Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए अग्नाशय के एक हेपरिन का उपयोग कर starPEG nanocoating शामिल की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करना है छद्म bioorthogonal रसायन विज्ञान के बीच-hydroxysuccinimide समूहों के एनnanocoating और टाप के अमीन समूहों के बीच कोशिका झिल्ली ।
Abstract
सेल भूतल इंजीनियरिंग मेजबान प्रतिरक्षा हमले से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा कर सकते हैं । यह भी भ्रष्टाचार समारोह और अस्तित्व के बाद प्रत्यारोपण में सुधार करने के लिए सेलुलर परिदृश्य को फिर से आकार कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए एक ultrathin हेपरिन-शामिल starPEG (एेसी-खूंटी) nanocoating का उपयोग अग्नाशय के टाप की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करने के लिए करना है । अग्नाशय टाप भूतल इंजीनियरिंग के लिए एेसी-खूंटी nanocoating उत्पन्न करने के लिए, हेपरिन succinimidyl succinate (हेपरिन-एन एच एस) पहली बार n-(3-carboxylate dimethylamino)-nका उपयोग कर अपने propyl समूहों के संशोधन द्वारा संश्लेषित किया गया था-एथिल carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) । इसके बाद एेसी-खूंटी मिश्रण से crosslinking का गठन किया गया जो अमीनों के अंतिम-कार्यात्मक आठ-सशस्त्र starPEG (starPEG-(NH2)8) और हेपरिन-एन. एस. आई. टाप सतह कोटिंग के लिए, माउस टाप collagenase पाचन और ढाल Histopaque का उपयोग कर शुद्धि के माध्यम से अलग थे । पृथक टाप तो 10 मिनट के लिए बर्फ ठंड एेसी-खूंटी समाधान के साथ इलाज किया गया आबंध एन एच एस और टाप सेल झिल्ली के अमीन समूहों के बीच बाध्यकारी अनुमति देते हैं । एेसी-खूंटी के साथ Nanocoating न्यूनतम घुमड़ कर टाप साइज और वॉल्यूम और heparinization के साथ साथ टाप की एेसी-खूंटी से टाप प्रत्यारोपण के दौरान तत्काल खून की मध्यस्थता वाली भड़काऊ प्रतिक्रिया भी कम हो सकती है । यह "आसान करने के लिए अपनाने" दृष्टिकोण सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना रहने वाले कोशिकाओं की सतह इंजीनियरिंग के लिए पर्याप्त हल्के है । यह देखते हुए कि हेपरिन एकाधिक साइटोकिंस के लिए बाध्यकारी संबंध दिखाया गया है, एेसी-खूंटी nanocoating भी एक खुला मंच है कि असीमित कार्यात्मक जैविक मध्यस्थों के शामिल होने और सेल सतह रहने के लिए बहु स्तरित सतहों प्रदान करता है bioengineering.
Introduction
कोशिका-आधारित उपचारों की चिकित्सीय प्रभावकारिता कम सेल प्रतिधारण और गरीब अस्तित्व1,2द्वारा सीमित है । आदेश में सेल उपचार के परिणाम में सुधार करने के लिए, सेल भूतल इंजीनियरिंग via एंजाइमी हेरफेर, पेप्टाइड विकार, bioorthogonal रसायन विज्ञान और भौतिक encapsulation के साथ3,4शोषण किया गया है, 5,6,7,8,9,10. वर्तमान प्रोटोकॉल एक ultrathin हेपरिन-शामिल starPEG (हेपरिन-खूंटी) सेल सतह के लिए nanocoating लागू करने से एक "आसान-अपनाने" विधि का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करने के लिए करना है । अग्नाशय के टाप की सतह इंजीनियरिंग आइलेट्स के टाप के विषम प्रकृति और वर्तमान नैदानिक टाप ट्रांसप्लांटेशन के दिखानेवाला परिणामों के कारण एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रस्तुत किया गया था.
दरअसल, नैदानिक टाप प्रत्यारोपण वर्तमान में यकृत पोर्टल नस में पृथक टाप के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा किया जाता है और इस प्रक्रिया के कारण दाता सामग्री और कम चिकित्सकीय प्रभावकारिता की कमी के चुनिंदा रोगियों के लिए ही उपलब्ध है 11. परम्परागत रूप से, alginate को टाप encapsulation और सतह संशोधन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया गया जैव माल है, हालांकि यह alginate और भड़काऊ संबंधी फाइब्रोसिस12की रासायनिक अस्थिरता के कारण आदर्श से कम है, 13. इसके अलावा, टाप के प्राकृतिक आकार की तुलना में है कि १०० से २०० µm के बीच पर्वतमाला, alginate-टाप microcapsules बड़ा कर रहे हैं, ४०० और ८०० µm, जो ऑक्सीजन की शारीरिक प्रसार दूरी से अधिक के बीच लेकर । क्षेऽ टाप encapsulation यानी, टाप की मात्रा के महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना encapsulating टाप, फिर विकसित किया गया । इस प्रकार, खूंटी, tetrafluoroethylene, सिलिकॉन झिल्ली या बहु स्तरित nanocoating से बना nanomembranes का जमाव (भी "परत द्वारा परत के रूप में जाना" [LBL] तकनीक) की सूचना दी गई है, में सुधार के परिणामस्वरूप इन विट्रो टाप अस्तित्व14 ,15,16,17,18, हालांकि LBL दृष्टिकोण अक्सर व्यापक टाप एकाधिक परतों के जमाव के लिए अवधि सौंपने की आवश्यकता है, जो टाप व्यवहार्यता समझौता हो सकता है . इसके अलावा, nanomembranes की अस्थिरता है कि इलेक्ट्रोस्टैटिक या आबंध के बीच परस्पर झिल्ली परतों या hydrophobic बातचीत और nanomembranes और टाप सतह के बीच बातचीत पर निर्भर करता है भी चिंताओं उठाती9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
intraportal टाप ट्रांसप्लांटेशन के चिकित्सीय परिणाम encumbers एक और सीमित कारक है तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया (IBMIR) रक्त के साथ प्रत्यारोपित टाप के सीधे संपर्क की वजह से, प्लेटलेट एकत्रीकरण में जिसके परिणामस्वरूप, जमावट और प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रभाव या अवांछित सेलुलर सक्रियण9. इन समस्याओं को हल करने के लिए, स्टार के आकार का पॉलीथीन ग्लाइकोल (starPEG) से बना एक अल्ट्रा-थिन nanocoating को टाप हाउसिंग सामग्री के रूप में अपनी स्थापित असंगति और बहुमुखी प्रतिभा के लिए तैयार किया गया था । हेपरिन, एक अत्यधिक sulphated glycosaminoglycan, इसके विरोधी भड़काऊ, विरोधी nanocoating गुण और प्रो-कौयगुलांट विकास कारकों की भर्ती द्वारा vascularization को सुविधाजनक बनाने की क्षमता के लिए starPEG angiogenic में शामिल किया गया था22, 23.
Protocol
1. हेपरिन-शामिल Starpeg Nanocoating का निर्माण
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हेपरिन succinimidyl succinate का संश्लेषण (हेपरिन-एन एच एस)
- बाहर हेपरिन के ०.६९ ग्राम वजन और बर्फ ठंडा जल के २.० मिलीलीटर में भंग ।
- एन एच एस के ०.२३ ग्राम बाहर वजन और एक गोल नीचे कुप्पी में बर्फ ठंडा पानी की ०.५ मिलीलीटर में भंग ।
- EDC के ०.७७ g बाहर वजन और एक गोल नीचे कुप्पी में बर्फ ठंडा पानी की ०.५ मिलीलीटर में भंग ।
- एक गोल नीचे कुप्पी में एन एच एस और EDC समाधान मिलाएं । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर मिश्रित समाधान छोड़ दें ।
- ५,०३१ x g पर edc एन एस मिश्रण 10 मिनट के लिए अतिरिक्त edc और एन एच एस हटाने के लिए ।
- मिश्रण समाधान करने के लिए ठंड इथेनॉल के 30 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ५,०३१ x g पर केंद्रापसारक ।
- दोहराएं दो बार ।
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starPEG-हेपरिन nanocoating की तैयारी
- 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 से एक गोल नीचे कुप्पी के १.० मिलीलीटर जोड़ें ।
- 10% (w/v) हेपरिन के ०.६७ मिलीलीटर जोड़ें-एक ही दौर नीचे कुप्पी के लिए एन एच एस ।
- starPEG के मिश्रित समाधान प्लेस-(NH2)8 और हेपरिन-25 ° c में एक मशीन में एन एच 20 मिनट के लिए चिपचिपापन के साथ एक स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए ।
नोट: प्रयोगों के लिए जिसमें फ्लोरोसेंट लेबल हेपरिन (FAM-हेपरिन) की आवश्यकता थी, निर्माण प्रक्रिया को छोड़कर एक ही है कि स्टार-खूंटी-(एनएच2)8 में भंग किया गया था पानी के साथ पूरक 5 (6)- carboxyfluorescein एन-succinimidyl एस्टर ०.१% (दाढ़ रेश्यो) ऑफ़ starPEG-(NH2)8. )
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हेपरिन के लक्षण-खूंटी nanocoating द्वारा रूपान्तर बदल अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (FT-IR)
- शुरू करने से पहले, कुल्ला agate मोर्टार, मूसल और गोली डिवाइस (13 मिमी के व्यास के साथ छोटे डिस्क) एसीटोन और जल के साथ । उपयोग करने से पहले एक ओवन में कांच के बाहर की सूखी ।
- मिश्रण लगभग 0.1-1% हेपरिन-200 के साथ खूंटी नमूना-ठीक एसएमआर पाउडर के 250 मिलीग्राम.
- हेपरिन-खूंटी और agate मोर्टार में एसएमआर मिश्रण प्लेस और पतले 2 µm के व्यास के साथ छोटे छर्रों में चूर ।
- एक गोली उपकरण में मिश्रण स्थानांतरण । उच्च संपीड़न बल लागू करें (8 टी/1 के लिए एक निर्वात में2सेमी)-2 मिनट के लिए पारदर्शी छर्रों फार्म ।
- धीरे गोली उपकरण से दूर नमूना छर्रों खींचो. सावधान रहना भी मुश्किल नहीं खींच तो दरारें नहीं झेलना.
- नमूना छर्रों स्थानांतरण बहुत ध्यान से एक रूपान्तर के लिए नमूना रासायनिक संरचना का निर्धारण करने के लिए अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोप को बदलने ।
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स्कैन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा हेपरिन-खूंटी nanocoating के आंतरिक छिद्रित संरचनाओं की परीक्षा (SEM)
- निम्न कार्यविधियों के लिए, मानक ४८-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट और पिपेट तैयार करें ।
- पिपेट हेपरिन-खूंटी copolymer समाधान एक ४८ के कुओं में अच्छी तरह से संस्कृति की थाली ।
- पर प्लेट फ्रीज-८० ° c 24 घंटे के लिए
- Lypophilize-५० ° c वैक्यूम वातावरण (०.१ Pa) में 24 घंटे के लिए नमूने पर ।
- एक एल्यूमीनियम ठूंठ के चिपचिपा सतह भर में नमूने फैला ।
- कोट सोने के साथ नमूनों और स्कैन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करने के लिए आंतरिक छिद्रपूर्ण संरचनाओं का निरीक्षण ।
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परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा हेपरिन-खूंटी nanocoating सतह की परीक्षा
- पिरांहा समाधान (७०% एच2तो4, 30% एच2ओ2) के साथ साफ सिलिका ग्लास स्लाइड ४० मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर ।
- 10 मिनट के लिए और फिर टोल्यूनि में 10 मिनट के लिए मेथनॉल में स्लाइड Sonicate ।
- वैक्यूम सुखाने के द्वारा स्लाइड को सुखाएं ।
- स्लाइड को खूब धोएं 3-aminopropyl-triethoxysilane सॉल्यूशन (टोल्यूनि में 2%), धीरे से हिलाएं ।
- 10 मिनट के लिए मेथनॉल में स्लाइड Sonicate फिर 10 मिनट के लिए टोल्यूनि में ।
- एक मानक पिपेट का उपयोग कर स्लाइड की सतह भर में 3% हेपरिन-खूंटी समाधान के १०० µ एल प्लेस ।
- हेपरिन की सतह की जांच एक परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप के तहत खूंटी (50 की एक गुंजयमान आवृत्ति-80 kHz, ०.३५० एन एम 21 के बल निरंतर, ६०० एनएम के टिप त्रिज्या) ।
2. हेपरिन-खूंटी Nanocoating के साथ माउस टाप सरफेस इंजीनियरिंग
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हेपरिन-खूंटी nanocoating के साथ माउस टाप भूतल कोटिंग
- collagenase पाचन और histopaque ढाल शुद्धि द्वारा माउस टाप निकालें के रूप में पहले जौव19में सूचना दी ।
- Handpick २०० एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए टाप ।
- जोड़ें ५०० µ के टाप करने के लिए पंजाब के एल और 1 मिनट के लिए ५०३ x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant दूर ले जाओ और हेपरिन-खूंटी समाधान के २५० µ एल जोड़ने और 10 min. पिपेट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखने के लिए और नीचे टाप हेपरिन-खूंटी समाधान के साथ अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- 1 मिनट के लिए ५०३ x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant को हटाएं और पंजाब के ५०० µ l को जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
- 1 मिनट के लिए ५०३ x g पर केंद्रापसारक और supernatant को दूर करने और आगे उपयोग के लिए टाप रखने के लिए । माउस हेपरिन के साथ लेपित टाप की परीक्षा के लिए-खूंटी, FAM-हेपरिन-खूंटी इन चरणों का पालन टाप कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
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माउस FAM-हेपरिन-खूंटी nanocoating के साथ लेपित टाप की परीक्षा
- RPMI १६४० के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें लेपित टाप करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक और एक गैर आरोप बाँझ बैक्टीरियल संस्कृति पकवान में इन टाप स्थानांतरण ।
- एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत FAM-हेपरिन-खूंटी nanocoating-लेपित टाप के आकृति विज्ञान और प्रतिदीप्ति संकेतों का निरीक्षण करें ।
3. हेपरिन के फंक्शन-खूंटी लेपित माउस गैर लेपित टाप की तुलना में टाप
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हेपरिन की व्यवहार्यता-खूंटी लेपित माउस टाप
- हेपरिन-खूंटी लेपित माउस टाप के 20 Handpick और उंहें एक ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के एक कुआं में जगह है ।
- एक अच्छी तरह के लिए 20 हेपरिन-खूंटी लेपित माउस टाप के साथ 10 कुओं की कुल भरें ।
- Handpick 20 गैर कोट नियंत्रण टाप के और उंहें एक ही ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के एक कुआं में जगह है ।
- प्रत्येक कुआं के लिए 20-कोट नियंत्रण टाप के साथ कुल 10 कुओं को भरें ।
- RPMI १६४० के एक कुआं में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के २०० µ एल रखो ९६ अच्छी तरह से थाली है कि टाप शामिल है और 14 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखने के ।
- टाप कल्चर मीडिया को हर 2 दिन में बदलें ।
- संस्कृति में 14 दिनों के अंत में एक जीवित/मृत धुंधला किट के साथ टाप का इलाज और एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मनाया ।
- गणना PI+ (लाल) कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक टाप एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के अंतर्गत.
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Revascularization के हेपरिन-खूंटी लेपित माउस इन विट्रो में टाप
- पूर्व शांत संस्कृति प्लेट और पिपेट सुझावों का उपयोग करने से पहले कम से कम 12 एच सहित सभी प्रयोगात्मक प्लास्टिक ।
- एक ठंडा पैड पर एक 24 अच्छी तरह से जगह प्लेस । जोड़ें २५० बर्फ ठंडा विकास कारक के µ एल-एक 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से कम Matrigel । 4 डिग्री सेल्सियस पर लेपित 24 अच्छी तरह से थाली कम से 30 मिनट के लिए रखें ।
- जबकि मैट्रिक्स समाधान फ्रिज में सेट कर रहा है, trypsinize माउस अग्नाशय टाप endothelial माइल स्वेन 1 (MS1) कोशिकाओं ।
- टिशू कल्चर कुप्पी से सभी कल्चरल मीडिया को निकालें । पंजाब के 5 मिलीलीटर की कुप्पी से कुल्ला ।
- पंजाबियों को हटा दें और trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें । एक मानक मशीन में 3 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- हल्के से कोशिकाओं को अलग करने और सीरम पूरक मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए कुप्पी के नीचे टैप करें ।
- एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant से दूर ले और पंजाब के 5 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
- 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और दूर supernatant ले लो ।
- एक अच्छी तरह से मैट्रिक्स हल-लेपित 24-अच्छी तरह से थाली के ट्यूब और बीज ५०,००० कोशिकाओं में सीरम पूरक DMEM मीडिया जोड़ें ।
- 5 हेपरिन-खूंटी लेपित टाप या एक अच्छी तरह से गैर कोट नियंत्रण टाप जोड़ें ।
- एक अच्छी तरह से प्रति ५०० µ एल की कुल करने के लिए प्रत्येक में सीरम पूरक DMEM मीडिया जोड़ें ।
- 4h और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत 24 एच की मशीन के बाद ट्यूब गठन की पुण्यतिथि ।
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हेपरिन-खूंटी लेपित टाप के ग्लूकोज-प्रेरित इंसुलिन स्राव
नोट: का आकलन करने के लिए कि क्या nanocoating माउस टाप के समारोह को प्रभावित करेगा, ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव हेपरिन-खूंटी लेपित और गैर-कोट टाप का मूल्यांकन किया गया था ।- Handpick 30 हेपरिन-खूंटी लेपित टाप या एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में गैर कोट नियंत्रण टाप । लेपित टाप और विकोट टाप प्रत्येक के लिए 10 ट्यूबों की कुल तैयार करें ।
- 2 mmol/एल ग्लूकोज20 के साथ पूरक शारीरिक नमक समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
नोट: शारीरिक नमक समाधान के नुस्खा के लिए, कृपया 1 तालिकाको देखें । ट्यूब की टोपी मशीन में मशीन के दौरान ढीला रखें । - यथासंभव समाधान निकालें ।
- 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 mmol/l ग्लूकोज के साथ पूरक शारीरिक नमक समाधान के ६०० µ एल जोड़कर टाप को उत्तेजित.
- एक वाणिज्यिक इंसुलिन एलिसा किट का उपयोग करके इंसुलिन एलिसा ठहराव के लिए प्रत्येक ट्यूब से supernatant के २०० µ एल लीजिए ।
Representative Results
हेपरिन-खूंटी nanocoating starPEG के विकार द्वारा संश्लेषित किया गया था-(NH2)8 और हेपरिन का उपयोग EDC और युग्मन एजेंटों के रूप में एन एच एस (चित्रा 1) । हेपरिन-खूंटी nanocoating की रासायनिक संरचना फुट आईआर द्वारा जांच की और के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया था, हेपरिन की विशेषता चोटियों पर देखा जा सकता है 3300 – 3600 सेमी-1, हेपरिन के हाइड्रॉक्सिल समूहों के लिए इसी (चित्रा 2 लाल) । पर चोटी के आयाम में कमी 3300-3600 सेमी-1 (चित्रा 2 नीला) starPEG के बीच विकार का प्रतिनिधित्व करता है-(NH2)8 समूहों और हेपरिन carbonyl समूह के बीच । चोटी १,६५० सेमी-1 के आयाम के बीच carbonyl कंपन खींच भी कम हो गया था से मेल खाती है, succinimidyl succinate और starPEG के अमीन के साथ हेपरिन के carboxylate समूहों के बीच पर्याप्त प्रतिक्रिया का संकेत-(एनएच2) 8. हेपरिन की सतह संरचना-खूंटी nanocoating परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की थी और यह लो एट अलसे दिखाया गया है, nanocoating ऊंचाई में लगभग 30 एनएम और छोटे छिद्रित सुविधाओं के साथ चौड़ाई में 2 µm था (डार्क स्पॉट) लेकर व्यास10में १०० से २०० एनएम के बीच । स्कैन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी से प्राप्त डेटा भी हेपरिन-खूंटी (चित्रा 3) के उच्च परस्पर असुरक्षित संरचना की पुष्टि करें, सुझाव है कि यह सेल के अस्तित्व के लिए vivo में प्रसव के दौरान उपयुक्त हो सकता है ।
अलग माउस टाप की सतह कोटिंग की जांच की और के रूप में चित्रा 4में प्रस्तुत किया गया था, हरी प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाए nanocoating की पतली परत, टाप वॉल्यूम पर स्पष्ट परिवर्तन के कारण बिना लेपित टाप की सतह भर में समान रूप से जमा किया गया था/ कोटिंग के दौरान, यह अपने व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए बर्फ पर टाप रखने के लिए सिफारिश की है । इसी तरह, कोटिंग अवधि, इस मामले में 10 मिनट, भी टाप व्यवहार्यता के रखरखाव की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया था । यह ध्यान देने योग्य है कि nanocoating के बेहतर अवलोकन के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी है कि लेपित टाप के पार वर्गों की जांच के रूप में पहले9की सूचना,16 और अधिक उपयुक्त होगा, हालांकि डेटा उत्पंन किया जाएगा लायक है संस्कृति में टाप रहने के बजाय फिक्स्ड और एम्बेडेड टाप से ।
अस्तित्व और लेपित टाप, टाप revascularization और कार्यों के समारोह के बारे में इन विट्रो मेंमूल्यांकन किया गया है । हेपरिन के लाभकारी गुणों को ध्यान में रखते हुए, टाप सरफेस पर हेपरिन functionalization को संस्कृति में टाप revascularization और इसके फलस्वरूप इसके अस्तित्व की सुविधा मिल सकती है । हमने देखा है कि हेपरिन-खूंटी लेपित माउस टाप संस्कृति में मजबूत टाप व्यवहार्यता प्रदर्शित (चित्रा 5) । काफी अधिक उंनत संवहनी गठन भी टाप endothelial कोशिकाओं (MS1) है कि सह हेपरिन-खूंटी लेपित टाप, लंबी microvessel की तरह संरचनाओं और नेटवर्क की तरह संवहनी संरचनाओं (चित्रा 6 द्वारा संकेत के साथ संस्कृति थे से स्पष्ट था ).
nanocoating प्रक्रिया कोई प्रभाव ग्लूकोज हेपरिन-खूंटी लेपित टाप के इंसुलिन स्रावी क्षमता उत्तेजित खर्च । जब टाप शारीरिक नमक समाधान के साथ perfused थे सभी उपचार समूहों में इंसुलिन स्राव के निम्न स्तर मनाया गया ग्लूकोज के उप-stimulatory स्तर के साथ पूरक (2 mmol/ चित्रा 7). जब टाप एक ऊपर अर्थ का उपसर्ग शारीरिक ग्लूकोज के स्तर (20 mmol/एल ग्लूकोज) के साथ उत्तेजित थे, इंसुलिन स्राव में वृद्धि सभी उपचार समूहों में मनाया गया था ।
चित्रा 1: अग्नाशय टाप सरफेस इंजीनियरिंग के लिए एेसी-खूंटी nanocoating की रासायनिक संरचना । टाप कोटिंग सेल झिल्ली और स्टार-खूंटी-(एनएच2)8के भीतर हेपरिन-एन एच एस और प्राथमिक अमीन के बीच आबंध crosslinking द्वारा हासिल किया गया था । प्रत्येक हेपरिन अणु एकाधिक carboxyl समूह है, जो एक एन एच एस समूह प्रत्येक के लिए संशोधित किया गया है के पास । एन एच एस-सक्रिय carboxyl समूहों के साथ संपर्क के बीच फार्म प्रोटीन की प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया होगी, जो के माध्यम से एेसी-खूंटी और टाप के nanocoating स्थिर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : स्टार-खूंटी के इंफ्रारेड स्पेक्ट्रम-(NH2)8, हेपरिन और सूखे राज्य में एेसी-खूंटी nanocoating । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: सूखे राज्य में एेसी-खूंटी की स्कैन की गई इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपिक छवियाँ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत हेपरिन-खूंटी लेपित टाप के प्रतिनिधि छवियाँ.
हेपरिन पूर्व FAM के साथ बला (हरे रंग में दिखाया गया था) । छवियां १०० टाप के प्रतिनिधि हैं । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: हेपरिन-खूंटी लेपित टाप दमदार टाप व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया । (A) डेटा मतलब के अर्थ ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत, n = ५० प्रति समूह टाप । (ख) जीवित कोशिकाओं को लाल रंग में हरी और मृत कोशिकाओं में दिखाया गया । स्केल बार = १०० µm. images ५० टाप के प्रतिनिधि हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: हेपरिन-पेग nanocoating सोल्यूशन इंट्रा-टाप revascularisation. Matrigel ट्यूब MS1 कोशिकाओं के गठन सह हेपरिन-खूंटी लेपित टाप और गैर कोट नियंत्रण टाप के साथ संस्कृति । छवियां 4 और 24 एच में ले जाया गया था । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: हेपरिन-खूंटी nanocoating टाप इंसुलिन स्राव समारोह पर कोई परिवर्तन नहीं । हेपरिन-खूंटी लेपित टाप और गैर-कोट नियंत्रण टाप (30 प्रत्येक) के संपर्क में थे 2 mmol/l (सफेद पट्टी) या 20 mmol/l (काली पट्टी) ग्लूकोज के लिए 30 मिनट. 20 mmol/L ग्लूकोज के जवाब में इंसुलिन स्राव लेपित और नियंत्रण टाप के बीच तुलनीय था । डेटा मतलब के अर्थ ± मानक त्रुटि के रूप में दिखाया जाता है, n = 10 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
इस अनुच्छेद में, हम एक "आसान करने के लिए अपनाने" सेल सतह एक हेपरिन-hydroxysuccinimide के एनnanocoating समूहों के बीच छद्म bioorthogonal रसायन विज्ञान के माध्यम से starPEG nanocoating शामिल इंजीनियरिंग के लिए दृष्टिकोण और अग्नाशय टाप सतह झिल्ली के अमीन समूह । दरअसल, कोशिका झिल्ली के भीतर एमिनो समूहों अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हैं, और एक परिणाम के रूप में, पहले के अध्ययन के साथ प्राथमिक एमिनो समूहों के बीच बातचीत की सूचना दी है सक्रिय N-hydroxysuccinimidyl (एन एच एस) एस्टर शारीरिक शर्तों के तहत14 ,१६,२१. इसके अलावा, व्यापक अनुसंधान हेपरिन, एक उच्च sulphated glycosaminoglycan और extracellular मैट्रिक्स के महत्वपूर्ण घटक, टाप encapsulation के दौरान के निगमन, बढ़ाया के बाद प्रत्यारोपण के लिए नेतृत्व कर सकता है सूचित किया है revascularization और घटा IBMIR22,23. हेपरिन के खूंटी और multivalent गुणों की असंगति को ध्यान में रखते हुए, हम nanocoating के निर्माण के दौरान अधिक से अधिक हेपरिन लदान के लिए 8 सशस्त्र खूंटी का इस्तेमाल किया । हेपरिन-एन एच एस, जो बाद में टाप सेल झिल्ली पर एनएच2 समूहों के साथ प्रतिक्रिया होगी के साथ संशोधित किया गया था । के बीच आबंध बांड गठन को सक्षम करने से-NH2 (कोशिका झिल्ली के) और-एन एच एस की एेसी-खूंटी, टाप आसानी से होगा "लेपित" हेपरिन-शामिल खूंटी, इस प्रकार एक नैनो-पतली परत (nanocoating) बनाने के अग्नाशय की बाहरी सतह पर Islets.
वर्तमान दृष्टिकोण पहले प्रकाशित तरीकों से अलग है कि यह भी है कि छद्म के बीच में टाप microencapsulation के लिए प्रमुख बहुलक के रूप में खूंटी का चयन-एन एच एस (nanocoating के) और-bioorthogonal के एनएच2 झिल्ली का प्रयोग किया गया । इस तरह के प्लाज्मा के रूप में एक जटिल वातावरण में विशेष रूप से टाप/सेल कोटिंग की स्थिरता को ध्यान में रखते, के बाद प्रत्यारोपण revascularization और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, के बीच गठन-एन एच एस और-एनएच2 की तुलना में अधिक स्थिर होगा hydrophobic खूंटी और सेल झिल्ली24, इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत9,15,24,25,26 या बायोटिन के बीच जैविक संबंध के बीच बातचीत streptavidin14.
इसके अलावा, इसके विपरीत में टाप कोटिंग दृष्टिकोण है कि बहु के लिए विस्तारित टाप हैंडलिंग अवधि के साथ LBL दृष्टिकोण पर निर्भर करता है परत जमाव14,16,25, वर्तमान तकनीक भी ंयूनतम की आवश्यकता है प्रसंस्करण और अलग टाप के बहुत कम कोटिंग अवधि । इन कारकों में से दोनों के बाद प्रत्यारोपण टाप अस्तित्व के लिए आवश्यक है के बाद से टाप व्यवहार्यता अक्सर पहले से ही एंजाइमी पाचन के दौरान क्षतिग्रस्त ECM के कारण टाप अलगाव के बाद समझौता किया है । हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण की एक सीमा है कि, LBL के विपरीत, जो बाहरी कोटिंग की मोटाई में वृद्धि या परत जमाव की संख्या को कम करने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, एेसी-खूंटी nanocoating की मोटाई समय के लिए सिलवाया नहीं जा सकता है ।
इसके अलावा, हल्के हालत के कारण जहां के बीच रासायनिक प्रतिक्रिया-एन एच एस और-एनएच2 जगह लेता है, वर्तमान दृष्टिकोण कोशिका की सतह के लिए लागू है अग्नाशय के टाप तक सीमित नहीं इंजीनियरिंग, लेकिन सबसे सेल थेरेपी । इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि हेपरिन साइटोकिंस और जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की एक सीमा के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है, एेसी-खूंटी nanocoating भी एक खुला मंच है कि असीमित जैव मध्यस्थों के शामिल करने के लिए क्षमता है के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत करता है अधिक जटिल सेल सतह इंजीनियरिंग के लिए इंटरफेस ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान कोष (३१७७०९६८) और आवेदन फाउंडेशन और उंनत प्रौद्योगिकी (17JCZDJC33400) के तियानजिन अनुसंधान कार्यक्रम के वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
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