Summary
Этот протокол описывает использование головы подготовка в vitro изолированные черепаха для измерения кинематика их движений глаз. После удаления мозга из черепной коробки могут стимулировать черепных нервов с токи для количественного определения поворотов глаз и изменения в размеры зрачка.
Abstract
После того, как умерщвлены животных, их ткани начинают умирать. Черепахи предлагают преимущество из-за длительного времени выживания их тканей, особенно по сравнению с теплокровных позвоночных. Из-за этого в vitro эксперименты в черепах может выполняться продолжительное время расследовать нервные сигналы и контроля за их целевого действия. Использование изолированных головы подготовки, мы измерили кинематика движения глаз в черепах, и их модуляции электрических сигналов осуществляется черепных нервов. После мозг был удален из черепа, оставляемого черепных нервов, расчлененный головы был помещен в карданов подвес для калибровки движения глаз. Электроды стеклянные были прикреплены к черепных нервов (глазодвигательные, trochlear и отводящего) и стимулировали с токами вызывают движения глаз. Мы наблюдает движения глаз с инфракрасной видео, системы слежения и количественных вращений глаз. Импульсы тока с диапазоном амплитуды, частоты, и поезд длительности были использованы для наблюдения за влияние на ответы. Поскольку подготовка отделены от мозга, эфферентные пути собирается целевых мышц может быть рассмотрен в изоляции расследовать нейронных сигналов в отсутствие централизованной обработки сенсорной информации.
Introduction
Обоснование использования Красноухая черепах в электрофизиологических экспериментов:
Красноухая черепахи (Красноухая scripta elegans), считаются одним из худших инвазивных видов в мире1 и может указывать, что экосистема находится в беде. Причина почему настолько успешным Красноухая черепахи плохо понял, но это может быть отчасти из-за их терпимая(ый) физиологии и владение нервной ткани, которые могут выжить в гипоксических условиях2,3,4 . Их использование для экспериментов не угрожают их числа и с минимальными усилиями, электрофизиологических препаратов может оставаться жизнеспособным в течение длительного длительностей, покуда 18 часов5,6. Преимущество похож на преимущество использования беспозвоночных животных, таких как Раки7, которые также имеют способность выдержать низкий уровень кислорода8.
Методы для измерения движений глаз:
Подходы к оценке движения глаз в лобной глазами животных, с использованием не человеческого приматов были хорошо развиты9. Глаз поворачивается на орбите вокруг трех осей: горизонтальные, вертикальные и кручения. Магнитные Поиск катушка метод обычно считается самым надежным для измерения оборотов, но является инвазивным, требующих небольших бухтах вставляется в склер животных10,11. Видео на основе системы также можно измерить вращений и преимущество неинвазивные. Разработка лучше камеры наряду с инновационной обработки повысили их функциональность, делая видео основанных систем привлекательной альтернативой для рассмотрения12,,1314.
Методы, разработанные для измерения движения глаз в nonmammals были гораздо менее значительными. Меры являются либо низким разрешением или описать только некоторые из замен15,16,17,18. Отсутствие развития может быть частично обвинен на трудность в учебных nonmammals следовать визуальных целей. Хотя движения глаз хорошо изучены в Красноухая черепахи19,20,21,,2223,24,25 ,26,27,28,29,30, из-за вызов в обучение животных для отслеживания целей, точные кинематика их движений глаз это плохо понимать.
Красноухая черепах обычно считаются боковых eyed позвоночных, но потому, что они могут полностью отказаться от их головы в их оболочки31, значительные окклюзии бокового поля зрения, панцирь происходит32. В результате получается, что их визуального линии визирования принуждается к передней, делая их ведут себя подобно лобной eyed млекопитающих. Таким образом их использования в качестве модели для разработки подходов для измерения движений глаз также предлагает уникальный эволюционной точки зрения.
Протокол, описанный в этой работе использует в vitro изолированы с головы подготовка для идентификации кинематика движения глаз в Красноухая черепах. Мозги разделяются из черепов, оставляя нетронутыми черепных нервов. Руководители помещаются в карданов подвес для калибровки движений глаз и вызывают ответы по электрической стимуляции черепных нервов, иннервирующих мышцы глаза. Меры вращений глазами выполняются системой на основе видео, используя программные алгоритмы, которые отслеживать темный зрачок и маркировку радужки. Подготовки обеспечивает возможность измерения кинематики обоих экстраокулярных (т.е., горизонтальные, вертикальные и крутильных ротаций)32 и интраокулярные (т.е., ученик изменения)33 движений.
Система модель для анализа эфферентные нервные пути:
В целом подход обеспечивает возможность учиться как эфферентные нервные сигналы генерации движения глаз, когда мышцы начинают от их расслабленной государства и в отсутствие интегрированной сенсорной информации, обработаны мозга32, следователи 33. Таким образом кинематика глаз может быть рассмотрен в модель системы, в которой они обрабатываются исключительно в эфферентной нейронные пути оставляя мозга и synapsing на мышцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Красноухая черепахи, как мужчины, так и женщин, были приобретены у поставщиков. Черепахи были размещены в теплой животных люкс, содержащий два 60-галлон ванны оснащены кирпич острова для загорать под 250-W инфракрасный свет. Окружающей среде сохранялся на 14/10-h свет/темно цикла с температурой воды в 22 ° C. Огни были включены в 6:00 утра и выключен в 8:00 вечера. Танки оснащены системы фильтрации были очищены каждую неделю, и черепах кормили ad libitum каждый день. Забота о Красноухая черепах и все из следующих экспериментальных процедур описанных здесь32,33 были утверждены институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в Лафайет колледже.
1. Оборудование для установки
- Подготовьте раствор Рингера черепаха. Добавьте следующее к дистиллированной воды в таком порядке: натрия хлорид 96.5 mM (58.44 г/моль), хлорид калия 2.6 мм (74.56 г/моль), магния хлорид 2,0 мм (203.31 г/моль), натрия бикарбонат 31,5 мм (84.01 г/моль), декстроза 20,0 мм (180.16 г/моль), в основном Соляная кислота для регулировки рН 7,51 и хлорида кальция 4,0 мм (110.98 г/моль) (см. Таблицу материалы). Mix решение при добавлении каждого соли.
Предупреждение: Концентрированная HCl является опасной (кожи, глаз, вдыхании и попадании опасности). - Советы для всасывания электродов от 5-cm долго капиллярные стеклянные (см. Таблицу материалы), от пожара шлифовальные для различных размеров внутренних диаметров для того, чтобы вместить черепных нервов различной толщины.
- Используйте небольшой файл для etch линии через кусок капиллярного стекла. Место в папиросную бумагу и разорвать пополам.
- Медленно ролл один из концов капиллярные стеклянные в пламя горелки Бунзена. Периодически проверять подсказка для размера, гладкость и симметрии с помощью рассечение сферы и волоконно-оптический свет источника (см. Таблицу материалы).
Примечание: Для черепах с головы шириной между 20 и 30 мм, внутренний диаметр оптимальную установку размеров обычно колеблется от 0,4 до 0,8 мм для глазодвигательного нерва (НИИИ), 0,3-0,6 мм для Блоковый нерв (nIV) и 0,2 до 0,4 мм для отводящего нерва (НвИ).
- Чистота и организовать Rongeurs, тупым рассечение зонд, microscissors, тонкой щипцы, изогнутый пинцет и дескриптор скальпеля с лезвиями (см. Таблицу материалы) для рассечения.
Примечание: Стерилизации инструментов является необязательным.
2. анестезия и эвтаназии
- Место черепаха в лед ведро за 60 мин до cryoanesthetize его.
- Усыпить черепаха, обезглавливание, с помощью малых животных гильотинные (см. Таблицу материалы).
- Аккуратно извлеките пасть животного открыть с небольшой массой шпателем, чтобы крючок можно вставлять и повернул под конец верхней челюсти.
- Тянуть с устойчивым давлением продлить голова животного через гильотины. Быстро обезглавить животного.
- Место голову черепахи в блюдо рассечение. Иметь достаточно черепаха звонаря решение под рукой, чтобы орошать ткани. Oxygenize раствор с 95/5 O2/CO-2 (см. Таблицу материалы).
- Поддерживайте ткани на 4 ° C, поместив льда вокруг вне блюдо.
3. рассечение
- Используйте область диссекции с источником света оптического волокна провести вскрытие.
- Удаление нижней челюсти. Место тупые рассечение зонд через рот, чтобы облегчить обработку головы. Вырежьте совместное подключение челюсти кости черепа с помощью скальпеля. Используйте rongeurs чтобы вытянуть нижнюю челюсть от черепа. Используйте rongeurs чтобы снять кожу и мышцы от их вложений в спинной и боковых областей черепной коробки.
- Удаление позвоночного столба.
- Идентифицировать позвоночника на хвостовой конец черепной коробки. Изгиб позвоночника вентрально подвергать спинного мозга. Используйте microscissors чтобы СНиП спинного мозга. Используйте rongeurs для удаления позвоночника и других тканей из черепной коробки, потянув каудально.
- Удаление мозга из черепной коробки после резки черепных нервов.
- Начиная затылочного, используйте rongeurs сократить двух разрезов на спинной черепной коробки. Сделать разрезы поверхностные, чтобы избежать повреждения мозга под.
- Используйте rongeurs для тщательно стянуть спинной черепной коробки. Используйте microscissors для удаления серозным подвергать остальная часть мозга. Удалить достаточно серозным, пока обонятельные луковицы, в передней черепной полости, может быть идентифицирован (см. рис. 1A). Продолжать поливать мозга с раствор Рингера черепаха, при необходимости.
- Используйте Изогнутый пинцет для осторожно потяните головного мозга каудально и производить небольшое напряжение на черепных нервов. Тщательно обрежьте и удалить обонятельные луковицы и головного мозга с Изогнутый пинцет.
- Используйте microscissors чтобы аккуратно вставьте мозга к срединной подвергать черепных нервов; НИИИ, около 0,6 мм, можно увидеть перед nIV, и диаметр Нив будет немного меньше, чем НИИИ. Вырезать НИИИ и Нив где они придают мозга (см. рис. 1B). Повторите это на другой стороне.
- Вырежьте левый и правый зрительный нерв (НИИ) с microscissors. Затем наклон ствола мозга в одну сторону. Соблюдать НвИ, возникающие от брюшной поверхности возле пересечения моста и продолговатого мозга (см. рис. 1 c); Диаметр НвИ небольшой и приблизительно 0.3 мм. сократить как левая и правая НвИ.
- Удалите оставшиеся части ствола мозга из черепаха с тонкой щипцы и microscissors. После того, как черепа пуст, осматриваем Пол полость черепа. Идентифицировать НИИИ, Нив и НвИ.
- Удалите верхние и нижние веки с тонкой щипцы и microscissors.
4. Калибровка движений глаз
- Использование жесткой таблицы (см. Таблицу материалы), для поддержки размещения карданного и других инструментов. Место голову черепахи в патрон карданов подвес, так что спинной поверхности головы параллельно горизонт, с помощью небольшой пузырь уровень отдыха через череп. Примерно позиции одного из глаз в центре вращений карданного горизонтальные и вертикальные.
- Место инфракрасные камеры, оснащен инфракрасной Светоиспускающий диод (LED), которая является частью системы отслеживания глаз видео на основе (см. Таблицу материалы), на расстоянии около 12 см от глаз черепаха просмотра.
- Угол камеры 45 градусов выше линии визирования глаза. LED должен быть в положении 11 часов при взгляде на объектив камеры. Центр LED вдоль оптической оси глаза. Камера будет немного от оси (как показано сверху глаз).
- Отрегулируйте расстояние от камеры от глаз, таким образом, чтобы максимально зрения камеры заполняется глазного яблока. Убедитесь, что уголках глаз (canthi) находятся на краях горизонтального представления.
- Подключите камеру к видео на основе глаз слежения системы обработки данных. Разделите сигнал на DVD-рекордер для захвата raw видео. Фокусируем камеру чтобы получить четкое изображение глаз. Позаботьтесь, чтобы штраф положение глаз в центре поля зрения камеры с помощью трех степеней линейного перестройки (x, y, z) обеспечены карданного.
- Обнаружить темный зрачок, установив порог и контраст, надлежащим образом используя программу, поставляемую с видео на основе глаз, системы слежения.
- С помощью мыши, щелкните на меню «Видео» и в разделе «Режим» выберите «Высокой точности» для захвата изображений в дискретизации 30 Гц (резолюция 640 пикселей x 480 линий). Также под «Видео», выберите «Темный ученик» для «Ученик типа» и «Эллипс (повернутый эллипс)» для «Метод сегментации ученик».
- В окне «EyeCamera» нажмите на значок «Ученик Поиск области перестройки» (небольшой вертикальный прямоугольник с точкой в центре). Используйте мышь, чтобы перетащить прямоугольник, ограничивающий область вокруг ученика. Избегайте темных областей, которые могут быть спутаны с учеником.
- В окне «Элементы управления» подтверждают, что для «Auto Image» и «позитивных-Lock порог-отслеживание» установлены флажки. Нажмите на «Auto-порог» для оптимизации плотности сканирования, который покажет как зеленые точки на темный зрачок.
- Калибровка видео отображения видео на основе айтрекинга программы для вращений карданного 12,5 ° (+/-) вокруг горизонтальной оси и 10 ° (+/-) вокруг своей вертикальной оси.
- В окне «Элементы управления» щелкните «Отображение». Установите флажки под «Взгляд» и «СТИМ» для «Взглядом точка», «Calib региона» и «Геометрическая сетка». После проверки поля в группе «Геометрическая сетка», окно будет всплывающее и сказать, «стимул отображения геометрии должен измеряться до геометрии сетки могут отображаться. Вы хотите сделать это сейчас?» Выберите «Y» для да.
- С помощью мыши, щелкните на меню «Окна» и выберите «Стимул». Пересечение вертикальной и горизонтальной линии в центре дисплея откроется окно «Стимул». Измерение длины линии к ближайшей мм. Нажмите клавишу «Esc» на клавиатуре, чтобы закрыть окно «Стимул».
- С помощью мыши, щелкните на меню «Стимул» и выберите пункт «геометрия». Введите длину линий, которые только что были измерены. Отрегулируйте расстояние просмотра, так что линии градуса равна 25 ° для горизонтальной линии и 20 ° для вертикальной линии. Нажмите на кнопку «Store» и закрыть окно.
- В окне «EyeSpace» выберите количество калибровочных «Точки данных» быть «9». С глаз turtle's расположен в центре нажмите на центр данных точки и нажмите кнопку «Вновь представить».
Примечание: Откроется окно «Стимул», и «Get Ready» появится в центре экрана. Коробка появится на участке и затем исчезнет. О его исчезновении «Стимул» окно будет закрыто. Центральное положение теперь должен быть откалиброван. - Повторите процедуру, вращая карданного вправо/влево, + 12,5 ° / -12.5 ° и вверх/вниз + 10 /-10 ° для калибровки оставшихся точек данных.
- Для калибровки при кручении вращение, используйте шаблон фитинг алгоритм с видео на основе глаз слежения программы. Алгоритм устанавливает нулевой позиции, основанной на маркировку радужки и вычисляет угол поворота, когда маркировка стали смещение от центроида ученика.
- С помощью указателя мыши, щелкните на меню «Окна» и выберите «Скручивание». Нажмите кнопку «Пуск» в окне «Скручивание». В окне «EyeCamera» дуга будет отображаться над изображением глаза.
- Отрегулируйте радиус, угол и длина дуги с помощью ползунков в месте, где присутствуют неправильные маркировки в радужной оболочке. Установите флажки для «Графики реального времени» и «Auto-набор после настройки». При необходимости отрегулируйте яркость и контрастность в элементы управления окна и ре порог темный зрачок (см. шаг 4). Нажмите кнопку «Задать шаблон».
- Разместите линейку в одной фокальной плоскости как ученик и записывать ширину полный камеры обзора. Значение будет использоваться позднее для определения фактической ширины зрачка.
5. позиционирование электрода всасывания на черепно-мозгового нерва вызывает движения глаз
- Осторожно поместите электрод сравнения ПИН в соединительной или мышечной ткани, оставшиеся на голове.
- Место всасывания электрода (см. Таблицу материалы) на черепных нервов с использованием микроманипулятор и рассечение области установлен на бум. Используйте источник света оптического волокна для просмотра и указания размещения.
- Совпадает с размером нерва на кончике капиллярные стеклянные. Методом проб и ошибок необходима для получения наилучшего вокруг диаметр нерва (см. шаг 1.2 размер рекомендаций). Поместите кончик стекла на всасывания электрода. Залейте раствор Рингера всасывания электрода и отрегулировать громкость внутри шприца примерно половину своих возможностей.
- Осторожно переместите кончик стекла электрод, используя микроманипулятор для позиции выше вырезать конец выбранного нерва. Убедитесь, что раствор Рингера заполняет черепной коробки и кончик ниже его поверхности. При необходимости, используйте глина моделирования для дам до места, где раствор Рингера протекает из черепной коробки.
- Тяните обратно на поршень шприца.
Примечание: Вакуум привлечет нерва в конце кончика капилляров. Хорошо подходят обозначается нерва, оставаясь в рамках кончик с мало или вообще не дополнительных вакуум применяется.
6. стимуляция черепных нервов и анализа движения глаз
- Использование общего назначения нерва/мышцы стимулятор с текущего устройства изоляции (см. Таблицу материалы) для стимулирования черепных нервов через всасывающий электрода.
- Подключите всасывания электрода к текущему устройству изоляции с помощью кабеля. Подключите провод от электрод сравнения штырь заземления устройства изоляции.
- Выберите параметры течений, используя циферблатов и переключателей на устройстве изоляции и стимулятор. Используйте диапазон токов от 1 до 100 мкА, с частотой от 10 до 400 Гц. Использование 1 - или 2-ms импульсов в поездах прочного 100, 500 или 1000 мс.
- Запись времени стимуляцию.
Примечание: Транзистор транзистор логика (ТТЛ) импульсы синхронизированы с поставки токи от стимулятор и общаться в режиме реального времени через кабель для входных каналов видео на основе глаза, системы слежения. Программный модуль обеспечены на основе видео глаз отслеживания программы управления коммуникационных.- Для визуализации времени текущих приложений и их влияние на движения глаз, щелкните на меню «PenPlots». Выберите «X взгляд позиция», «Позиция Y взглядом», «Скручивание» и «Ученик ширина» Показать реального времени необработанных данных участков для X и Y глаз позиции, кручения и ширина зрачка. Также выберите «Маркеры & секунд» из меню «PenPlots», чтобы показать время участок с делениями, которые появляются промежутки 1 s.
Примечание: Большой буквы «T» появится маркировки начала TTL импульсов, происходящих одновременно с текущим приложением. - Для хранения данных движений глаз, вызванных токами, щелкните на меню «Файл» и выберите «Новый файл данных» в разделе «Данные». Введите имя файла и нажмите кнопку «Enter». Сохранение данных может быть приостановлена и затем заново, используя комбинацию клавиш «Ctrl» + «p». Когда экспериментальная сессия завершится, выберите «Закрыть файл данных» меню «Файл» в разделе «Данные».
- Помогает отслеживать типа токов применяется, щелкните на меню «Окна» и выберите «Панель данных». Появится окно «Клавиатура/DataMarker». Нажмите на букву или цифру для определения параметров текущего стимуляцию, доставляются на нерв.
Примечание: например, «X» может стоять для 10 µA. нажав на «X» хранит его вступления в файл данных в режиме реального времени для пост Специального анализа. Он также появляется на «PenPlot» на «Секунд & маркеры» для постоянного наблюдения.
- Для визуализации времени текущих приложений и их влияние на движения глаз, щелкните на меню «PenPlots». Выберите «X взгляд позиция», «Позиция Y взглядом», «Скручивание» и «Ученик ширина» Показать реального времени необработанных данных участков для X и Y глаз позиции, кручения и ширина зрачка. Также выберите «Маркеры & секунд» из меню «PenPlots», чтобы показать время участок с делениями, которые появляются промежутки 1 s.
- Анализировать данные из системы отслеживания глаз.
- Откройте файл сохраненных данных, который находится в формате текста с разделителями, в программу распространения листа выбора для того чтобы организовать данные и провести статистический анализ.
- Преобразование значения ширины зрачка, хранящиеся в файле реальные размеры в мм.
- Преобразование значений X и Y глаз позиции и скручиваний единиц степени и использовать конвенций для описания движения глаз; Таким образом положительные направления вращений: intorsion, высота и отведения; и отрицательного направления вращений: похищения, вымогательство и депрессии.
- Скопируйте данные заголовка на новый лист. Это будет включать значения для размера экрана (ширина и высота) и дистанции просмотра. Восемь столбцов данных, собранных в размере 30 Гц будет следовать ниже информации заголовка.
- Вернуться на лист, содержащий необработанные данные. Сделайте «Найти» для «X» в последней колонке под названием «Маркер», чтобы найти где стимуляции была применена с 10 µA. найти число «T», положив начало текущего стимуляции. Копирование 15 строк (0.5 s) данных, происходящих перед «T» и 90 кадров после «T» (3.0 s); то есть, всего 3,5 s. Вставьте данные в новый лист ниже информации заголовка.
- Вставьте пустой столбец после «PupilWidth». В пустой столбец преобразуйте в калиброванных размеры в мм:
Диаметр зрачка горизонтальных = × измерения ширины камеры вид «PupilWidth» - Вставка 2 пустые столбцы после «X_Gaze» и «Y_Gaze». Нормализовать позиции в размеры экрана просмотра: координаты (0, 0) в верхней левой части расширения экрана в (1, 1) в правом нижнем углу. В первом пустом столбце, перевод позиции к наличию системы координат (0, 0) в центре экрана. Включите преобразование в размеры экрана в мм:
X = (0.5 × ширина) – («X_Gaze» × ширина); Y = (0.5 × высота) – («Y_Gaze» × высота)
Примечание: Последовательность операции является для левого глаза. Последовательности должны быть отменено для правого глаза для того, чтобы следовать Конвенции негатива для похищения и позитивность для отведения. - В втором столбцах используйте тригонометрические функции для преобразования углов поворота (°):
Горизонтальное вращение = arctan (X/viewing расстояние); вертикальное вращение = arctan (расстояниеY/viewing) - Кручения уже отображается в единицах градусов, но чтобы соответствовать Конвенции позитивность для intorsion, если измерение производится на левый глаз, умножить на -1. Для правого глаза не умножение является необходимым. Программа коды вращение по часовой стрелке как позитивные.
- Участок диаметром зрачка и ротации как функцию от времени.
- Откройте файл сохраненных данных, который находится в формате текста с разделителями, в программу распространения листа выбора для того чтобы организовать данные и провести статистический анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает кадры изображения взяты из видео, описывающих рассечение. Изображения обеспечивают типичные места нервов до резки от мозга.
Рисунок 1: кадры изображения, снятые на видео вскрытие Показать места зрительного нерва (НИИ), глазодвигательного нерва (НИИИ), Блоковый нерв (nIV) и отводящего нерва (НвИ). (A) изображения с меткой областей мозга после удаления серозным. Белые шкалы бар = 10 mm. (B) изображение показывает расположение НИИ, НИИИ и Нив где они подключаются к правой мозга (после удаления обонятельные луковицы и головного мозга). (C) изображение показывает расположение НвИ где он подключается к левой стороне ствола мозга (после удаления мозга). Белой пунктирной линии рисуются вокруг нервы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 показывает среднее изменение в ученик диаметр происходит после стимулирования НИИИ. Хотя внешняя глаз движения также наблюдаются, которые меняют расположение ученика, мера действия зрачка сфинктера радужки остается надежным. Меры из одной подготовки и показать типичные изменчивость ответы на неоднократные текущего стимуляцию. Значит, диаметр зрачка уменьшается от 1,95 ± 0,01 мм до 1,60 ± 0,01 мм. Узкие стандартное отклонение указывает успешное fit электрода на нерв. При измерении среди различных препаратов (N = 5), типичная вариабельность составляет ± 0,08 мм. Хотя еще относительно узкая, значение примерно в восемь раз больше, чем изменчивость, наблюдаемых с одной подготовки.
Рисунок 2: пример сужения зрачка, вызывали путем стимулирования глазодвигательного нерва (НИИИ) в целом руководитель подготовки. Черный след означает ученик диаметр (PD) от шести стимуляцию в один препарат, и пунктирные линии показывают отклонение ± (SD). Прямоугольный сигнал на оси x обозначает начало и смещение 100Гц поезд 1-мс импульсов с амплитудой 50 МКА. Эскиз в нижнем левом углу показывает ориентацию линии Ирис в глаз до стимуляции, и изображения внизу показывают еще кадры из представительного судебного разбирательства (A), в (B) и после стимуляции (C). Белые шкалы бар = 1 мм. Эта цифра была перепечатана с разрешения33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Меры ученик ответов не требуют калибровки глаз вращений; Однако если измерения внешних движений, размещение головы в карданного должно быть тщательно сделано чтобы позволить сравнения среди препаратов (рис. 3). Когда голова помещается в карданного с дорсальной поверхности черепа параллельно с горизонтом, Ирис линия смещается от горизонта к ноздрю. 3D рисунок показывает типичный смещение (28.6 °) в препарате. Для трех различных препаратов среднее смещение составила 30,1 ± 9.0°. Угол смещения в пределах стандартное отклонение указывает, что приемлемым вписываются в карданного.
Рисунок 3: изолированные черепаха голова подготовки, дислоцированные в карданного. (A) регион белый прямоугольник показывает расположение голову черепахи в фотографии оборудования установки. (B) Magnified вид белого прямоугольника (семь раз). Пунктирная белая линия рисуется на изображении ноздрю центр зрачка и уровень с горизонтом. Сплошной белой линией накладывается и параллельно линии Ирис. (C) мультфильм в левой части головы. (D) изображение глаза, захваченные камерой видео на основе глаз, системы слежения. Бар черная шкала: 5 мм B; 1 мм в час. Эта цифра была изменена с разрешения32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 показывает среднее вращений глаз от десяти препаратов, вызываемые стимуляции Нив, собирается превосходной косой мышцы. Типичный пик вращений для intorsion, высота и похищения (в ответ на 70 МКА, оранжевый трассировки) являются 10,0 ± 5.7°, 2.8 ± 1,2 ° и 3.0 ± 2,1 ° соответственно. Величинами измеренных вращений в одном подготовке неоднократные стимуляцию похожи, но с менее изменчивость (например, N = 5), 14,8 ± 1,0 ° intorsion, 3,2 ± 0,2 ° фасада и 2.4 ± 0,2 ° для похищения. Шаблон изменчивости среди различных препаратов, по сравнению с одной подготовки сопоставимых (в рамках одной логарифмическая единица) на то, что характерно для мер ученик изменений: 6 раз больше для intorsion и возвышения, 11 раз больше для похищение.
Рисунок 4: означает глаз вращений, вызывали после стимулирования левой Блоковый нерв (nIV) с поезда 100 Гц 500-ms 2 мс импульсов в 10 препаратов (шесть применяется к левой стороне и 4 применяется к правой стороне, пять испытаний, измеренная для каждого). Прямоугольный сигнал на оси участка нижней обозначает сроки стимула. Ответы от левого и правого глаза были не значительно отличаются друг от друга. Intorsion сопровождали фасада и похищения (см. вышележащих мультфильм лобового считает, черепаха, чьи стрелки суммировать компонентов движения глаз). Амплитуда движения глаз примерно соответствует семи текущего амплитуд, применяется к nIV (см. код в окне Легенда). Эта цифра была перепечатана с разрешения32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В отличие от nIV, который идет только до превосходной косой мышцы, НИИИ и НвИ иннервируют несколько мышц, поэтому движения являются более сложными для интерпретации. Результирующая глаз движения зависит набираются какие двигательных единиц (рис. 5) (см. обсуждение). Следовательно изменчивость от подготовки к подготовке может стать значительным. К примеру НвИ вызывает intorsion, высота и похищения (рис. 5 c). Похищение, вероятно от двигательных единиц, поощрение действий боковые прямая; Высота и Intorsion вместо результатом других двигательных единиц, идти к цели, например bulbi втягивающего устройства или мигательная мембраны.
Рисунок 5: означает ответы движения глаз, вызывали путем стимулирования три черепных нервов с 10-, 50-, 100- и 400-Гц поезда в четырех препаратов. Все поезда стимул в 500 мс продолжительность, состоящий из 2 мс импульсов с амплитудой 70 МКА, значение выше порога. Движения глаз отображаются как и прежде, с колоннами В–C показаны ответы на стимуляции НИИИ, Нив и nVI, соответственно. Эта цифра была перепечатана с разрешения32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Потому что НИИИ иннервирует несколько целей (Улучшенный прямая, Нижняя прямая, Нижняя косая, медиальная прямая и сфинктер зрачка), анализ движения вызвали являются наиболее сложным. Для пример, показанный на рисунке 5Авымогательство, отведения и высота происходит. Основываясь на этом, разумное толкование является то, что действия главным образом из Нижний косой с возможным вкладом медиальная прямая. Улучшенный влагалища прямой мышцы живота и Нижняя прямая может отменять друг друга. Выше изменчивость действий для НИИИ вероятно, проистекает из более ветвления нерва и место пропила для установки электродов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги:
Важнейшие шаги в рамках этого протокола являются следующие: 1) вскрытие и бережно сохранить жизнеспособность пересекал нервов; 2) соответствие размеров путем всасывания электродов черепных нервов для обеспечения последовательного реагирования; и 3) размещение в голову в карданного предоставлять адекватные калибровки вращений глаза.
Устранение неполадок:
Вскрытие может быть сложным, но после его завершения в несколько раз, шаги должны стать довольно прямо вперед. Если нервы не отвечают, наиболее вероятной причиной является сбой диссекции. Во время удаления мозга только минимальные напряженности и давления должны применяться к нервы во время их резки. Касаясь нервы с металлическим хирургических инструментов следует также избегать как можно больше, и поэтому крючки стеклянные и пластиковые щипцы может заменить для металлических инструментов если проблемы сохраняются34. Хотя черепаха ткани имеют возможность выжить переменной уровня кислорода, использования свежеприготовленный раствор Рингера черепаха кипела с 95/5% O2/CO2 и охлажденные желательно; Однако это менее важно. В конце концов преимущество использования подготовки является живучести под различные уровни кислорода и температура колебания2,3,4,35. Более важным является периодического орошения подготовки с черепахой раствор Рингера, чтобы избежать высыхания ткани.
Сделать набор советов различных размеров для всасывания электрода до начала проведения эксперимента улучшит шансы хорошо подходят для нерва. Подобно рассечение, огонь, шлифовальные советы требует некоторой практики. Сохраняя голову с нервы от предварительного эксперимента и использование его в качестве ссылки при внесении советы могут помочь. Организация советы от малого до большого диаметра размера и хранить их на некоторых глина моделирования позволяет для быстрой установки во время эксперимента. Для меньших советы требуется больше времени, подвижной советы в пламя. Советы должны быть без трещин и обладают гладкой края, чтобы обеспечить хорошее уплотнение на нерв.
Ориентация в голову в карданного должен быть адекватным. Если нет, то будет перекос оси измерения. Например поворот на право, это больше, чем же шаг влево, означает, что центр глаз смещается и должен быть смещен вправо. Некоторые проблемы также может произойти в поддержании надежный сигнал от ученика во время вращения. Регулировка подсветки ученика, инфракрасный светодиод слегка может помочь достичь лучших результатов.
Ограничения:
Недостаток подготовки является трудность в определении кинематики действий конкретных мышц. Это особенно верно для движений, измеренная после стимуляции НИИИ и НвИ. Одним из способов устранения действия отдельных мышц является сделать систематическое transections нервных ветвей с целью изолировать путь путешествия в частности мышцы. Например мы добились успеха в резки НИИИ дистальнее цилиарной ганглиев и стимулирования короткие ресничного нерва изолировать действия сфинктер зрачка33,36. Другой подход заключается в том, чтобы смонтировать систему Тензодатчики на агонистов и антагонистов мышцы и затем соответствуют движения с деятельностью конкретных мышц37,38 . Для этого метода изоляции пути путешествия в конкретных мышц, не будет необходимости.
Подготовка также позволяет для пассивного растяжения, связанные с вязко упругие элементы, действуя в противоположных направлениях на соответствующие мышцы (например, боковые прямая против медиальная прямая мышцы, или сфинктера расширитель против сфинктер зрачка )39. Чтобы разобрать вязко упругие элементы, ответы, полученные путем стимулирования пересекал нервы, как описано здесь можно сравнить с результатами, полученными с помощью подготовки, в котором спарринг подкорковых областей и мозжечка; Поэтому это сохраняет функциональные нейронных интеграторы нетронутыми, и затем это позволяет стимулировать один мотонейрон областей внутри ствола мозга, иннервирующих каждой мышцы40.
Значение в отношении других позвоночных модели:
Хотя cryoanesthesia является приемлемым для черепах, этот подход не может быть утвержден с работой в теплокровных животных41,42. Таким образом необходим фармакологических агентов Пентобарбитал или кетамина. Агенты, однако, смешивать движений глаз43. Тем не менее подход полезен для рептилий и может применяться к другими глазами сбоку не mammalians, например амфибий и рыб44,45, потому что она позволяет, сравнение поведения, порожденных изолированных эфферентной нейронных путь для тех, кто сделал нетронутыми животных32,33.
Будущих приложений:
Подготовка может служить assay для нервной ткани живучести. Протокол может быть разработана для систематического рассмотрения, как различные факторы влияют на движения глаз. Подходы могут быть как просто как тестирование различных температурах или фармакологических агентов, включая анальгетиков. Потому что движения более сложно для интерпретации НИИИ и НвИ, их использование является более ограниченной. Таким образом nIV, вероятно, будет лучшим выбором для манипуляции.
Однако для устранения отдельных мышц кинематики полученный от стимулирования НИИИ и nVI, модификация подготовки необходимо, как систематическое перерезка ветвей нервов или включая тензодатчиков на целевых мышц наборов. И наконец, измерения ответы в подготовке, где сохранились нейронных интеграторы позволило бы определение как вязко эластичных элементов может возможно ограничения количественной кинематики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят г-жи Полетт Мак-Кенна и Лиза Pezzino в этом исследовании для секретариатской поддержки и г-н Фил Ауэрбах для технической поддержки. Авторы также поблагодарить Drs. Майкл Ариэль и Майкл S. Джонс (Сент-Луиса школа медицины при университете) за представление нам подготовить в vitro изолированные головы. Финансирование для поддержки этого сотрудничества было предоставлено кафедра биологии (Роберт S. Чейз фонд), академический научно-исследовательского комитета и программе нейробиологии в Лафайет колледже. Наконец эта работа посвящена г-н Фил Auerbach, который скончался 28 сентября 2016 гг.; он выведен сканирующий электронный микроскоп и признала полезность его стадии 5-оси для использования в настоящем Протоколе. Значительно будет недоставать его дружбе и находчивость.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
