Summary
Denne protokol beskriver hvordan man bruger en in vitro- isoleret turtle head forberedelse til måler kinematikken af deres øjenbevægelser. Efter fjernelse af hjernen fra kraniet, kan hjernenerver stimuleres med strøm til at kvantificere rotationer af øjet og ændringer i elev størrelser.
Abstract
Når dyrene er aflivet, begynder deres væv at dø. Skildpadder tilbyder en fordel på grund af en længere overlevelsestid af deres væv, især sammenlignet med varmblodede hvirveldyr. På grund af dette, kan in vitro- eksperimenter i skildpadder udføres for længere tid til at undersøge de neurale signaler og kontrol af deres målrettede aktioner. Ved hjælp af en isoleret hoved forberedelse, vi målte kinematik øje bevægelser i skildpadder, og deres graduering af elektriske signaler transporteres af hjernenerver. Efter at hjernen var fjernet fra kraniet, blev forlader hjernenerver intakt, dissekeret hovedet placeret i en kardan til at kalibrere øjenbevægelser. Glas elektroderne var knyttet til hjernenerver (oculomotor, trochlea, og abducens) og stimuleres med strøm til at fremmane øjenbevægelser. Vi overvågede øjenbevægelser med en infrarød video tracking system og kvantificerede rotationer af øjnene. Nuværende pulser med en vifte af amplituder, frekvenser, og tog varigheder blev brugt til at observere effekter på svar. Fordi præparatet er adskilt fra hjernen, kan den efferente pathway gonna muskel mål undersøges isoleret at undersøge neurale signaler i mangel af centralt forarbejdede sensorisk information.
Introduction
Begrundelse for at anvende Red-eared skyderen skildpadder i elektrofysiologiske eksperimenter:
Rød eared skyderen skildpadder (Trachemys scripta elegans), betragtes som en af verdens værste invasive arter1 og kan angive, at et økosystem er i problemer. Grunden hvorfor Rødøret lysbillede turtles er så vellykket er dårligt forstået, men det kan til dels skyldes deres tolerant fysiologi og besiddelse af nervøs væv, der kan overleve under hypoksiske betingelser2,3,4 . Brug dem til eksperimenter ikke truer deres numre og med minimal indsats, elektrofysiologiske præparater kan forblive levedygtige over udvidede varigheder, så længe 18 timer5,6. Fordelen er lignende til fordel for ved hjælp af hvirvelløse dyr såsom Krebs7, som også har evnen til at modstå lave niveauer af ilt8.
Teknikker til måling af øjenbevægelser:
Tilgange til at måle øjenbevægelser i frontal-eyed dyr ved hjælp af ikke-menneskelige primater har været veludviklet9. Øjet roterer i kredsløb omkring tre akser: vandret, lodret og deformation. Den magnetiske spolen søgemetode er generelt betragtes som den mest pålidelige for måling rotationer, men er invasiv, der kræver små bredbånd skal indsættes i scleras af dyr10,11. Video-baserede systemer kan også måle rotationer og har fordelen at være ikke-invasiv. Udviklingen af bedre kameraer sammen med innovative billedbehandling har forbedret deres funktionalitet at gøre video-baserede systemer et attraktivt alternativ til at overveje12,13,14.
De teknikker, der er udviklet til måling af øjenbevægelser i nonmammals har været langt mindre betydelig. Foranstaltninger er enten lav opløsning eller beskrive kun nogle af rotationer15,16,17,18. Manglende udvikling kan være delvist skylden på vanskelighederne med uddannelse nonmammals at følge visuelle mål. Selvom øjenbevægelser er blevet godt undersøgt i rød eared skyderen skildpadder19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, på grund af udfordringen i uddannelse dyr til at spore mål, den præcise kinematik af deres øjenbevægelser er dårligt forstået.
Rød eared skyderen skildpadder er generelt betragtes som lateral-eyed hvirveldyr, men fordi de kan fuldt trække deres hoveder ind i deres shell31, betydelig okklusion af de laterale visuelle felter af rygskjoldet opstår32. Resultatet er, at deres visuelle sigtelinie er tvunget mod fronten, hvilket gør dem opføre sig mere som frontal-eyed pattedyr. Derfor, deres anvendelse som en model for udvikling af metoder til måling af øjenbevægelser tilbyder også en unik evolutionært perspektiv.
Den protokol, der er beskrevet i dette værk bruger en in vitro- isoleret hoved forberedelse til at identificere kinematik af øjenbevægelser i rød eared skyderen skildpadder. Hjerner er dissekeret fra kranier forlader hjernenerver intakt. Hoveder er placeret i en kardan til at kalibrere øjenbevægelser og fremkalde reaktioner ved elektrisk stimulation af kranienerver innerverer øjet muskler. Foranstaltninger af rotationer af øjnene er udført af en video-baseret system, bruger Softwarealgoritmer, som spor den mørke elev og markeringer af iris. Forberedelse giver mulighed for at måle kinematik både ekstraokulær (dvs., vandrette, lodrette og torsions rotationer)32 og intraokulært (dvs., elev ændringer)33 bevægelser.
Modelsystem til analyse af efferente nervebaner:
Mere generelt giver tilgangen inspektørerne mulighed for at studere hvordan efferente neurale signaler generere øjenbevægelser når musklerne starter fra deres afslappet stater og i mangel af integrerede sensoriske oplysninger behandles af hjernen32, 33. Således, øjet kinematik kan undersøges i en modelsystem, hvor de behandles udelukkende af de efferente neurale pathway forlader hjernen og synapsing på musklerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Red-eared skyderen skildpadder, både mandlige og kvindelige, blev købt fra en kreditor. Skildpadder har været opstaldet i en varm animalske suite indeholder to 60-gallon bøtter udstyret med mursten øer for Sole under 250-W infrarødt lys. Miljøet blev opretholdt på et 14/10-h lys/mørke cyklus med vandtemperatur på 22 ° C. Lysene blev tændt kl 6:00 og slukket kl 8:00. Kampvogne udstyret med filtreringssystemer var rengøres ugentligt, og skildpadder blev fodret ad libitum hver anden dag. Pleje af red-eared skyderen skildpadder og alle de følgende eksperimentelle procedurer beskrives her32,33 blev godkendt af institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) på Lafayette College.
1. udstyr Setup
- Forberede skildpadde Ringers løsning. Tilføj følgende til destilleret vand i denne rækkefølge: natriumchlorid 96.5 mM (58.44 g/mol), kalium chloride 2,6 mM (74.56 g/mol), magnesiumchlorid 2,0 mM (203.31 g/mol), natriumbikarbonat 31,5 mM (84.01 g/mol), dextrose 20,0 mM (180.16 g/mol), koncentreret saltsyre til at justere pH 7,51 og calciumchlorid 4.0 mM (110.98 g/mol) (Se Tabel af materialer). Bland løsningen samtidig tilføjer hver salt.
Forsigtig: Koncentreret HCl er farlige (hud, øjne, indånding og indtagelse farer). - Få tips til at suge elektroder fra 5 cm lange kapillær glas (Se Tabel af materialer), ved brand-polering til forskellige størrelser af indre diameter for at rumme hjernenerver af varierende tykkelse.
- Bruge en lille fil til etch en linje på tværs af et stykke af kapillar glas. Sted i silkepapir og bryde i halve.
- Langsomt rulle en af enderne af kapillar glasset ind i flammen på en bunsenbrænder. Med jævne mellemrum undersøge tip til størrelse, glathed og symmetri ved hjælp af en dissektion anvendelsesområde og en fiberoptisk lys kilde (Se Tabel af materialer).
Bemærk: For skildpadder med hovedet bredder mellem 20 og 30 mm, optimal montering indvendig diameter størrelser typisk spænder fra 0,4 0,8 mm for den oculomotor nerven (nIII), 0,3 til 0,6 mm til trochlea nerve (nIV), og abducens nerve (nVI) 0,2 til 0,4 mm.
- Ren og organisere Rongeurs, en stump dissektion sonde, microscissors, fine pincet, buet pincet og en skalpel håndtag med vinger (Se Tabel af materialer) til dissektion.
Bemærk: Sterilisation af instrumenter er valgfri.
2. anæstesi og aktiv dødshjælp
- Sted skildpadde i en is spand for 60 min. til cryoanesthetize det.
- Aflive skildpadden ved halshugning ved hjælp af en lille dyr guillotine (Se Tabel af materialer).
- Forsigtigt lirke kæberne af det animalske åbne med en lille vejer spatel, således at en krog kan indsættes og forvandlet til at passe under spidsen af overkæben.
- Trække med konstant pres for at udvide dyrets hoved gennem guillotinen. Hurtigt Hug hovedet af dyret.
- Placer skildpadde hoved i en dissektion parabol. Har nok skildpadde Ringers løsning på hånden til at overrisle væv. Oxygenize løsning med 95/5 O2/CO2 (Se Tabel af materialer).
- Vedligeholde væv ved 4 ° C ved at placere is omkring ydersiden af skålen.
3. dissektion
- Brug dissektion anvendelsesområde med en fiber optic lyskilde til at udføre dissektion.
- Fjerne den nederste kæbe. Placer en stump dissektion sonde gennem munden til giver lettere håndtering af hovedet. Skær den fælles tilslutning den dentary knogle til kranium med en skalpel. Brug rongeurs til at trække den nederste kæbe fra kraniet. Brug rongeurs til at trække ud hud og muskler fra deres vedhæftede filer på de dorsale og laterale regioner af kraniet.
- Fjerne rygsøjlen.
- Identificere rygsøjlen i caudale slutningen af kraniet. Bøje rygsøjlen ventrally at eksponere rygmarven. Brug microscissors til at snip rygmarven. Brug rongeurs til at fjerne rygsøjlen og andre væv fra kraniet ved at trække caudally.
- Fjerne hjernen fra kraniet efter opskæring hjernenerver.
- Startende fra foramen magnum, brug rongeurs til at skære to snit på den dorsale kranium. Foretage nedskæringer overfladisk til at undgå at beskadige hjernen under.
- Brug rongeurs til at træk forsigtigt ned af den dorsale kranium. Brug microscissors til at fjerne hotellerne at eksponere resten af hjernen. Fjerne nok hotellerne, indtil de olfaktoriske pærer, i den forreste kraniehulen kan identificeres (Se figur 1A). Fortsætte med at overrisle hjernen med skildpadde Ringers løsning, når det er nødvendigt.
- Bruge buet pincet til at trække cerebrum caudally og producere mindre spænding på hjernenerver forsigtigt. Omhyggeligt skæres væk og fjerne de olfaktoriske pære og cerebrum med buet pincet.
- Bruge microscissors til at forsigtigt skubbe midthjernen mod midterlinjen at eksponere hjernenerver; nIII, ca. 0.6 mm, kan ses foran nIV, og diameteren af nIV vil være lidt mindre end nIII. Skær nIII og nIV hvor de tillægger midthjernen (Se figur 1B). Gentag dette på anden siden.
- Skære den venstre og højre synsnerven (nII) med microscissors. Derefter vippe hjernestammen til den ene side. Observere nVI nye fra den ventrale overflade nær krydset af pons og medulla (Se figur 1 c); nVI diameter er lille og ca 0.3 mm. skåret både den venstre og højre nVI.
- Fjern de resterende dele af hjernestammen fra skildpadden med fine pincet og microscissors. Når kraniet er tom, undersøge kraniehulen gulvet. Identificere nIII, nIV og nVI.
- Fjerne de øvre og nedre øjenlåg med fine pincet og microscissors.
4. kalibrering af øjenbevægelser
- Brug en stiv tabel (Se Tabel af materialer) til støtte for placeringen af kardan og andre instrumenter. Placer turtle head til kardan chuck, så den dorsale overflade af hovedet er parallelt med horisonten ved hjælp af en lille boble-niveau hviler på tværs af kraniet. Groft Placer et af øjnene i midten af den kardan vandrette og lodrette rotationer.
- Placer de infrarøde kamera, udstyret med en infrarød lysemitterende diode (LED), som er en del af den video-baserede eyetracking system (Se Tabel af materialer), i en synsafstand på ca 12 cm fra turtle's eye.
- Vinkel kameraet 45 grader ovenfor for synsvidde af øjet. LED'en bør på 11 klokken, når man ser på kameraets linse. Center LED langs den optiske akse på øjet. Kameraet vil være lidt off akse (som set fra oven i øjet).
- Justere afstanden mellem kameraet fra øjet, så kameravisningen er maksimalt fyldt af øjeæblet. Sikre, at hjørner af øjne (canthi) på kanten af den vandret visning.
- Tilslut kameraet til den video-baserede eyetracking system til at behandle data. Opdele signalet til en DVD-optager til at optage den rå video. Fokusere kameraet for at få et klart billede af øjet. Sørge for at bøde-position øjet på midten af den kameravisning ved hjælp af de tre grader af lineære justering (x, y, z) leveres med kardan.
- Opdage den mørke elev ved fastsættelsen af tærsklen og kontrast korrekt ved hjælp af programmet leveres med den video-baserede eye tracking system.
- Ved hjælp af musen, klik på "Video" i menuen og vælg "Høj præcision" til at tage billeder på en samplingfrekvens på 30 Hz (opløsning på 640 pixels x 480 linjer) under "Mode". Også under "Video", Vælg "Mørk elev" for "Elev Type" og "Ellipse (roteret ellipse)" for "Elev segmentering metode".
- Klik på ikonet "Elev søgning område justering" (lille lodret rektangel med en prik i midten) i vinduet "EyeCamera". Brug musen til at trække ud et rektangel, der begrænser et område omkring eleven. Undgå mørke områder, der kunne forveksles med eleven.
- I vinduet "Kontroller" bekræfte at bokse for "Auto billede" og "Positive-Lock tærskel-Tracking" er markeret. Klik på "Auto-tærskel" til at optimere tætheden af scanning, der vil vise som grønne prikker over mørke eleven.
- Kalibrere video-visning af video-baserede eyetracking program til rotationer af kardan 12,5 ° (+/-) omkring sin vandrette akse og 10 ° (+/-) om sin lodrette akse.
- Klik på "Skærm" i vinduet "Kontroller". Marker afkrydsningsfelterne under både "Blik" og "Stim" for "Stirrer punkt", "Kalibrering Region" og "Geometri Grid". Efter at have kontrolleret boksene under "Geometri Grid", vil et vindue poppe op og sige, "stimulus display geometri skal måles, før gitteret geometri kan vises. Vil du gøre det nu?" Vælg "Y" for ja.
- Ved hjælp af musen, klik på menuen "Vinduer" og vælg "Stimulus". "Stimulus" vindue vil åbne viser en lodret og vandret linje krydser på midten af skærmen. Måle længder af linjer til den nærmeste mm. Tryk "Esc" på tastaturet for at afslutte vinduet "Stimulus".
- Ved hjælp af musen, klik på menuen "Stimulus" og vælg "Geometri Setup". Input længder af de linjer, der blev kun målt. Du kan justere synsafstand så grader/linje lige 25 ° for den vandrette linje og 20 ° til den lodrette streg. Klik på knappen "Store" og Luk vinduet.
- Vælg antallet af kalibrering "Datapunkt" til "9" i vinduet "EyeSpace". Turtle's eye placeret på center, og klik på center data peg og klik på knappen "Igen til stede".
Bemærk: "Stimulus" vindue vil åbne, og "Get Ready" vises midt på skærmen. En boks vises på center placering og derefter forsvinde. På dens forsvinden lukker vinduet "Stimulus". Midterpositionen bør nu være kalibreret. - Gentag proceduren, ved at dreje kardan højre/venstre, 12,5 ° /-12.5 °, og op/ned + 10 ° /-10 ° til at kalibrere de resterende datapunkter.
- For at kalibrere torsionsstivhed rotation, bruge skabelonen montering algoritme forsynet med den video-baserede eyetracking program. Algoritmen sætter en nul holdning baseret på markeringer af iris og beregner en vinkel på rotation, når markeringerne blive opvejet fra barycentrum for eleven.
- Brug musemarkøren, klik på menuen "Vinduer" og vælg "Vride". Klik på knappen "START" i vinduet "Vride". I vinduet "EyeCamera" vises en bue over billedet af øjet.
- Justere radius, vinkel og længde af bue ved hjælp af skyderne på et sted, hvor uregelmæssige markeringer er til stede i iris. Marker afkrydsningsfelterne for "Real-time grafik" og "Auto-sæt efter justere". Hvis det er nødvendigt, justere lysstyrke og kontrast kontrol rude og re-tærskel mørke eleven (Se trin 4). Klik på knappen "Angiv skabelon".
- Placer en lineal i det samme brændplanet som eleven og optage bredde af kameravisningen fuld. Værdien bruges senere til at bestemme den faktiske bredde af eleven.
5. placering af suge elektrode på kranienerver at fremmane øjenbevægelser
- Omhyggeligt placere en pin referenceelektrode i bindevæv eller muskel væv tilbage på hovedet.
- Placer den suge elektrode (Se Tabel af materialer) på kranienerver ved hjælp af en micromanipulator og dissektion anvendelsesområde monteret på en bom. Brug en fiber optic lyskilde til at se og guide placeringen.
- Matche størrelsen af en nerve til en kapillær glas spids. Trial and error er nødvendig for at opnå en bedste pasform omkring diameteren af en nerve (Se trin 1.2 størrelse anbefalinger). Placer glas tip på den suge elektrode. Fyld den suge elektrode med Ringers løsning og justere lydstyrken i sprøjten til omkring halvdelen af sin kapacitet.
- Omhyggeligt flytte glas spidsen af elektroden ved hjælp af micromanipulator til en placering over cut-slutningen af den valgte nerve. Sikre at Ringers løsning fylder kraniet og spidsen er under dens overflade. Hvis det er nødvendigt, bruge modeling ler til dam op steder hvor Ringers løsning siver ud af kraniet.
- Trække sig tilbage i stemplet af sprøjten.
Bemærk: Vakuum vil trække nerven i årets de kapillære tip. En god pasform er angivet af nerve tilbage i spidsen med lidt eller ingen yderligere vakuum anvendes.
6. stimulering af kranienerver og analyse af øjenbevægelser
- Brug et generelt formål nerve/muskel stimulator med en nuværende afspærringsanordning (Se Tabel af materialer) at stimulere kranienerver via suge elektrode.
- Tilslut den suge elektrode til den aktuelle isoleret enhed ved hjælp af et kabel. Kobl ledningen fra pin referenceelektrode til jordforbindelsen af isoleret enhed.
- Vælg parametre af strømmene ved hjælp af skiver og tænder for enheden stimulator og isolation. Brug en vifte af strømninger fra 1 til 100 µA, med hyppigheden af 10 til 400 Hz. Brug 1 - eller 2-ms pulser i regionaltog varig 100, 500 eller 1000 ms.
- Registrere tidspunktet for stimulering.
Bemærk: Transistor-transistor-logik (TTL) bælgfrugter er synkroniseret med leverancer af strømme fra stimulatoren og kommunikere i realtid via et kabel til indgangskanaler af video-baserede eye tracking system. En software modul udleveret den video-baserede eye tracking program kontrolelementerne meddelelse.- For at visualisere timingen af de aktuelle programmer og deres indflydelse på øjenbevægelser, klik på menuen "PenPlots". Vælg "X blik Position", "Y blik Position", "Vride" og "Elev bredde" at vise realtid rådata parceller for X og Y øjet positioner, torsion og elev bredde. Også vælge "Sekunder & markører" i menuen "PenPlots" til at vise en timing plot med aksemærker, som vises på 1 s intervaller.
Bemærk: Et stort bogstav "T" vises markerer starten af TTL puls, forekommer samtidig med det aktuelle program. - Du kan lagre data af øjenbevægelser fremkaldt af strømninger, klik på "File"-menuen og vælg "Ny datafil" under "Data". Angive et filnavn og tryk på "Enter". Gemme data kan være midlertidigt og derefter genstartet ved hjælp af en kombination af tastaturkommandoer, "Ctrl" + "p". Når en eksperimentel session er afsluttet, skal du vælge "Luk datafil" off "Fil" menu under "Data".
- For at hjælpe med at holde styr på slags strømninger anvendes, klik på menuen "Vinduer" og vælg "Data Pad". "Tastatur/DataMarker" vindue vises. Klik på et bogstav eller et tal for at identificere parametre for de aktuelle stimulering bliver leveret til nerve.
Bemærk: For eksempel, "X" kunne stå for 10 µA. klikke på "X" gemmer sin post i datafilen i realtid for post hoc analyser. Det vises også på "PenPlot" til "Sekunder & markører" for igangværende observation.
- For at visualisere timingen af de aktuelle programmer og deres indflydelse på øjenbevægelser, klik på menuen "PenPlots". Vælg "X blik Position", "Y blik Position", "Vride" og "Elev bredde" at vise realtid rådata parceller for X og Y øjet positioner, torsion og elev bredde. Også vælge "Sekunder & markører" i menuen "PenPlots" til at vise en timing plot med aksemærker, som vises på 1 s intervaller.
- Analysere data fra øjet tracker system.
- Åbn datafilen gemte, som er i en afgrænset tekstformat, i en spredning ark program valg at organisere dataene og foretage statistiske analyser.
- Konvertere elev breddeværdier gemmes i filen til virkelige størrelser i mm.
- Konvertere værdier af X og Y øjet positioner og torsions til enheder af grad og brug konventioner til at beskrive øjenbevægelser; derfor positive retninger af rotationer: intorsion, elevation, og adduktion; og negative retninger af rotationer: obliquus, depression og bortførelse.
- Kopiere oplysningerne i overskriften på et nyt regneark. Dette vil omfatte værdier for skærmens størrelse (bredde og højde) og synsafstand. Otte kolonner med data, der indsamles med en sats på 30 Hz vil følge nedenstående headeroplysningerne.
- Gå tilbage til det regneark, der indeholder de rå data. Gøre en "Søg" for "X" i den sidste kolonne med titlen "Markør" for at finde hvor stimulation blev anvendt med 10 µA. Find forekomsten af "T", markerede begyndelsen af den nuværende stimulation. Kopiere 15 rækker (0,5 s) af data sker før "T" og 90 rammer efter "T" (3.0 s); dvs.3,5 s alt. Indsætte data i det nye regneark nedenfor headeroplysningerne.
- Indsæt en blank kolonne efter "PupilWidth". I den tomme kolonne, konvertere til dimensionen kalibreret i mm:
Vandrette elev diameter = "PupilWidth" × dimension af kameraet Se bredde - Indsæt 2 tomme kolonner efter både "X_Gaze" og "Y_Gaze". Normalisere holdninger til dimensionerne af skærmbillede: koordinater (0, 0) øverst til venstre på skærmen udvidelse til (1, 1) nederst til højre. I den første tomme kolonne, oversætte stillinger til et koordinatsystem med (0, 0) på midten af skærmen. Omfatte omstilling til dimensionerne af skærmen i mm:
X = (0,5 × bredde) – ("X_Gaze" × bredde); Y = (0,5 × højde) – ("Y_Gaze" × højde)
Bemærk: Rækkefølgen af drift er til venstre øje. Rækkefølgen skal tilbageføres til den højre øje for at følge konventionen af negativitet for bortførelse og positivitet for adduktion. - I de anden kolonne, skal du bruge trigonometri funktioner til at konvertere til vinkler (°) af rotation:
vandret rotation = arctan (X/viewing afstand); lodret rotation = arctan (Y/viewing distance) - Torsion er allerede vist i enheder af grader, men for at opfylde konventionen af positivitet for intorsion, hvis Måling sker på venstre øje, ganger med -1. For det højre øje er ingen multiplikation nødvendige. Programmet koder uret som positiv.
- Plot elev diameter og rotationer som funktion af tiden.
- Åbn datafilen gemte, som er i en afgrænset tekstformat, i en spredning ark program valg at organisere dataene og foretage statistiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser stills af billeder taget fra en video, der beskriver dissektion. Billeder give typiske steder af nerver før skæring fra hjernen.
Figur 1: Stills af billeder taget fra video af dissektion at vise placeringen af synsnerven (nII), oculomotor nerve (nIII), trochlea nerve (nIV), og abducens nerve (nVI). (A) billede med mærket regioner af hjernen efter fjernelse af hotellerne. Hvid skala bar = 10 mm. (B) billede viser placeringen af nII, nIII og nIV hvor de oprette forbindelse til højre side af midthjernen (efter fjernelse af olfaktoriske pærer og cerebrum). (C) billede viser placeringen af nVI hvor det forbinder til den venstre side af hjernestammen (efter fjernelse af midthjernen). Hvide stiplede linjer er udarbejdet omkring nerverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 viser den gennemsnitlige ændring i elev diameter forekommer efter stimulerende nIII. Selv om ydre øjenbevægelser også er observeret, som ændrer placeringen af eleven, forbliver foranstaltning af handling af sphincter pupillae af iris pålidelige. Foranstaltninger fra én forberedelse og vise den typiske variation af svar til gentagne nuværende stimulering. Mener elev diameter er reduceret fra 1,95 ± 0,01 mm til 1,60 ± 0,01 mm. Den smalle standardafvigelse angiver et vellykket anfald af elektrode til nerven. Når du måler blandt forskellige præparater (N = 5), typisk variabilitet er ± 0,08 mm. Selvom stadig relativt smal, er værdien omkring otte gange større end variabiliteten observeret fra et enkelt præparat.
Figur 2: eksempel på elev konstriktion fremkaldt ved at stimulere oculomotor nerven (nIII) i hele-head forberedelse. Sort spor er gennemsnitlig elev diameter (PD) fra seks stimulering i en forberedelse, og stiplede linjer viser ± standardafvigelse (SD). Rektangulær bølgeform på x-aksen betegner debut og forskydning af et 100 Hz tog af 1-ms pulser med en amplitude på 50 µA. Skitsen nederst til venstre viser retningen af linjen iris i øjet inden stimulation, og billederne nederst viser stadig billeder fra en repræsentativ prøve før (A), under (B), og efter stimulation (C). Hvid skala bar = 1 mm. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Foranstaltninger af elev svar kræver ikke kalibrering af øjet rotationer; men hvis måling extrinsic bevægelser, placering af hovedet i en kardan skal omhyggeligt gøres for at foretage sammenligninger mellem præparater (figur 3). Når hovedet er placeret i kardan den dorsale flade af kraniet parallelt med horisonten, forskydes iris linje fra horisonten mod næsebor. Figur 3D viser en typisk offset (28,6 °) i et præparat. For tre forskellige præparater var den gennemsnitlige offset 30.1 ± 9,0 °. En vinkel af forskydning inden for standardafvigelsen angiver acceptable passer inden for kardan.
Figur 3: en isoleret turtle head forberedelse placeret i kardan. (A) Region i den hvide rektangel viser placeringen af turtle head i et fotografi af opsætningen af udstyr. (B) Magnified Se af den hvide rektangel (syv gange). Punkteret hvid linje tegnes på billedet fra næsebor til elev center og er niveau med i horisonten. En solid hvid linje er overlejret og parallelt med linjen, iris. (C) tegneserie af den venstre side af hovedet. (D) billedet af øjet fanget af kameraet af den video-baserede eye tracking system. Sort skalalinjen: 5 mm i B; 1 mm i D. Dette tal er blevet ændret med tilladelse32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 viser de gennemsnitlige rotationer af øjnene fra ti præparater fremkaldt ved stimulering af nIV vil den overlegne skrå muskel. Typiske peak rotationer for intorsion, elevation og bortførelse (i svar til 70 µA, orange trace) er 10,0 ± 5,7 °, 2,8 ± 1,2 ° og 3,0 ± 2,1 ° henholdsvis. Størrelser målt for rotationer i enkelt præparater til gentagne stimulering er lignende, men med mindre variation (f.eks.N = 5), 14,8 ± 1,0 ° for intorsion, 3,2 ± 0,2 ° elevation og 2,4 ± 0,2 ° for bortførelse. Mønster af variabilitet blandt forskellige præparater i forhold til et enkelt præparat er sammenlignelige (inden for én logaritmiske enhed) til hvad er observeret for foranstaltninger af elev ændringer: 6 gange større for både intorsion og elevation, 11 gange større for bortførelse.
Figur 4: betyde øje rotationer fremkaldte efter stimulere venstre trochlea nerve (nIV) med 500-ms 100 Hz tog af 2-ms pulser i 10 præparater (seks anvendes på venstre side og fire anvendes på højre side, fem forsøg måles for hver). Rektangulær bølgeform på x-aksen i bunden plot betegner timing af stimulus. Svar fra venstre og højre øje var ikke signifikant forskellig fra hinanden. Intorsion var ledsaget af elevation og bortførelse (Se overliggende tegneserie af visningen head-on Turtle, hvis pile opsummere komponenter af øjenbevægelser). Øje bevægelse amplitude nogenlunde svarer til de syv nuværende amplituder anvendes til nIV (Se kode i legenden boks). Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I modsætning til nIV, som går kun til den overlegne skrå muskel, innerverer nIII og nVI flere muskler, så bevægelser er mere udfordrende at fortolke. Deraf følgende øjenbevægelser afhænger hvad motor enheder rekrutteres (figur 5) (Se diskussion). Variation fra forberedelse til forberedelse kan derfor blive betydelig. For eksempel fremkalder nVI intorsion, elevation og bortførelse (figur 5 c). Bortførelse er sandsynligvis fra de motoriske enheder fremme virkningen af den laterale rectus; Intorsion og højde i stedet skyldes andre motoriske enheder vil mål såsom retractor bulbi eller nictitating membran.
Figur 5: betyde øje bevægelse svar fremkaldt ved at stimulere tre hjernenerver med 10-, 50-, 100- og 400-Hz tog i fire præparater. Alle stimulus togene var 500 ms i varighed, bestående af 2-ms pulser med amplitude af 70 µA, en værdi over tærsklen. Øjenbevægelser vises som før med kolonner en-C viser svar til stimulation af nIII, nIV og nVI, henholdsvis. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fordi nIII innerverer flere mål (overlegne rectus, ringere rectus, ringere skrå, mediale rectus og sphincter pupillae), analyse af evoked bevægelser er den mest komplekse. For eksempel vist i figur 5A, opstår obliquus, adduktion og elevation. Baseret på dette, er en rimelig fortolkning, at aktionerne, der er for det meste fra den ringere skrå med mulige bidrag fra den mediale rectus. Superior rectus, og ringere rectus kan annullere hinanden. En større variation af aktioner til nIII sandsynligvis stammer fra de større forgrening af nerve og placeringen af cut til montering af elektroderne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin:
De kritiske trin inden for denne protokol er følgende: 1) dissektion og omhu at bevare levedygtigheden af transected nerver; 2) den matchende størrelser af de suge elektroder til hjernenerver reagere konsekvent; og 3) placering af hoved i kardan til at give tilstrækkelig kalibrering af rotationer af øjet.
Fejlfinding:
Dissektion kan være udfordrende, men efter endt det et par gange, skridt bør blive relativt ligetil. Hvis nerverne vises ikke-responderende, er den mest sandsynlige årsag en manglende dissektion. Under fjernelse af hjernen bør kun minimal spændinger og pres anvendes på nerverne under deres skæring. Rørende nerverne med metallisk kirurgiske instrumenter bør også undgås så meget som muligt, og så glas kroge og plast pincet kan erstatte for metal værktøjer, hvis problemer fortsætter34. Selv om skildpadden væv har evnen til at overleve variable niveauer af ilt, brugen af frisklavet skildpadde Ringers løsning boblede med 95/5% O2/CO2 og kølet er tilrådeligt; Dette er imidlertid mindre kritiske. Fordelen ved at anvende præparatet er jo overlevelsesevne under varierende iltindholdet og temperatur svingninger2,3,4,35. Vigtigere er den periodiske vanding af forberedelse med skildpadde Ringers løsning til at undgå udtørring af væv.
At gøre et sæt af tips i varierende størrelser for at suge elektrode forud udfører et eksperiment vil forbedre chancerne for en god pasform til nerven. Svarende til dissektion, brand polering tips tager nogle praksis. Bevare et hoved med nerver fra en forudgående eksperiment og bruge det som reference, mens at gøre tips kan hjælpe. At arrangere tips fra små til store diameter størrelse og gemme dem på nogle modellering ler giver mulighed for hurtig montering under et eksperiment. For mindre tips kræves mere tid rullende tips i flammer. Skudspidserne bør være fri for revner og besidde glat kanter at give mulighed for en god tætning på nerven.
Orientering af hovedet i kardan skal være tilstrækkelig. Hvis ikke, aksen af målinger vil blive skæv. En rotation til højre, der er større end den samme tilvækst til venstre, indikerer f.eks., at midten af øjet er forskudt og skal flyttes til højre. Nogle problemer kan også forekomme i at opretholde et pålideligt signal fra eleven under rotationer. Justere belysning af pupillen ved infrarød LED lidt kan hjælpe med at opnå bedre resultater.
Begrænsninger:
En mangel ved forberedelsen er vanskeligheden ved at identificere kinematik handlinger af specifikke muskler. Dette gælder især for bevægelser målt efter stimulering af nIII og nVI. Én måde at løse individuelle muskel handlinger er at foretage systematisk transections af nerve filialer for at isolere en vej rejser til en bestemt muskel. For eksempel, har vi haft succes med opskæring nIII distalt for de ciliaere ganglier og stimulere den korte ciliaere nerve for at isolere handlingen af sphincter pupillae33,36. En anden metode er at montere en strain gauge system på både agonist og antagonist muskler og derefter svarer bevægelser med aktiviteter i specifikke muskler37,38 . Til denne metode, ville isolation af en vej, der rejser til en bestemt muskel ikke være så nødvendigt.
Forberedelse giver også mulighed for passiv udspænding tilknyttet viskoelastisk elementer optræder i modsatte retninger på de tilsvarende muskler (fx, lateral rectus versus mediale rectus muskler eller sphincter dilator versus sphincter pupillae )39. For at analysere viskoelastisk elementer, kan svar opnås ved stimulerende transected nerver som beskrevet her sammenlignes med dem, der opnås ved hjælp af et præparat, hvori de subkortikale områder og lillehjernen er diskuteret; derfor dette holder de funktionelle neurale integratorer intakt, og så er det muligt at stimulere enkelt motoneuron områder i hjernestammen innerverer hver muskel40.
Betydning med hensyn til andre hvirveldyr modeller:
Selv om cryoanesthesia er acceptabelt, at skildpadder, kan ikke denne fremgangsmåde godkendes med arbejde i varmblodede dyr41,42. En farmakologisk agent som pentobarbital eller ketamin er derfor nødvendig. Agenter, forvirre imidlertid øje bevægelser43. Ikke desto mindre, fremgangsmåde er nyttig for krybdyr og kunne anvendes på andre lateral-eyed ikke-mammalians, såsom padder og fisk44,45, fordi det giver mulighed for sammenligning af adfærd genereret af en isoleret efferente neurale vej til dem, der foretages af en intakt animalske32,33.
Fremtidige ansøgninger:
Forberedelsen kan tjene som en analyse for nervevæv overlevelsesevne. En protokol kunne være designet til at tage systematisk fat hvordan forskellige faktorer påvirker øjenbevægelser. Tilgange kunne være så simpelt som at teste forskellige temperaturer eller farmakologiske midler herunder analgetika. Fordi bevægelser er mere vanskeligt at fortolke for nIII og nVI, er deres anvendelse mere begrænset. Derfor ville ikke væsentligt skadevoldende værdi sandsynligvis være det bedste valg for manipulation.
Men for at løse individuelle muskel kinematik resulterende fra stimulerende nIII og nVI, ændring af forberedelsen ville være nødvendige, såsom at gøre en systematisk transection af grene af nerver eller herunder strain gauges på målrettede musklen sæt. Endelig måling svar i et præparat hvor neurale integratorer holdes intakt ville aktiverer bestemmelse af hvordan viskoelastisk elementer muligvis kunne blandt begrænsning af kvantificeringer af kinematik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke fru Paulette McKenna og Lisa Pezzino i denne undersøgelse for sekretærservice og Mr. Phil Auerbach for teknisk support. Forfatterne også takke Drs. Michael Ariel og Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) for at indføre os til in vitro- isoleret hoved forberedelse. Finansiering til støtte for dette samarbejde blev leveret af Department of Biology (Robert S. Chase fond), den akademiske Forskningsudvalget og neurovidenskab Program på Lafayette College. Endelig, dette arbejde er dedikeret til Mr. Phil Auerbach, som afgik 28 September 2016; han afmonteret en scanning elektron mikroskop og anerkendt nytten af dets 5-aksede fase til brug i denne protokol. Hans venskab og opfindsomhed vil blive savnet meget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
