썹 신경 괄약근 pupillae33,36의 행동을 분리 하는 원심에 성공 하고있다. 또 다른 방법은 주 작동 근 길 항 근 근육에 스트레인 게이지 시스템을 탑재 하 여 다음 해당 하는 특정 근육37,38 의 활동으로 움직임입니다. 그 방법에 대 한 특정 근육을 여행 하는 통로의 격리는 필요에 따라 않을 것 이다.
준비 (예를 들어, 측면 곧바로 중간 곧바로 근육, 대 또는 괄약근 pupillae 대 괄약근 팽창 해당 근육에 반대 방향에서 행동 하는 탄성 요소와 관련 된 수동 스트레칭 수 있습니다. )39. 탄성 요소 구문 분석, 여기에 설명 된 대로 transected 신경 자극에 의해 얻은 응답을 바꾸어 영역과 소 뇌 sparred; 준비를 사용 하 여 얻은 그 비교 될 수 있다 따라서이 기능 신경 통합자 그대로 유지 하 고 각 근육40innervating brainstem에서 단일 motoneuron 영역을 자극 하는.
다른 척 추가 있는 모델에 관하여 의미:
Cryoanesthesia은 거북이 대 한 허용, 비록이 이렇게 warm-blooded 동물41,42일 승인 될 수 없습니다. 따라서, pentobarbital 또는 마 취 제 등 약리 에이전트 필요 하다. 그러나 에이전트,, 눈 움직임43혼동. 그럼에도 불구 하 고, 접근 파충류에 대 한 유용 하 고 격리 efferent 신경에 의해 생성 된 동작의 비교를 허용 하기 때문에 다른 측면 눈 비-mammalians, 수륙양용 비행기 및 물고기44,45, 등에 적용 될 수 있습니다. 그대로 동물32,33에 의해 그의 통로
미래의 응용 프로그램:
신경 조직 생존에 대 한 분석 결과 준비 될 수 있습니다. 프로토콜은 체계적으로 얼마나 다양 한 요인이 영향을 안구의 움직임을 해결 하도록 설계 될 수 있습니다. 접근 하기만 하면 다른 온도 또는 약리 에이전트 진통제를 포함 하 여 테스트 될 수 있습니다. 움직임은 nIII 및 nVI 해석 하기가 더 어렵습니다, 때문에 그들의 사용은 더 제한 됩니다. 따라서 nIV 가능성이 조작에 적합 것입니다.
그러나, 개별 근육 운동학을 해결 하기 위해 자극 nIII와 nVI, 결과 준비의 수정 것입니다 신경의 분 지의 체계적인 transection 만들기 등 대상된 근육 세트에 스트레인 게이지를 포함 한 필요한. 마지막으로, 결정 수 어디 신경 통합자 그대로 보관 준비에서 응답 측정 어떻게 탄성 요소 수 가능성이 제한 될 운동학의 quantifications.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원에 대 한 부인 Paulette 멕 케 나 및 비서 지원에 대 한이 연구에서 리사 Pezzino 씨 필 Auerbach을 감사합니다. 저자는 또한 우리 체 외에서 고립 된 머리 준비를 도입에 대 한 박사 마이클 아리엘과 마이클 S. 존스 (세인트 루이스 대학의 학부) 감사 합니다. 이 협력의 지원에 대 한 자금 학과 생물학 (로버트 S. 체이스 펀드), 학술 연구 위원회 그리고 라파예트 대학 신경 과학 프로그램에 의해 제공 했다. 마지막으로,이 작품은에 전념 씨 필 Auerbach, 28 9 월 2016; 돌아가 그는 스캐닝 전자 현미경을 해제 하 고이 프로토콜에 사용 하기 위해 그것의 5 축 단계의 유용성을 인식. 그의 우정과 지 략 크게 그리울 것 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
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