Summary
Det här protokollet beskriver hur du använder en in vitro- isolerade sköldpaddan huvud förberedelse för att mäta kinematik av deras ögonrörelser. Efter avlägsnande av hjärnan från kraniet, kan kranialnerver stimuleras med strömmar att kvantifiera rotationer av ögat och förändringar i elev storlekar.
Abstract
När djur är euthanized, börja sina vävnader dö. Sköldpaddorna erbjuda en fördel på grund av en längre överlevnadstid av deras vävnader, särskilt jämfört med varmblodiga ryggradsdjur. På grund av detta, kan in vitro- experiment i turtles utföras för längre tid att undersöka de neurala signalerna och kontroll av deras målinriktade åtgärder. Använda en isolerad huvud förberedelse, Vi mätte kinematik av ögonrörelser i turtles och sin modulering av elektriska signaler bärs av kranialnerver. Efter hjärnan togs bort från skallen, placerades lämnar kranialnerver intakt, dissekerade huvudet i en gimbal kalibrera ögonrörelser. Glaselektroderna bifogades kranialnerver (ögonmuskelförlamningar, trochlear, och abducens) och stimuleras med strömmar att framkalla ögonrörelser. Vi övervakas ögonrörelser med en infraröd video tracking system och kvantifierade rotationer av ögonen. Ström pulser med en rad amplituder, frekvenser, och tåg varaktigheter användes att iaktta effekterna på svaren. Eftersom preparatet är skild från hjärnan, kan efferent vägen kommer att muskel mål granskas isolerat att undersöka neurala signalering i avsaknad av centralt bearbetade sensorisk information.
Introduction
Motivet för att använda röd-eared reglaget sköldpaddor i elektrofysiologiska experiment:
Röd-eared reglaget sköldpaddor (Trachemys scripta elegans), anses vara en av världens värsta invasiva arter1 och kan indikera att ett ekosystem är i trubbel. Anledningen till röd-eared reglaget sköldpaddor är så framgångsrika är dåligt känd, men det kan delvis bero på deras toleranta fysiologi och innehav av nervvävnader som kan överleva under hypoxisk villkor2,3,4 . Använda dem för experimenterande hotar inte deras antal och med minimala ansträngningar, elektrofysiologiska preparat kan förbli livskraftig över utökade löptider, så länge som 18 timmar5,6. Fördelen är liknande att fördelen med att använda ryggradslösa djur såsom kräftor7, som också har förmågan att tåla låga nivåer av syre8.
Tekniker för att mäta ögonrörelser:
Metoder att mäta ögonrörelser i frontal-eyed djur med icke-mänskliga primater har varit väl utvecklat9. Ögat roterar i omloppsbana kring tre axlar: horisontell, vertikal och torsional. Magnetisk spole sökmetod anses allmänt vara den mest tillförlitliga för mäta rotationer, men är invasiv, som kräver små spolar ska infogas i scleras djur10,11. Video-baserade system kan också mäta rotationer och har fördelen att vara icke-invasiv. Utvecklingen av bättre kameror tillsammans med innovativa bildbehandling har förbättrat deras funktionalitet att göra video-baserade system ett attraktivt alternativ att överväga12,13,14.
De tekniker som utvecklats för att mäta ögonrörelser i nonmammals har varit mycket mindre betydande. Åtgärder är antingen låg upplösning eller beskriver endast några av rotationer15,16,17,18. Avsaknaden av utveckling kan delvis skyllas på svårigheten att utbildning nonmammals att följa visuella mål. Även om ögonrörelser har studerats väl i rött-eared reglaget sköldpaddorna19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, på grund av utmaningen i utbildning djur att spåra mål, deras ögonrörelser exakt kinematik är dåligt förstås.
Röd-eared reglaget sköldpaddorna anses i allmänhet lateral-eyed ryggradsdjur, men eftersom de kan fullt flexa sina huvuden i sina skal31, betydande ocklusion av de laterala visuella fält av ryggskölden sker32. Resultatet är att deras visuella siktlinje tvingas mot fronten, vilket gör dem beter sig mer som frontal-eyed däggdjur. Därför, deras användning som en modell för att utveckla metoder för att mäta ögonrörelser erbjuder också ett unikt evolutionära perspektiv.
Protokollet beskrivs i detta arbete använder en in vitro- isolerade huvud förberedelse för att identifiera ögonrörelser i rött-eared reglaget turtles kinematik. Hjärnor är dissekerade från skallar lämnar kranialnerver intakt. Huvuden placeras en gimbal att kalibrera ögonrörelser och framkalla Svaren genom elektrisk stimulering av de kranialnerver innervating ögonmusklerna. Åtgärder av rotationer av ögonen görs av en video-baserade system, använder programvarualgoritmer, som spårar mörka pupillen och märkningarna av iris. Preparatet ger möjlighet att mäta kinematik av båda extraocular (dvs, horisontella, vertikala och torsional rotationer)32 och intraokulära (dvs, elev ändringar)33 rörelser.
Modellsystem för analys av utåtledande nervbanor:
Mer allmänt ger metoden utredarna möjlighet att studera hur efferenta neurala signaler generera ögonrörelser när musklerna börjar från deras avslappnad stater och i avsaknad av integrerade sensorisk information bearbetas av hjärnan32, 33. Därför kan ögat kinematik undersökas i modellsystem där de behandlas enbart av den efferenta neurala vägen lämnar hjärnan och synapsing på musklerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Röd-eared reglaget sköldpaddor, både manliga och kvinnliga, köptes från en leverantör. Sköldpaddorna var inrymt i en varm djur suite som innehåller två 60-gallon badkar utrustat med tegel öar för sunning under 250-W infraröd ljus. Miljön bibehölls på en 14/10-h ljus/mörk cykel med vattentemperaturen på 22 ° C. Lamporna var aktiverad vid 06:00 och avstängd kl 8:00 pm. Stridsvagnar utrustade med filtersystem rengjordes varje vecka, och sköldpaddorna matades ad libitum varannan dag. Vård av röd-eared reglaget sköldpaddor och alla de följande experimentella procedurer beskrivna här32,33 godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Lafayette College.
1. utrustning Setup
- Förbereda sköldpadda Ringers lösning. Lägg till följande destillerat vatten i denna ordning: natriumklorid 96,5 mM (58.44 g/mol), kaliumklorid 2.6 mM (74.56 g/mol), magnesiumklorid 2,0 mM (203.31 g/mol), natriumbikarbonat 31,5 mM (84.01 g/mol), dextros 20.0 mM (180.16 g/mol), koncentrerad saltsyra för att justera pH till 7,51 och kalciumklorid 4,0 mM (110.98 g/mol) (se Tabell för material). Blanda lösningen samtidigt lägga varje salt.
Varning: Koncentrerad HCl är farliga (hud, ögon, inandning och förtäring risker). - Se tips för sug elektroderna från 5-cm-lång kapillär glas (se Tabell för material), av brand-polering till olika storlekar av inre diameter för att tillgodose kranialnerver av varierande tjocklek.
- Använda en liten fil till etch en linje över en kapillär glasbit. Placera i mjukpapper och bryta i hälften.
- Långsamt rulla en av ändarna av kapillär glaset till lågan av en Bunsen-brännare. Med jämna mellanrum undersöka tipset för storlek, jämnhet och symmetri med en dissektion omfattning och en fiber optic light källa (se Tabell för material).
Obs: För sköldpaddor med huvudet bredder mellan 20 och 30 mm, optimal montering inre diameter storlek normalt varierar från 0,4 till 0,8 mm för ögonmuskelförlamningar nerv (nIII), 0,3 till 0,6 mm för den trochlear nerven (nIV) och 0,2 till 0,4 mm för den abducens nerven (nVI).
- Städa och organisera Rongeurs, en trubbig dissektion sond, microscissors, fin pincett, böjd pincett och en skalpell handtag med blad (se Tabell för material) för dissektion.
Obs: Sterilisering av instrument är valfritt.
2. anestesi och dödshjälp
- Plats sköldpaddan i en is hink för 60 min till cryoanesthetize det.
- Euthanize sköldpaddan genom halshuggning med hjälp av en liten djur giljotin (se Tabell för material).
- Försiktigt bända den animaliska öppen käftar med en liten väger spatel så att en krok kan införas och vände för att passa under spetsen på överkäken.
- Dra med stadigt tryck att förlänga djurets huvud genom giljotin. Snabbt halshugga djuret.
- Placera sköldpaddan huvud i en dissektion maträtt. Har tillräckligt sköldpadda Ringers lösning till hands för att vattna vävnaden. Syresätta lösningen med 95/5 O2tillpass2 (se Tabell för material).
- Upprätthålla vävnaden vid 4 ° C genom att placera is runt utsidan av skålen.
3. dissektion
- Använd dissektion omfånget med en fiber optic ljuskälla för att utföra dissektion.
- Ta bort den lägre käken. Placera en trubbig dissektion sond genom munnen att ge enklare hantering av huvudet. Skär den gemensamma ansluta bestod benet genom atlaskotan med en skalpell. Använda rongeurs för att dra underkäken från kraniet. Använd rongeurs för att dra bort hud och muskler från deras bilagor på de dorsala och laterala regionerna av kraniet.
- Ta bort ryggraden.
- Identifiera kotpelaren i kaudala slutet av kraniet. Böja ryggraden ventralt för att exponera ryggmärgen. Använd microscissors för att knipsa ryggmärgen. Använd rongeurs för att avlägsna ryggraden och annan vävnad från kraniet genom att dra caudally.
- Ta bort hjärnan från kraniet efter styckning kranialnerver.
- Börjar på foramen magnum, Använd rongeurs för att klippa två snitt på den dorsala kraniet. Kapningar ytliga att undvika att skada hjärnan under.
- Använd rongeurs för att försiktigt dra bort den dorsala kraniet. Använd microscissors för att ta bort meninx för att exponera resten av hjärnan. Ta bort tillräckligt meninx tills luktsinnet lampor, i främre hjärnskålen, kan identifieras (se figur 1A). Fortsätt att vattna hjärnan med turtle Ringers lösning, som behövs.
- Använda böjda pincetten för att försiktigt dra storhjärnan caudally och producera liten spänning på kranialnerver. Försiktigt skära bort och ta bort luktsinnet lökar och storhjärnan med böjd pincett.
- Använd microscissors för att försiktigt trycka mellanhjärnan mot mittlinjen att exponera kranialnerver; nIII, ca 0,6 mm, kan ses framför nIV, och diametern på nIV blir något mindre än nIII. Skär nIII och nIV där de fäster mellanhjärnan (se figur 1B). Upprepa på andra sidan.
- Skär vänster och höger synnerven (nII) med microscissors. Sedan luta hjärnstammen till ena sidan. Iaktta nVI framväxande från ventrala yta nära korsningen av pons och medulla (se figur 1 c); diametern av nVI är liten och cirka 0,3 mm. skär både på vänster och höger nVI.
- Ta bort de resterande delarna av hjärnstammen från sköldpaddan med fin pincett och microscissors. När kraniet är tom, undersöka hjärnskålen golvet. Identifiera nIII, nIV och nVI.
- Ta bort de övre och nedre ögonlock med fin pincett och microscissors.
4. kalibrering av ögonrörelser
- Använd en styv tabell (se Tabell för material) för att stödja placeringen av gimbal och andra instrument. Placera sköldpaddan huvud i gimbal chucken så att den dorsala ytan av huvudet är parallell till horisonten med hjälp av en liten bubbla-nivå vilar över skallen. Placera en av ögonen ungefär i mitten av gimbal's horisontella och vertikala rotationer.
- Placera den infraröda kameran, utrustad med en infraröd lysdiod (LED), som är en del av video-baserade ögat spårningssystem (se Tabell för material), på ett läsavstånd på ca 12 cm från turtle's eye.
- Vinkla kameran 45 grader ovanför siktlinjen i ögat. LED bör vara läge 11 klockan när man tittar på kameralinsen. Center LED längs den optiska axeln i ögat. Kameran kommer att vara något off axis (som tittade på ovanifrån ögat).
- Justera avståndet till kameran från ögat så att kameravyn är maximally fylld av ögongloben. Se till att hörnen av ögonen (canthi) vid kanterna av horisontella vyn.
- Anslut kameran till video-baserade ögat spårningssystem för att bearbeta data. Dela signalen till en DVD-inspelare att fånga raw video. Fokusera kameran för att få en tydlig bild av ögat. Ta hand till böter-position ögat i mitten av kameravyn med tre grader av linjär justering (x, y, z) medföljer med gimbal.
- Upptäcka mörka eleven genom att ställa in tröskelvärdet och kontrast på lämpligt sätt använda programmet medföljer video-baserade ögat spårningssystem.
- Med hjälp av musen, klicka på menyn ”Video” och under ”Mode” Välj ”högprecision” att ta bilder med en samplingsfrekvens på 30 Hz (beslutsamhet av 640 pixlar 480 linjer). Också under ”Video”, Välj ”mörka elev” för ”elev” och ”ellips (roterade ellips)” för ”elev segmentering metod”.
- I fönstret ”EyeCamera”, klicka på ikonen ”elev Sök området justering” (små vertikala rektangel med en prick i mitten). Använd musen för att dra ut en rektangel som begränsar ett område runt pupillen. Undvik mörka områden som skulle kunna förväxlas med eleven.
- I fönstret ”kontroller” bekräfta att kryssrutorna för ”Auto bild” och ”positiv-Lock tröskel-Tracking” kontrolleras. Klicka på ”Auto-tröskel” att optimera tätheten av scanning, som visas som gröna prickar över mörka eleven.
- Kalibrera video-visning av video-baserade ögat tracking program till rotationer av gimbal 12,5 ° (+/-) runt längs dess horisontella axel och 10 ° (+/-) kring sin vertikala axel.
- Klicka på ”Display” i fönstret ”kontroller”. Markera kryssrutorna under både ”blick” och ”Stim” för ”blicka Point”, ”kalibrera Region” och ”geometri Grid”. Efter att i rutorna under ”geometri Grid”, ett fönster dyker upp och säger, ”stimulus display geometri skall mätas innan rutnätet geometri kan visas. Vill du göra detta nu ”? Välj ”Y” för Ja.
- Med hjälp av musen, klicka på ”Windows”-menyn och välj ”stimulans”. Fönstret ”stimulans” öppnas visar en vertikal och horisontell linje passage i mitten av displayen. Mäta längder av ledningarna till den närmaste mm. tryck ”Esc” på tangentbordet för att stänga fönstret ”stimulans”.
- Med hjälp av musen, klicka på menyn ”stimulans” och ”geometri inställningar”. Mata in längderna av rader som mättes bara. Justera läsavstånd så att grader/linjen motsvarar 25 ° för den vågräta linjen och 20 ° för den vertikala linjen. Klicka på knappen ”Store” och Stäng fönstret.
- Välj antalet kalibrering ”Data Point” att vara ”9” i fönstret ”EyeSpace”. Med sköldpaddan ögat placerad i mitten, klicka på centrera data peka och klicka på knappen ”nytt lägga fram”.
Obs: Öppnas fönstret ”stimulans”, och ”Get Ready” visas i mitten av skärmen. En ruta visas på center plats och sedan försvinna. Dess försvinnande stänger fönstret ”stimulans”. Mittläget bör nu kalibreras. - Upprepa proceduren genom att rotera gimbal höger/vänster, 12,5 ° / -12,5 °, och upp/ner + 10 ° /-10 ° till kalibrera de resterande datapunkterna.
- För att kalibrera torsional rotation, Använd mallen passande algoritm som medföljde den video-baserade eyetracking program. Algoritmen anger en nollposition baserat på märkningar av iris och beräknar en Vridvinkel när markeringarna bli förskjuten från centroiden av eleven.
- Använda muspekaren, klicka på ”Windows”-menyn och välj ”vridning”. Klicka på knappen ”START” i fönstret ”vridning”. I ”EyeCamera”-fönstret visas en båge över bilden av ögat.
- Justera radien, vinkeln och längden på bågen med reglagen på en plats där det finns oregelbundna markeringar i iris. Markera kryssrutorna för ”realtid grafik” och ”Auto-Set efter adjust”. Om nödvändigt, justera ljusstyrka och kontrast i kontrollfönstret och re-tröskel mörka pupillen (se steg 4). Klicka på knappen ”mall”.
- Placera en linjal i samma fokalplan som eleven och spela in bredden på vyn full kamera. Värdet kommer att användas senare att fastställa faktiska bredd av eleven.
5. placering av sug elektrod på kranialnerv att framkalla ögonrörelser
- Placera försiktigt en pin referenselektrod i bindväv eller muskel vävnad kvar på huvudet.
- Placera sug elektroden (se Tabell för material) på kranialnerven använder ett micromanipulator och dissektion scope monterad på en bom. Använda en fiber optic ljuskälla för att visa och styra placeringen.
- Matcha storleken på en nerv till en kapillär glas spets. Trial and error är nödvändigt att få en bästa passform runt diametern av en nerv (se steg 1.2 för Storleksrekommendationer). Placera glas spetsen på sug elektroden. Fyll sug elektroden med Ringers lösning och justera volymen inom sprutan till ungefär hälften av sin kapacitet.
- Försiktigt flytta glas spetsen av elektroden med micromanipulator till en position ovanför cut-slutet av den valda nerven. Säkerställa att Ringers lösning fyller kraniet och spetsen är under dess yta. Om nödvändigt, använda modellering lera för att dämma upp platser där den Ringers lösning läcker ut ur kraniet.
- Dra tillbaka kolven i sprutan.
Obs: Vakuumet kommer att dra nerven i slutet av kapillär spetsen. En bra passform indikeras av nerv kvar inom spetsen med liten eller ingen ytterligare vakuum tillämpas.
6. stimulering av kranial nerv och analyser av ögonrörelser
- Använda en generell nerv/muskel-stimulator med en nuvarande isolering enhet (se Tabell för material) för att stimulera kranialnerven via sug elektroden.
- Anslutning sug elektroden till den nuvarande isolering med en kabel. Anslut sladden från pin referenselektroden till jordanslutningen av isolering enheten.
- Välj parametrar av strömmar med hjälp av rattarna och växlar på enhetens stimulator och isolering. Använd en rad strömmar från 1 till 100 µA, med frekvens av 10 till 400 Hz. Använd 1 - eller 2-ms pulser i tåg varar 100, 500 eller 1000 ms.
- Spela in tidpunkten för stimuli.
Obs: Transistor-transistor-logic (TTL) pulser synkroniseras med leveranserna av strömmar från stimulatorn och kommunicera i realtid via en kabel till ingående kanaler av video-baserade ögat spårningssystem. Programmodul som medföljde den video-baserade eyetracking programkontroller kommunikationen.- För att visualisera tidpunkten för de nuvarande tillämpningarna och deras inflytande på ögonrörelser, klicka på menyn ”PenPlots”. Välj ”X blicka Position”, ”Y blicka Position”, ”vridning” och ”elev bredd” att Visa realtid rådata tomter för X och Y eye positioner, vridning och elev bredd. Också välja ”sekunder & markörerna” från menyn ”PenPlots” att visa en timing tomt med skalstreck, som visas med 1 s intervall.
Obs: Stor bokstav ”T” visas märkning uppkomsten av TTL pulsen, som inträffar samtidigt med det aktuella programmet. - För att lagra datan av ögonrörelser frammanade genom strömmar, klicka på ”Arkiv”-menyn och välj ”ny datafil” under ”Data”. Mata in ett filnamn och tryck ”Enter”. Spara data kan pausas och sedan startas om med hjälp av kombination av nyckel kommandon, ”Ctrl” + ”p”. När en experimentell session är klar, Välj ”Stäng datafilen” av Arkiv-menyn under ”Data”.
- För att hålla koll på vilken typ av strömmar tillämpas, klicka på ”Windows”-menyn och välj ”Data Pad”. Fönstret ”knappsatsen/DataMarker” visas. Klicka på en bokstav eller ett nummer som identifierar parametrar för de aktuella stimuli som levereras till nerven.
Obs: till exempel ”X” kunde stå för 10 μA. Klicka på ”X” lagras dess inträde i datafilen i realtid för post hoc analys. Det visas också på den ”PenPlot” för ”sekunder & markörer” för pågående observation.
- För att visualisera tidpunkten för de nuvarande tillämpningarna och deras inflytande på ögonrörelser, klicka på menyn ”PenPlots”. Välj ”X blicka Position”, ”Y blicka Position”, ”vridning” och ”elev bredd” att Visa realtid rådata tomter för X och Y eye positioner, vridning och elev bredd. Också välja ”sekunder & markörerna” från menyn ”PenPlots” att visa en timing tomt med skalstreck, som visas med 1 s intervall.
- Analysera data från eye tracker systemet.
- Öppna sparade datafilen, som i ett avgränsat textformat, in en arket program av valet för att organisera data och utföra statistisk analys.
- Konvertera de elev bredd värden som lagras i filen till riktiga storlekar i mm.
- Konvertera värdena för X och Y eye positioner och torsions enheterna i examen och använda konventioner för att beskriva ögonrörelser; Därför positiva riktningarna rotationer: intorsion, höjd och adduktion; och negativa riktningar rotationer: utpressning, depression och bortförande.
- Kopiera informationen i huvudet på ett nytt kalkylblad. Detta inkluderar värden för skärmens storlek (bredd och höjd) och läsavstånd. Åtta kolumner med data som samlas in med en hastighet av 30 Hz kommer följa nedan rubrikinformation.
- Gå tillbaka till kalkylbladet som innehåller rådata. Gör en ”hitta” för ”X” i den sista kolumnen med titeln ”markör” för att hitta där stimulering applicerades med 10 μA. hitta incidensen av ”T”, markerar början av den nuvarande stimuleringen. Kopiera 15 rader (0,5 s) data som inträffat innan ”T” och 90 ramar efter ”T” (3.0 s); dvs, 3,5 s totalt. Klistra in data i det nya kalkylbladet nedan rubrikinformation.
- Infoga en tom kolumn efter ”PupilWidth”. I den tomma kolumnen, konvertera till dimensionen kalibrerad i mm:
Horisontella elev diameter = ”PupilWidth” × dimensionen av kameran Visa bredd - Infoga 2 tomma kolumner efter både ”X_Gaze” och ”Y_Gaze”. Normalisera positioner att måtten på bildskärm: koordinater (0, 0) längst upp till vänster på den skärm som sträcker sig till (1, 1) nere till höger. I den första tomma kolumnen, översätta positioner till ett koordinatsystem med (0, 0) i mitten av skärmen. Inkludera omvandlingen till måtten på skärmen i mm:
X = (0,5 × bredd) – (”X_Gaze” × bredd); Y = (0,5 × höjd) – (”Y_Gaze” × höjd)
Obs: Sekvensen av drift är för vänster öga. Sekvensen kommer att behöva vändas för höger öga för att följa konventionen av negativitet för bortförande och positivitet för adduktion. - I de andra kolumnerna, använda trigonometriska funktioner för att konvertera till vinklar (°) av rotation:
horisontell rotation = arctan (X/viewing avstånd), vertikal rotation = arctan (Y/viewing avstånd) - Torsion visas redan i enheter av grader, men för att uppfylla konventionen av positivitet för intorsion, om mätningen görs på vänster öga, multiplicera med -1. För höger öga är ingen multiplikation nödvändigt. Programmet koder medsols rotation som positivt.
- Rita elev diameter och rotationer som funktion av tiden.
- Öppna sparade datafilen, som i ett avgränsat textformat, in en arket program av valet för att organisera data och utföra statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar stillbilder av bilder tagna från en video som beskriver dissektion. Bilder ger typiska platser av nerver innan skära från hjärnan.
Figur 1: stillbilder av bilder tagna från video av dissektionen till Visa platser av synnerven (nII), ögonmuskelförlamningar nerv (nIII), trochlear nerv (nIV) och abducens nerv (nVI). (A) bild med märkta regioner av hjärnan efter avlägsnande av meninx. Vit skala bar = 10 mm. (B) bilden visar platsen för nII, nIII och nIV där de ansluter till höger sida av mellanhjärnan (efter avlägsnande av luktsinnet lökar och storhjärnan). (C) bild visar placeringen av nVI där den ansluter till vänster sida av hjärnstammen (efter avlägsnande av mellanhjärnan). Vita streckade linjer ritas runt nerverna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 visar den genomsnittliga förändringen i elev diameter som inträffar efter stimulerande nIII. Även om extrinsic ögonrörelser också observeras, som ändrar placeringen av eleven, fortfarande måttet på talan av den sphincter pupillae av iris tillförlitlig. Åtgärder från en beredning och visar typiska variationen i Svaren till upprepade nuvarande stimuli. Menar elev diameter minskas från 1,95 ± 0,01 mm till 1.60 ± 0,01 mm. Den smala standardavvikelsen anger ett lyckat anfall av elektroden till nerv. När man mäter bland olika preparat (N = 5), typisk variabilitet är ± 0,08 mm. Även om det är fortfarande relativt smala, är värdet ungefär åtta gånger större än det variabilitet som observerats från ett enda preparat.
Figur 2: exempel på elev sammandragning frammanas genom att stimulera ögonmuskelförlamningar nerv (nIII) i hela-head preparatet. Svart trace är genomsnittlig elev diametern (PD) från sex stimuli i en beredning och streckade linjer visar ± standardavvikelse (SD). Rektangulära vågformen på x-axeln betecknar uppkomsten och offset för en 100 Hz tåg 1-ms pulser med en amplitud på 50 μA. Skissen längst ned till vänster visar Orienteringen av raden iris i ögat innan stimulering, och bilderna längst ned visar fortfarande ramar från en representant rättegång (A), under (B), och efter stimulering (C). Vit skala bar = 1 mm. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse33. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Åtgärder av elev Svaren kräver inte kalibrering av ögat rotationer; dock om mäter extrinsic rörelser, måste placering av en gimbal huvudet noggrant göras för att möjliggöra jämförelser mellan olika preparat (figur 3). När huvudet är placerad i gimbal med den dorsala ytan av skallen parallellt med horisonten, är iris linjen förskjuten från horisonten mot näsborren. Figur 3D visar en typisk förskjutning (28,6 °) i en beredning. För tre olika preparat var medelvärdet offset 30,1 ± 9,0 °. En vinkel av offset inom standardavvikelsen anger godtagbar passar inom gimbal.
Figur 3: en isolerad sköldpaddan huvud förberedelse placerad i gimbal. (A) regionen av den vita rektangeln visar platsen för chefen sköldpadda i ett fotografi av utrustning. (B) förstorad bild av den vita rektangeln (sju gånger). Prickig vit linje ritas på bilden från näsborre till elev center och är i nivå med horisonten. En vit linje är överlagrade och parallella med linjen iris. (C) tecknad av den vänstra sidan av huvudet. (D) bilden av ögat fångas av kameran av video-baserade ögat spårningssystem. Svart skalstapeln: 5 mm i B; 1 mm i D. Denna siffra har modifierats med tillstånd32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 visar den genomsnittliga rotationer av ögonen från tio preparat frammanade genom stimulering av nIV ska den överlägsna sneda muskeln. Typiska topp rotationer för intorsion, höjd och bortförande (som svar till 70 µA, orange spår) är 10,0 ± 5,7 °, 2,8 ± 1,2 ° och 3,0 ± 2,1 ° respektive. Storheter mäts för rotationer i enda preparat att upprepade stimuli är liknande men med mindre variabilitet (t.ex., N = 5), 14,8 ± 1,0 ° för intorsion och 3,2 ± 0,2 ° höjd 2,4 ± 0,2 ° för bortförande. Mönstret av variabilitet mellan olika preparat jämfört med ett enda preparat är jämförbara (inom en logaritmisk enhet) till vad som observerats för åtgärder av elev förändringar: 6 gånger större för både intorsion och höjd, 11 gånger större för Abduktion.
Figur 4: menar ögat rotationer framkallat efter stimulera den vänstra trochlear nerven (nIV) med 500-ms 100 Hz tåg 2-ms pulser i 10 preparat (sex tillämpas på vänster sida och fyra tillämpas på höger sida, fem studier mäts för varje). Rektangulära vågformen på x-axeln i botten tomt betecknar timing av stimulans. Svaren från vänster och höger ögon var inte signifikant från varandra. Intorsion åtföljdes av höjd och bortförande (se överliggande tecknad av head-on beskådar av sköldpaddan, vars pilar sammanfatta delar av ögonrörelser). Öga rörelse amplituden motsvarar ungefär sju aktuella amplituderna tillämpas på nIV (se koden i legenden box). Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I motsats till nIV, som går bara till den överlägsna sneda muskeln, innerverar nIII och nVI flera muskler så rörelser är mer utmanande att tolka. Resulterande ögonrörelser beror på vilken motor enheter rekryteras (figur 5), (se diskussion). Variation från förberedelse till förberedelse kan följaktligen bli betydande. Till exempel frammanar nVI intorsion, höjd och bortförande (figur 5 c). Abduktion är sannolikt från de motoriska enheterna främjar effekten av den laterala rectus; intorsion och höjd istället resultera från andra motoriska enheter kommer att mål såsom de upprullningsdon bulbi eller nictitating membranet.
Figur 5: menar öga rörelse Svaren frammanas genom att stimulera tre kranialnerver med 10-, 50-, 100- och 400-Hz tåg i fyra beredningar. Alla stimulans tågen var 500 ms i varaktighet, bestående av 2-ms pulser med amplituden av 70 µA, ett värde över tröskeln. Ögonrörelser visas som tidigare, med kolumner A–C visar Svaren till stimulering av nIII, nIV och nVI, respektive. Denna siffra har varit omtryckt med tillåtelse32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Eftersom nIII innerverar flera mål (överlägsna rectus, sämre rectus, sämre sneda, mediala rectus och den sphincter pupillae), analys av evoked rörelser är de mest komplexa. För exemplet i figur 5A, inträffar utpressning, adduktion och höjd. Baserat på detta, är en rimlig tolkning att åtgärderna är mestadels från den underlägsna snett med eventuella bidrag från den mediala rectus. Överlägsna rectus och sämre rectus kan avbryta varandra. En högre variabilitet av åtgärder för nIII sannolikt härrör från den större förgrening av nerv och placeringen av snittet för montering elektroderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg:
Kritiska steg i detta protokoll är följande: 1) dissektion och den omsorg att upprätthålla lönsamheten för transected nerverna; (2) matchning av storlekar av sug elektroderna till kranialnerv att ge konsekventa svar; och 3) placeringen av huvudet i gimbal att tillhandahålla adekvat kalibrering av rotationer av ögat.
Felsökning:
Dissektion kan vara utmanande, men efter att ha avslutat det några gånger, stegen bör bli relativt rakt fram. Om nerverna visas icke-lyhörd, är den mest troliga orsaken ett misslyckande för dissekering. Under borttagningen av hjärnan bör endast minimala spänningar och tryck tillämpas på nerverna under sin skärning. Röra vid nerverna med metalliskt kirurgiska instrument bör också undvikas så mycket som möjligt och så glas krokar och plast pincett kan ersätta metall verktyg om problem kvarstår34. Även om turtle vävnader har förmåga att överleva variabla nivåer av syre, användning av nygjorda sköldpadda Ringers lösning bubblade med 95/5% O2tillpass2 och kylda är lämpligt; Detta är dock mindre kritiska. Fördelen med att använda preparatet är ju överlevnadsförmåga under varierande syrenivåer och temperatur växlingar2,3,4,35. Viktigare är regelbunden bevattning av preparatet med turtle Ringers lösning för att undvika uttorkning vävnaden.
Att göra en uppsättning tips av varierande storlek för sug elektroden i förväg genomföra ett experiment kommer att förbättra chanserna för en bra passform till nerv. Liknar dissektion, brand polering tips tar lite övning. Bevara ett huvud med nerver från ett tidigare experiment och använda det som referens medan att göra tips kan hjälpa. Att ordna tips från liten till stor diameter storlek och lagra dem på vissa modellering lera möjliggör snabb montering under ett experiment. För mindre tips krävs mer tid rullande tips i lågor. Tips bör vara fri från sprickor och äger jämna kanter som möjliggör en bra tätningen på nerven.
Orienteringen för gimbal huvudet måste vara tillräcklig. Om så inte är fallet, Axel mätningarna kommer att vara sned. En rotation till höger som är större än den samma ökningen åt vänster, anger exempelvis att mitten av ögat är förskjuten och behöver skiftas till höger. Vissa problem kan också uppstå i att upprätthålla en tillförlitlig signal från eleven under rotationer. Justera belysningen av eleven av den infraröda LED något kan bidra till att uppnå bättre resultat.
Begränsningar:
En brist av preparatet är svårigheten att identifiera kinematik åtgärder genom särskilda muskler. Detta är särskilt sant för rörelser mätt efter stimuli nIII och nVI. Ett sätt att lösa enskilda muskel åtgärder är att göra systematiska transections av nerve kontor för att isolera en väg som reser till en viss muskel. Exempelvis har vi varit framgångsrika i skärande nIII distalt ciliär ganglier och stimulera den korta ciliär nerven för att isolera effekten av den sphincter pupillae33,36. Ett annat tillvägagångssätt är att montera en töjningsmätaren system på både agonist och antagonist muskler och då motsvarar rörelser med verksamhet i specifika muskler37,38 . För denna metod, skulle isolering av en väg som reser till en specifik muskel inte vara nödvändigt.
Preparatet kan också för passiv stretching är associerad med viskoelastiskt element agerar i motsatt riktning på motsvarande muskler (t.ex., laterala rectus kontra mediala rectus muskler eller sphincter dilatator kontra sphincter pupillae )39. För att tolka ut viskoelastiskt element, kan de svar som erhållits genom stimulerande transected nerver som beskrivs här jämföras med dem som erhålls med hjälp av en beredning där subkortikala områdena och cerebellum är sparred; därför detta håller de funktionella neurala integratörer intakt, och då är det möjligt att stimulera enda motoneuron områden inom hjärnstammen innervating varje muskel40.
Betydelse när det gäller andra ryggradsdjur modeller:
Även om cryoanesthesia är acceptabel för sköldpaddor, inte kan detta tillvägagångssätt godkännas med arbete i varmblodiga djur41,42. En farmakologisk agent som pentobarbital eller ketamin är därför nödvändigt. Agenterna, förväxla dock ögat rörelser43. Dock metoden är användbar för reptiler och skulle kunna tillämpas på andra lateral-eyed icke-mammalians, såsom groddjur och fisk44,45, eftersom det tillåter jämförelse av beteenden som genereras av en isolerad efferenta neurala vägen till de som gjorts av en intakt djur32,33.
Framtida tillämpningar:
Preparatet kan fungera som ett test för nervvävnad överlevnadsförmåga. Ett protokoll kan utformas för att systematiskt ta itu med hur olika faktorer påverkar ögonrörelser. Metoder kan vara så enkelt som att testa olika temperaturer eller farmakologiska medel inklusive analgetika. Eftersom rörelser är svårare att tolka för nIII och nVI, är deras användning mer begränsad. NIV skulle därför troligen det bästa valet för manipulation.
Dock lös enskilda muskel kinematik resulterande från stimulerande nIII och nVI, modifiering av preparatet skulle vara nödvändigt, till exempel att göra en systematisk transection av grenar av nerver eller inklusive töjningsgivare på riktade muskel uppsättningar. Slutligen mäter svaren i en beredning där neurala integratörer hålls intakt skulle möjliggöra bestämning av hur viskoelastiskt element kunde möjligen vara begränsande kvantifieringar av kinematik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar fru Paulette McKenna och Lisa Pezzino i denna studie för sekreterarstöd och Mr Phil Auerbach för teknisk support. Författarna också tacka Drs. Michael Ariel och Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) för att införa oss till in vitro- isolerade huvud förberedelsen. Finansiering för att stödja detta samarbete lämnades av Institutionen för biologi (Robert S. Chase fonden), utskottet för akademisk forskning och programmet neurovetenskap vid Lafayette College. Slutligen, detta arbete är tillägnad Mr Phil Auerbach, som avled 28 September 2016. Han avvecklade ett svepelektronmikroskop och erkänd nyttan av sin 5-axlig steg för användning i detta protokoll. Hans vänskap och idérikedom kommer att missa mycket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
