Summary
Denne protokollen beskriver hvordan bruke en i vitro isolert skilpadde leder forberedelse til å måle kinematikken av deres øyebevegelser. Etter fjerning av hjernen fra kraniet stimuleret Hjernenerve med strøm å kvantifisere rotasjoner av øyet og endringer i elev størrelser.
Abstract
Etter dyr euthanized, begynner deres vev å dø. Skilpadder tilbyr en fordel på grunn av lengre overlevelse tid av deres vev, spesielt sammenlignet med hjertelig-blod virveldyr. Derfor kan i vitro eksperimenter i skilpadder utføres for lengre tid å undersøke thе nevrale signaler og kontroll av sine mål handlinger. Bruker en isolert leder forberedelse, vi målt kinematikken av øyebevegelser i skilpadder og deres modulering av elektriske signaler båret av kraniale nerver. Etter hjernen ble fjernet fra skallen, ble røres Hjernenerve, dissekert hodet plassert i gimbal kalibrere øyebevegelser. Glass elektroder ble knyttet til Hjernenerve (oculomotor, trochlear, og abducens) og stimulert med strøm til å fremkalle øyebevegelser. Vi overvåket øyebevegelser med en infrarød video sporing system og kvantifisert rotasjoner i øynene. Nåværende pulser med en rekke amplituder, frekvenser, og tog varigheter ble brukt til å observere effekter på svar. Fordi preparatet er separert fra hjernen, kan efferent veien skal muskel mål undersøkes isolert undersøke nevrale signalering i fravær av sentralt behandlet sensoriske informasjonen.
Introduction
Begrunnelsen for å bruke røde-eared glidebryteren skilpadder elektrofysiologiske eksperimenter:
Red-eared glidebryteren skilpadder (Trachemys scripta elegans), regnes som en av verdens verste invasiv Art1 og kan indikere at et økosystem er i trøbbel. Grunnen hvorfor rød-eared glidebryteren skilpadder er så vellykket er dårlig forstått, men det kan delvis skyldes deres tolerant fysiologi og besittelse av nervøs vev som kan overleve under hypoxic forhold2,3,4 . Bruke dem for eksperimentering ikke True deres antall og med minimal innsats, elektrofysiologiske forberedelser kan være levedyktig over lengre varighet, så lenge som 18 timer5,6. Fordelen er fordelen med å bruke virvelløse dyr som kreps7, som også har evne til å tåle lave nivåer av oksygen8.
Teknikker for måling av øyebevegelser:
Tilnærminger til å måle øyebevegelser i frontal-eyed dyr med ikke-menneskelige primater har vært godt utviklet9. Øyet roterer i bane rundt tre akser: vannrett, loddrett og vridningsstivhet. Den magnetiske coil metoden er generelt betraktet som den mest pålitelige for måling rotasjoner, men er invasiv, som krever liten spoler settes inn i scleras av dyr10,11. Video-baserte systemer kan også måle rotasjoner og har fordelen av å ikke-invasiv. Utvikling av bedre kamera med nyskapende bildebehandling har forbedret funksjonaliteten gjør video-basert systemer et attraktivt alternativ å vurdere12,13,14.
Teknikker utviklet for å måle øyebevegelser i nonmammals har vært mye mindre betydning. Tiltak er enten lav oppløsning eller beskrive noen av rotasjoner15,16,17,18. Mangel på utvikling kan delvis skylden på problemer i trening nonmammals å følge visuelle mål. Selv om øyebevegelser har blitt godt studert i rød-eared glidebryteren skilpadder19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, på grunn av utfordringen i opplæring dyr å spore mål, presis kinematikken av deres øyebevegelser er dårlig forstått.
Red-eared glidebryteren skilpadder er generelt ansett lateral-eyed virveldyr, men fordi de fullt trekke hodet i deres skall31, betydelig okklusjon av de laterale visuelle feltene av ryggskjoldet oppstår32. Resultatet er at deres visuelle siktelinjen blir tvunget mot fronten, noe som gjør dem oppfører seg mer som frontal-eyed pattedyr. Derfor tilbyr benyttet som en modell for å utvikle metoder for å måle øyebevegelser også et unikt evolusjonært perspektiv.
Protokollen beskrevet i dette arbeidet bruker en i vitro isolert leder forberedelse for å identifisere kinematikken øye bevegelser i rød-eared glidebryteren skilpadder. Hjernen er dissekert fra hodeskaller røres Hjernenerve. Hoder er plassert i gimbal å kalibrere øyebevegelser og fremkalle svar av elektrisk stimulering av Hjernenerve innervating øyemusklene. Mål rotasjoner av øynene gjøres av en video-basert system, bruker programvare algoritmer, som sporer den mørke eleven og merkingen av iris. Forberedelse gir muligheten til å måle kinematikk både extraocular (dvs., vannrett, loddrett og vridningsstivhet rotasjoner)32 og intraokulært (dvs., elev endringer)33 bevegelser.
Modellsystem for analyse av Efferent nervebaner:
Mer generelt gir tilnærmingen etterforskerne sjansen til å studere hvordan efferent nevrale signaler genererer øyebevegelser når musklene begynner fra avslappet stater og i fravær av integrert sensoriske informasjonen behandles av hjernen32, 33. Derfor kan øye kinematikken undersøkes i et modellsystem der de behandles utelukkende av efferent nevrale veien forlater hjernen og synapsing på musklene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Red-eared glidebryteren skilpadder, både mannlige og kvinnelige, ble kjøpt fra en leverandør. Skilpadder ble plassert i en varm dyr pakke inneholder to 60-galle stamper utstyrt med murstein øyene solte under 250 W infrarødt lys. Miljøet var vedlikeholdes på en 14/10-h lys/mørke syklus med temperaturen på 22 ° C. Lysene ble slått på på 6:00 og deaktivert på 8:00 pm. Tankene utstyrt med filtrering systemer ble renset ukentlig, og skilpadder ble matet annonse libitum annenhver dag. Av rød-eared glidebryteren skilpadder og alle de følgende eksperimentelle prosedyrer beskrevne her32,33 ble godkjent av dyr institusjon og bruk Committee (IACUC) på Lafayette College.
1. utstyr oppsett
- Forberede skilpadde Ringer i løsningen. Legge til følgende destillert vann i denne rekkefølgen: natriumklorid 96.5 mM (58.44 g/mol), kalium klorid 2.6 mM (74.56 g/mol), magnesiumklorid 2.0 mM (203.31 g/mol), natriumbikarbonat 31,5 mM (84.01 g/mol), druesukker 20.0 mM (180.16 g/mol), konsentrert saltsyre justere pH 7.51 og veisalt 4.0 mM (110.98 g/mol) (se Tabell for materiale). Bland løsningen legger hver salt.
FORSIKTIG: Konsentrert HCl er farlig (hud, øyne, innånding og svelging farer). - Lage tips for sugekraft elektrodene fra 5 cm lange kapillær glass (se Tabell for materiale), av brann-polering til ulike størrelser av indre diameter for å imøtekomme kraniale nerver av ulik tykkelse.
- Bruk en liten fil til etch en linje over et stykke av kapillær glass. Legg i papir og bryte i to.
- Sakte rulle en av endene av kapillær glasset i flammen i en Bunsen-brenner. Undersøk periodisk spissen for størrelse, glatthet og symmetri bruker en disseksjon omfang og en fiberoptisk lys kilder (se Tabell for materiale).
Merk: Skilpadder med hodet bredder mellom 20 og 30 mm, optimal montering indre diameter størrelser vanligvis varierer fra 0,4 til 0,8 mm for nervus nerve (nIII), 0,3 til 0,6 mm for trochlear nerve (Salmene) og 0,2-0,4 mm for abducens nerve (Veterinærinstituttet).
- Rengjøre og organisere Rongeurs, en stump disseksjon sonde, microscissors, fin tang, buede tang og en skalpell håndtere med blad (se Tabell of Materials) til dissection.
Merk: Sterilisering av instrumenter er valgfritt.
2. anestesi og Euthanasia
- Sted skilpadden i en is bøtte for 60 min å cryoanesthetize den.
- Euthanize skilpadden ved halshogging bruker en liten dyr giljotinen (se Tabell for materiale).
- Forsiktig lirke kjevene av dyr åpne med en liten veiing slikkepott slik at en krok kan settes inn og snudde passer under tuppen av overkjeven.
- Trekk med jevn trykk å utvide at dyret gjennom giljotinen. Raskt halshugge dyret.
- Plasser skilpadde i disseksjon parabol. Har nok skilpadde Ringer i løsning på hånden for å vanne vevet. Oxygenize løsning med 95/5 O2/CO2 (se Tabell for materiale).
- Opprettholde vev på 4 ° C ved å plassere is rundt utsiden av parabolen.
3. disseksjon
- Bruke disseksjon området med fiber optisk lyskilde utføre dissection.
- Fjerne underkjeven. Plass en stump disseksjon sonde gjennom munnen å gi enklere håndtering av hodet. Kuttet felles tilkobling dentary benet til kraniet med en skalpell. Bruk rongeurs til å trekke underkjeven fra kraniet. Bruk rongeurs til å trekke av huden og musklene vedleggene på regionene dorsal og lateral i kraniet.
- Fjerne virvelsøylen.
- Identifisere virvelsøylen på caudal slutten av kraniet. Bøy virvelsøylen ventrally å avsløre ryggmargen. Bruk microscissors for å bekkasin ryggmargen. Bruk rongeurs for å fjerne virvelsøylen og andre vev fra kraniet ved å trekke caudally.
- Fjern hjernen fra kraniet etter klipping Hjernenerve.
- Starter på den foramen magnum, bruk rongeurs for å kutte to snitt på dorsal kraniet. Gjøre kutt overfladisk å unngå å skade hjernen under.
- Bruk rongeurs til å nøye trekke av dorsal kraniet. Bruk microscissors for å fjerne meninx for å vise resten av hjernen. Fjerne nok meninx før olfactory pærene, i fremre skallen hulrom, kan identifiseres (se figur 1A). Fortsette å vanne hjernen med skilpadde Ringer i løsning, som nødvendig.
- Bruke buede tang til å trekke cerebrum caudally og produsere liten spenning på Hjernenerve forsiktig. Nøye klippe bort og fjerne olfactory pærer og hjernen med buet tang.
- Bruke microscissors Skyv mellomhjernen mot midtlinjen å avsløre Hjernenerve; nIII, ca 0.6 mm, ses foran nIV, og diameteren på Salmene vil være litt mindre enn nIII. Skjær nIII og nIV hvor de legger til mellomhjernen (se figur 1B). Gjenta på den andre siden.
- Kuttet venstre og høyre synsnerven (nII) med microscissors. Deretter bøye hjernestammen til side. Observere Veterinærinstituttet fremvoksende fra ventrale overflaten nær pons og medulla (se figur 1 c); diameteren på Veterinærinstituttet er liten og ca 0,3 mm. Skjær både venstre og høyre Veterinærinstituttet.
- Fjerne de gjenværende delene av hjernestammen fra skilpadden med fine tang og microscissors. Når kraniet er tom, undersøke hjernen hulrom gulvet. Identifisere nIII, Salmene og Veterinærinstituttet.
- Fjerne øvre og nedre øye-lokkene med fine tang og microscissors.
4. kalibrering av øyebevegelser
- Bruke en rigid tabell (se Tabell for materiale) å støtte plasseringen av gimbal og andre instrumenter. Plass skilpadde hodet i gimbal chuck slik at dorsal overflaten av hodet er parallell til horisonten ved hjelp av en liten boble nivå hviler over skallen. Omtrent plasser ett av øynene på midten av gimbal's vannrette og loddrette rotasjoner.
- Plassere infrarøde kameraet, utstyrt med et infrarødt lys emitting diode (LED), som er en del av den video-basert øye sporing systemet (se Tabellen for materiale), i en visningsavstand på ca 12 cm fra turtle's eye.
- Vinkel kameraet 45 grader over siktlinje på øyet. Lysdioden skal på 11 o'clock posisjon når du ser på kameralinsen. Center LED langs den optiske aksen av øyet. Kameraet blir litt av aksen (som sett ovenfra øyet).
- Juster avstanden mellom kameraet fra øyet slik at kameraet vise fylles maksimalt av øyeeplet. Kontroller at hjørnene på øynene (canthi) er på kantene av visningen vannrett.
- Koble kameraet til video-basert øye sporing system for å behandle dataene. Splitte signalet til en DVD-opptakeren til å fange den rå videoen. Fokus kameraet for å få et klart bilde av øyet. Ta vare å fin-posisjon øyet på midten av kameraet vise ved hjelp av de tre gradene av lineær justering (x, y, z) gitt gimbal.
- Oppdage den mørke eleven ved å angi terskelen og kontrast riktig bruker programmet leveres med video-basert øyet sporingssystem.
- Ved hjelp av musen, klikk på "Video"-menyen og velg "Høy presisjon" å ta bilder på en samplingsfrekvens på 30 Hz (resolution av 640 piksler x 480 linjer) under "Mode". Også under "Video", velg "Mørke elev" for "Elev Type" og "Ellipse (rotert ellipse)" for "Elev segmentering metode".
- Klikk på ikonet "Elev søk område justering" (små vertikale rektangel med en prikk i midten) i vinduet "EyeCamera". Bruk musen til å dra ut et rektangel som begrenser et område rundt Eleven. Unngå mørke områder som kan forveksles med elevene.
- Bekreft at det er merket av for avmerkingsboksene for "Auto Image" og "Positive-Lock terskel-sporing" i vinduet "Kontroller". Klikk på "Auto-terskelen" å optimalisere tettheten av skanning, som vises som grønne prikker over den mørke Eleven.
- Kalibrere video-visning av video-basert øyet sporing programmet rotasjoner av gimbal 12.5 ° (+/-) rundt den vannrette aksen og 10 ° (+/-) rundt den loddrette aksen.
- Klikk på "Vis" i vinduet "Kontroller". Merk under både "Stirre" og "Stim" for "Stirre Point", "Calib Region" og "Geometri rutenett". Etter å sjekke boksene under "Geometri rutenett", vil et vindu dukker opp og sier, "stimulans skjerm geometrien må måles før geometri rutenettet kan vises. Vil du gjøre dette nå?" Velg "Y" for Ja.
- Ved hjelp av musen, klikk på "Windows"-menyen og velg "Stimulans". "Stimulans" vinduet åpnes viser en vertikal og horisontal linje krysset på midten av skjermen. Måle lengden på linjene til den nærmeste mm. Trykk "Esc" på tastaturet for å lukke vinduet "Stimulans".
- Ved hjelp av musen, klikk på "Stimulans"-menyen og velg "Geometri Setup". Angi lengden på linjene som bare ble målt. Juster at visningsavstanden slik at grader/linjen lik 25 ° for den vannrette linjen og 20 grader til den vertikale linjen. Klikk på knappen "Store", og Lukk vinduet.
- Velg antall kalibrering "Datapunkt" å være "9" i vinduet "EyeSpace". Turtle's eye oppstilt for senteret, og klikk på center data pek og klikk "Re-presentere".
Merk: Åpner vinduet "Stimulans", og "Klar" vises i midten av skjermen. En boks vises i bildets midtpunkt og deretter forsvinner. På sin forsvinning lukkes vinduet "Stimulans". Midtre bør nå kalibreres. - Gjenta ved å rotere gimbal høyre/venstre, 12,5 ° /-12.5 °, og opp 10 ° /-10 ° kalibrere gjenværende datapunktene.
- Bruk malen passende algoritmen med video-basert øye sporing program for å kalibrere torsjonsmessig rotasjon. Algoritmen setter en null posisjon basert på tegninger av iris og beregner en vinkel for rotasjon Når merkingen bli forskjøvet fra centroid av eleven.
- Bruke musepekeren, klikk på "Windows"-menyen og velg "Torsjon". Klikk "START" i vinduet "Torsjon". I vinduet "EyeCamera" vises en bue over bildet av øyet.
- Justere radiusen og vinkelen lengden av buen bruker skyvekontrollene på et sted hvor uregelmessig tegninger er tilstede i iris. Kryss av for "Real-time grafikk" og "Automatisk sette etter Juster". Eventuelt justere lysstyrke og kontrast i vinduet og re-terskel den mørke eleven (se trinn 4). Klikk "Sette mal".
- Plasser en linjal i samme fokalplanet som eleven og registrere bredden på full kameravisningen. Verdien brukes senere til å bestemme den faktiske bredden av eleven.
5. plassering av inntaks elektroden på Cranial Nerve til å fremkalle øyebevegelser
- Forsiktig plassere en pin referanse elektrode i connective eller muskel vev på hodet.
- Plasser sugekraft elektroden (se Tabell for materiale) cranial nerve bruker en micromanipulator og disseksjon omfang montert på en bom. Bruk en fiber optisk lyskilde vise og guide plasseringen.
- Tilpasse størrelsen på en nerve til et kapillær glass tips. Prøving og feiling er nødvendig for å oppnå en best passer rundt diameteren på en nerve (se trinn 1.2 størrelse anbefalinger). Plassere glass bort på inntaks elektroden. Fyll sugekraft elektroden med Ringer i løsningen og justere volumet i sprøyten til rundt halvparten av sin kapasitet.
- Flytt forsiktig glass spissen av elektroden bruker micromanipulator til en posisjon over cut-slutten av valgte nerve. Kontroller at Ringer i løsningen fyller kraniet og spissen er under overflaten. Om nødvendig kan du bruke modellering leire dam opp steder der Ringetonens løsning lekker ut av kraniet.
- Trekke tilbake på stempelet til sprøyten.
Merk: Vakuum vil trekke nerve i slutten av kapillær spissen. En god passform angis av nerve resterende innen spissen med lite eller ingen ekstra vakuum brukt.
6. stimulering av Cranial Nerve og analyse av øyebevegelser
- Bruke en generelt nerve/muskelstimulator med en gjeldende isolasjon enhet (se Tabell for materiale) å stimulere cranial nerve via inntaks elektroden.
- Koble sugekraft elektroden til gjeldende isolasjon enhet med en kabel. Koble kundeemnet pin referanse elektrode til jordforbindelsen isolasjon enheten.
- Velg parameterne for strøm bruker ringer og slår på enheten stimulator og isolasjon. Bruk en rekke strømmer fra 1 til 100 µA, med frekvens på 10 til 400 Hz. Bruk 1 - eller 2-ms pulser i tog varig 100 500 og 1000 ms.
- Registrere tidspunktet for stimulations.
Merk: Transistor-transistor-logikk (TTL) pulser synkroniseres med leveringer av strøm fra stimulator og kommunisere i sanntid via en kabel til innspill kanaler av video-basert øyet sporingssystem. En programvare-modul utstyrt med video-basert øye sporing programmet kontrollerer kommunikasjonen.- For å visualisere tidspunktet for de aktuelle applikasjonene og deres innflytelse på øyebevegelser, klikk på "PenPlots"-menyen. Velg "X stirre posisjon", "Y stirre posisjon", "Torsjon" og "Elev bredde" å vise sanntid rådata tomter for X og Y øye posisjoner og torsjon elev bredde. Også velge "Sekunder & markører" fra "PenPlots"-menyen vise en timing tomt delaksemerker, som vises med 1 s mellomrom.
Merk: En bokstaven "T" vises merking utbruddet av TTL pulsen, forekommer samtidig med gjeldende program. - For å lagre data av øyebevegelser fremkalt av strømninger, klikk på "Fil"-menyen og velg "Ny datafil" under "Data". Angi et filnavn og trykk "Enter". Lagre data kan pauses og deretter startet med kombinasjonen av tastaturkommandoer, "Ctrl" + "p". Når en eksperimentell økten er ferdig, velg "Lukk datafilen" av fil-menyen under "Data".
- For å holde rede på hvilken type strøm brukes, klikk på "Windows"-menyen og velg "Data Pad". Vinduet "Tastaturet/DataMarker" vises. Klikk på en bokstav eller et tall for å identifisere parameterne for de gjeldende stimulations leveres til nerve.
Merk: For eksempel "X" kunne stå for 10 µA. klikke på "X" lagrer sin inntreden i datafilen i sanntid for post hoc analyse. Det vises også på "PenPlot" for "Sekunder & markører" for pågående observasjon.
- For å visualisere tidspunktet for de aktuelle applikasjonene og deres innflytelse på øyebevegelser, klikk på "PenPlots"-menyen. Velg "X stirre posisjon", "Y stirre posisjon", "Torsjon" og "Elev bredde" å vise sanntid rådata tomter for X og Y øye posisjoner og torsjon elev bredde. Også velge "Sekunder & markører" fra "PenPlots"-menyen vise en timing tomt delaksemerker, som vises med 1 s mellomrom.
- Analysere data fra øye sporing systemet.
- Åpne datafilen lagret, som i et avgrenset tekstformat, i en spre ark program av valget for å organisere dataene og utføre statistisk analyse.
- Konvertere elev bredde verdiene i filen til reell størrelse i mm.
- Konvertere verdiene av X og Y øye posisjoner og torsions enheter av grad og bruke konvensjoner for å beskrive øyebevegelser; Derfor positive retningen rotasjoner: intorsion, høyde, og Adduktion; og negative retninger rotasjoner: extorsion, depresjon og bortføring.
- Kopiere informasjonen i hodet på et nytt regneark. Dette inkluderer verdier for skjermstørrelsen (bredde og høyde) og at visningsavstanden. Åtte datakolonner samlet med en hastighet på 30 Hz følger nedenfor topptekstinformasjonen.
- Gå tilbake til regnearket som inneholder rådataene. Gjøre en "finner" for "X" i den siste kolonnen med tittelen "Markør" for å finne hvor stimulering ble brukt med 10 µA. finne forekomsten av "T", markerer begynnelsen av gjeldende stimulering. Kopiere 15 rader (0,5 s) av data skjer før "T" og 90 bilder etter "T" (3.0 s); dvs.3,5 s totalt. Lime inn dataene i det nye regnearket under topptekstinformasjonen.
- Sette inn en tom kolonne etter "PupilWidth". I den tomme kolonnen, konvertere til kalibrert dimensjonen i mm:
Vannrett elev diameter = "PupilWidth" × dimensjonen av kameraet Vis bredde - Sett 2 tomme kolonner etter både "X_Gaze" og "Y_Gaze". Normalisere posisjoner til dimensjoner av skjermen: koordinater (0, 0) øverst til venstre på skjermen strekker til (1, 1) nederst til høyre. I den første tomme kolonnen, oversette posisjoner til et koordinatsystem har (0, 0) i midten av skjermen. Inkluder konvertering til størrelsen på skjermen i mm:
X = (0,5 × bredde)-("X_Gaze" × bredde); Y = (0,5 × høyde)-("Y_Gaze" × høyde)
Merk: Rekkefølgen av drift er det venstre øyet. Sekvensen må tilbakeføres til høyre øye for å kunne følge av negativity for bortføring og positivity for Adduktion. - I andre kolonner, kan du bruke trigonometri funksjoner for å konvertere til vinkler (°) av rotasjon:
horisontal rotasjon = arctan (X/viewing avstand), vertikal rotasjon = arctan (Y/viewing avstand) - Torsjon vises allerede i enhetene grader, men for å oppfylle av positivitet for intorsion, hvis måling er gjort på det venstre øyet, multiplisere med -1. For høyre øye er ingen multiplikasjon nødvendig. Programmet koder klokken som positive.
- Tegn elev diameter og rotasjoner som en funksjon av tid.
- Åpne datafilen lagret, som i et avgrenset tekstformat, i en spre ark program av valget for å organisere dataene og utføre statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser stillbilder av bilder tatt fra en video som beskriver dissection. Bilder gi vanlige plasseringer for nerver før klippe fra hjernen.
Figur 1: stillbilder av bilder tatt fra video av dissection å vise steder av synsnerven (nII), nervus nerve (nIII), trochlear nerve (Salmene) og abducens nerve (Veterinærinstituttet). (A) bilde med merket områder av hjernen etter fjerning av meninx. Hvit skala bar = 10 mm. (B) viser Bildeplassering nII, nIII og nIV der de koble til høyre side av mellomhjernen (etter fjerning av olfactory pærer og hjernen). (C) bildet viser plasseringen av Veterinærinstituttet der den kobles til på venstre side av hjernestammen (etter fjerning av mellomhjernen). Hvite stiplede linjer tegnes rundt nerver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 viser mener endringen i elev diameter inntreffer etter stimulere nIII. Selv om ytre øyebevegelser også er observert, som flytter eleven, fortsatt målet for handlingen av sphincter pupillae av iris pålitelig. Tiltak er fra en forberedelse og viser typisk variasjon av Svar å gjentatte gjeldende stimulations. Mener elev diameter reduseres fra 1.95 ± 0,01 mm til 1.60 ± 0,01 mm. Smale standardavviket angir en vellykket tilpasning av elektroden til nerve. Når du måler blant forskjellige preparater (N = 5), typisk variasjon er ± 0,08 mm. Selv om det er fortsatt relativt smale, er verdien omtrent åtte ganger større enn variasjon fra en enkelt forberedelse.
Figur 2: eksempel på elev innsnevring fremkalt av stimulere nervus nerve (nIII) i hele-head utarbeidelsen. Sort er betyr elev diameter (PD) fra seks stimulations som en forberedelse, og stiplede linjer viser ± standardavviket (SD). Rektangulær bølgeform på x-aksen angir starten og forskyvning av et 100-Hz tog 1-ms pulser med en amplituden til 50 µA. Skissen nederst til venstre viser retningen på linjen iris i øyet før stimulering, og bilder nederst viser stillbilder fra en representant prøve før (A), under (B), og etter stimulering (C). Hvit skala bar = 1 mm. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse33. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tiltak av elev svar krever ikke kalibreringen eye rotasjoner; men hvis måler ytre bevegelser, gjøres plassering av hodet i gimbal nøye slik at sammenligninger mellom preparatene (Figur 3). Når hodet plasseres i gimbal med dorsal overflaten av skallen parallelt med horisonten, er iris linjen forskjøvet fra horisonten mot neseboret. Figur 3D viser en typisk forskyvning (28.6 °) i en forberedelse. Tre forskjellige preparater var bety forskyvningen 30.1 ± 9.0°. En vinkel på forskyvning innenfor standardavviket angir akseptabel passer innenfor gimbal.
Figur 3: en isolert skilpadde leder forberedelse i gimbal. (A)-regionen i det hvite rektangelet viser av skilpadde hodet i et fotografi av utstyr. (B) Magnified visning av det hvite rektangelet (sju ganger). Prikket hvit linje trekkes på bildet fra nesebor elev Center og nivå med horisonten. En heldekkende hvit linje er lagt og parallelt med iris linjen. (C) tegneserie på venstre side av hodet. (D) bilde av øyet fanget av kameraet på video-basert øyet sporingssystem. Svart skala bar: 5 mm B; 1 mm i D. Dette tallet er endret med tillatelse32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 viser mener rotasjoner av øynene fra ti preparater visuelt ved stimulering av nIV skal superior oblique muskelen. Typiske peak rotasjoner for intorsion, høyde og bortføring (som svar på 70 µA, oransje spor) er 10,0 ± 5.7°, 2,8 ± 1,2 ° og 3.0 ± 2.1° henholdsvis. Magnitudes målt for rotasjoner i enkelt forberedelser til gjentatte stimulations ligner, men med mindre variasjon (f.eksN = 5), 14,8 ± 1.0 ° for intorsion, 3,2 ± 0,2 ° høyde og 2,4 ± 0,2 ° for bortføring. Mønsteret av variabilities blant forskjellige preparater forhold til en enkelt forberedelse er sammenlignbare (innenfor en logaritmisk enhet) til det er observert tiltak elev endringer: 6 ganger større for både intorsion og høyde, 11 ganger større for bortføring.
Figur 4: mener øye rotasjoner utløste etter stimulere venstre trochlear nerve (nIV) med 500-ms 100 Hz tog 2-ms pulser i 10 preparater (seks på venstre side og fire på høyre side, fem forsøk til hver). Rektangulær bølgeform på x-aksen av tomten bunnen angir tidspunktet for stimulans. Svar fra venstre og høyre øyne var ikke signifikant forskjellig fra hverandre. Intorsion ble ledsaget av høyde og bortføring (se overliggende tegneserie av head-on visningen av turtle, som piler summere komponentene i øyebevegelser). Øye bevegelse amplituden omtrent tilsvarer de syv gjeldende amplituder brukt nIV (se koden i forklaring-boksen). Dette tallet har blitt reprinted med tillatelse32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I motsetning til nIV, som går bare til superior oblique muskelen, innervate nIII og Veterinærinstituttet flere muskler så bevegelser er mer utfordrende å tolke. Resulterende øyebevegelser, avhenger av hva motoriserte enheter rekrutteres (figur 5) (se diskusjon). Følgelig kan variasjon fra forberedelse til forberedelse bli betydelige. For eksempel fremkaller Veterinærinstituttet intorsion, høyde og bortføring (figur 5C). Bortførelsen er trolig fra de motoriserte enhetene fremme av lateral rectus; intorsion og høyde i stedet skyldes andre motoriserte enheter skal mål som festepunkt bulbi eller nictitating membranen.
Figur 5: mener øye bevegelse svar fremkalt av stimulere tre Hjernenerve med 10, 50, 100 og 400-Hz tog i fire preparater. Alle stimulans togene var 500 ms varighet, bestående av 2-ms pulser med amplituden til 70 µA, en verdi over sperregrensen. Øyebevegelser vises som før, med kolonner i-C viser svar til stimulering av nIII, Salmene og Veterinærinstituttet, henholdsvis. Dette tallet har blitt reprinted med tillatelse32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fordi nIII innervates flere mål (overlegen rectus, dårlig rectus, mindreverdige skrå, mediale rectus og sphincter pupillae), analyse av evoked bevegelser er de mest komplekse. I eksemplet i figur 5A, skjer extorsion, Adduktion og heving. Basert på dette, er en rimelig tolkning at handlingene er hovedsakelig fra de mindreverdige skrå med mulige bidrag fra den mediale rectus. Overlegen rectus og dårligere rectus kan avbryte hverandre. En høyere variabilitet handlinger for nIII trolig stammer fra det større forgrening av nerve og plasseringen av kuttet for montering elektrodene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgjørende skritt:
De avgjørende skritt i denne protokollen er følgende: 1) dissection og omsorg å beholde levedyktigheten til transected nerver; 2) den tilsvarende størrelser av inntaks elektrodene til Hjernenerve å gi konsistent svar; og 3) plassering av hodet i gimbal å gi tilstrekkelig kalibrering av rotasjoner av øyet.
Feilsøking:
Dissection kan være utfordrende, men etter at det noen ganger, trinnene bør bli relativt rett frem. Hvis nerver vises utilgjengelig, er den mest sannsynlige årsaken en svikt i dissection. Under fjerning av hjernen bør bare minimal spenninger og press brukes på nervene under deres kutte. Berøre nerver med metallisk Kirurgiske instrumenter bør også unngås så mye som mulig og så glass kroker og plast tang kan erstatte metall verktøy hvis problemer vedvarer34. Selv om skilpadde vev har muligheten til å overleve variable beskyttelsesnivåer oksygen, bruk av nystekte skilpadde Ringer i løsningen frikirkelige 95/5% O2/CO2 og kjølt anbefales; men er dette mindre viktig. Tross alt, er fordelen med å bruke utarbeidelse survivability under varierende oksygen og temperatur, svingninger,2,,3,,4,,35. Mer viktig er periodiske vanning av preparatet med skilpadden Ringer i løsning for å tørke ut vevet.
Å gjøre et sett med tips av varierende størrelse for sugekraft elektroden før et eksperiment vil forbedre sjansene for en god plass å nerve. I likhet med dissection, brann polering tips tar litt praksis. Bevare et hode med nerver fra en tidligere eksperiment og bruke den som referanse mens gjør tips kan hjelpe. Ordne tips fra liten stor diameter størrelse og lagre dem på noen modellering leire tillater rask montering under et eksperiment. For mindre tips kreves mer tid rullende tips inn flames. Tipsene bør være fri for sprekker og ha kantutjevning å ha en god tetning på nerve.
Retningen på hodet i gimbal må være tilstrekkelig. Hvis ikke, aksen av målene vil bli forvrengt. En rotasjon til høyre som er større enn samme tilvekst til venstre, angir for eksempel at midten av øyet motposteres og trenger å bli forskjøvet til høyre. Noen problemer kan også oppstå opprettholde en pålitelig signal fra eleven under rotasjoner. Justere belysning av elevene ved infrarød LED litt kan hjelpe oppnå bedre resultater.
Begrensninger:
En svakhet for utarbeidelse er vanskeligheten i å identifisere kinematikken handlinger av musklene. Dette gjelder særlig for bevegelser målt etter stimulations nIII og Veterinærinstituttet. En måte å løse enkelte muskel handlinger er å systematisk transections av nerve for å isolere en sti reiser til en bestemt muskel. For eksempel har vi vært vellykket i kutte nIII distale ciliary Ganglion og stimulere kort ciliary nerve for å isolere av sphincter pupillae33,36. En annen tilnærming er å montere en belastning-gauge Agonistiske og antagonist muskler og deretter svarer bevegelser med aktiviteter musklene37,38 . For denne metoden, ville isolering av en sti reiser til en bestemt muskel ikke være nødvendig.
Preparatet kan også passiv strekker visco-elastisk elementene i motsatt retning på tilsvarende musklene (f.eks, lateral rectus versus mediale rectus muskler eller sphincter dilator versus sphincter pupillae )39. For å analysere ut visco-elastisk elementene, kan svarene oppnås ved stimulerende transected nerver som beskrevet her sammenlignes de får en forberedelse der subkortikal områdene og lillehjernen er sparred; Derfor dette holder de funksjonelle nevrale integratorer intakt, og er det mulig å stimulere enkelt motoneuron områder i hjernestammen innervating hver muskel40.
Betydning når det gjelder andre virveldyr modeller:
Selv om cryoanesthesia er akseptabel for skilpadder, kan ikke denne tilnærmingen godkjennes med arbeid i hjertelig-blod dyrene41,42. Derfor er en farmakologisk agent som pentobarbital eller ketamin nødvendig. Agentene, men forvirrer øye bevegelser43. Likevel tilnærmingen er nyttig for reptiler og kan brukes til andre lateral øyne ikke-mammalians, som amfibier og fisk44,45, fordi det tillater sammenligning av generert av en isolert efferent nevrale veien de en intakt dyr32,33.
Fremtidige programmer:
Preparatet kan tjene som en analysen for nervøs vev overlevelsesevne. En protokoll kan være utviklet for å håndtere systematisk hvordan ulike faktorer påvirker øyebevegelser. Tilnærminger kan være så enkelt som tester forskjellige temperaturer eller farmakologiske agenter inkludert smertestillende. Fordi bevegelser er vanskeligere å tolke for nIII og Veterinærinstituttet, er deres bruk mer begrenset. Derfor vil Salmene trolig være det beste valget for manipulasjon.
Men for å løse enkelte muskel kinematikk resulterende fra stimulere nIII og Veterinærinstituttet, endring av preparatet ville være nødvendig, som gjør en systematisk transection grener av nerver eller inkludert Måløy på målrettet muskel sett. Til slutt, måle svar i en forberedelse der nevrale integratorer holdes intakt ville aktivere besluttsomhet hvordan visco-elastisk elementer kunne muligens begrense quantifications kinematikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker fru Paulette McKenna og Lisa Pezzino i denne studien for Administrativ støtte, og Mr. Phil Auerbach kundestøtte. Forfatterne også takke Dr. Michael Ariel og Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) for å introdusere oss til i vitro isolert hodet utarbeidelse. Finansiering for støtte av dette samarbeidet ble levert av Institutt for biologi (Robert S. Chase Fund), akademiske forskning komiteen og nevrovitenskap Program på Lafayette College. Til slutt, dette arbeidet er dedikert til Mr. Phil Auerbach, som gikk bort 28 September 2016; Han utrangerte scanning elektron mikroskop anerkjent nytten av 5-aksen stadiet for bruk i denne protokollen. Hans vennskap og oppfinnsomhet vil bli savnet mye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| pH meter | Oakton | pH 6+ | |
| Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
| Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
| Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
| Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
| Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
| Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
| Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
| Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
| Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
| Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
| Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
| Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
| Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
| Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
| 5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
| Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
| Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
| Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
| Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
| Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
| Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
| Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
| Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
| Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
| Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |
References
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
- Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
- Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
- Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
- Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
- Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
- McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
- Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
- Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
- Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
- Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
- Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
- Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
- Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
- Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
- Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
- Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
- Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
- Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
- Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
- Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
- Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
- Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
- Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
- Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
- Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
- Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
- Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
- Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
- Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
- Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
- Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
- Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
- Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
- Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
- Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
- Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
- Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
- Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
- AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
- Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
- Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
- Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).
