Denne protokollen har overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer med en heparin-innlemmet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kjemi mellom N– hydroxysuccinimide gruppen av nanocoating og Amin typer Holme cellemembranen.
Cellen overflaten engineering kan beskytte implantert celler fra verten immun angrep. Det kan også omforme mobilnettet landskapet for å forbedre pode funksjon og overlevelse etter transplantasjon. Denne protokollen mål å oppnå overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer med en supertynn heparin-innlemmet starPEG (Hep-PEG) nanocoating. Vil generere Hep-pinne nanocoating bukspyttkjertelen Holme overflaten engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) ble først syntetisert av endring av sin carboxylate grupper med N-(3-dimethylamino propyl) –N’-etyl carbodiimide hydrochloride (EDC) og N– hydroxysuccinimide (NHS). Hep-pinne blandingen ble deretter dannet av crosslinking amino slutten-functionalized åtte bevæpnede starPEG (starPEG-(NH2)8) og Heparin-NHS. Til Holme Overflateforedling ble musa holmer isolert via collagenase fordøyelsen og gradient rensing med Histopaque. Isolerte småøyer ble deretter behandlet med isen kalde Hep-pinne løsning for 10 min å tillate kovalente binding mellom NHS og Amin typer Holme celle membran. Nanocoating med Hep-pinne innebærer minimal endring islet størrelse og volum og heparinization av holmer med Hep-pinne kan også redusere øyeblikkelig blod-mediert inflammatorisk reaksjon under Holme transplantasjon. Denne “lett-å-adoptere” tilnærmingen er mild nok overflate engineering av levende celler uten at cellen levedyktighet. Tatt i betraktning at heparin har vist forpliktende tilhørighet til flere cytokiner, Hep-pinne nanocoating gir også en åpen plattform som muliggjør innlemmelse av ubegrenset funksjonelle biologiske meglere og flerlags overflater for levende celleoverflaten bioteknologi.
Terapeutiske effekten av cellen-basert behandling er begrenset av lave celle oppbevaring og dårlig overlevelse1,2. For å forbedre resultatet av cellen terapi, celle overflaten engineering via enzymatisk manipulasjon, har peptid Bøyning, bioorthogonal kjemi og fysiske innkapsling med biologisk materiale blitt utnyttet3,4, 5,,6,,7,,8,,9,,10. Gjeldende protokollen mål å oppnå overflaten prosjektering av levende celler ved hjelp av en “lett-å-adoptere”-metoden ved å bruke en supertynn heparin-innlemmet starPEG (heparin-PEG) nanocoating til celleoverflaten. Overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer ble presentert som et eksempel på grunn av heterogene natur av holmer Langerhans og nedsettende resultatene av gjeldende kliniske Holme transplantasjon.
Faktisk klinisk Holme transplantasjon utføres nå ved direkte injeksjon av isolerte småøyer i hepatic portalen blodåre, og denne prosedyren er bare tilgjengelig for selektiv pasienter på grunn av knapphet på donor materialer og lav terapeutiske effekten 11. konvensjonelt, alginate har vært den vanligste biomateriale for Holme innkapsling og overflate endring, selv om det er mindre enn ideell på grunn av kjemisk ustabilitet i alginate og provoserende-relaterte fibrose12, 13. Videre er i forhold til naturlige størrelsen av holmer som spenner mellom 100 til 200 µm, alginate-Holme microcapsules større, varierer mellom 400 og 800 µm, som overstiger fysiologiske spre avstanden av oksygen. Conformal Holme innkapsling, dvs., innkapsle holmer uten betydelig endring av Holme volum, og utviklet. Dermed deponering av nanomembranes består av PEG, tetrafluoroethylene, silisium membran eller flerlags nanocoating (også kjent som “lag-på-lag” [LBL] teknikken) er rapportert, noe som resulterer i bedre i vitro Holme overlevelse14 ,15,16,17,18, selv om LBL tilnærming ofte krever omfattende holmer levere periode til deponering av flere lag, noe som kan kompromittere Holme levedyktighet . Videre reiser ustabilitet av nanomembranes som elektrostatisk eller kovalente interaksjoner mellom biomembrane lag eller hydrofobe interaksjoner mellom nanomembranes og Holme overflaten også spørsmål9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En annen begrensende faktor som encumbers terapeutiske utfallet av intraportal Holme transplantasjon er øyeblikkelig blod-mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR) forårsaket av direkte kontakt med implantert holmer med blod, som resulterer i plateaggregering, koagulering og immun bivirkning eller uønsket aktivering9. For å løse disse problemene, var en ultra-tynne nanocoating består av stjerneformet polyetylenglykol (starPEG) forberedt for sin etablerte biocompatibility og allsidighet som Holme boliger materiale. Heparin, en svært sulfaterte glycosaminoglycan, ble også innlemmet i starPEG-nanocoating for anti-inflammatorisk, anti-koagulere egenskaper og evne til rette for endometrial blodkar ved rekruttering pro-angiogenic vekstfaktorer22, 23.
I denne artikkelen viser vi en “lett-å-adoptere” tilnærming for levende celleoverflaten engineering en heparin-innlemmet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kjemi mellom N– hydroxysuccinimide av nanocoating og Amin grupper av bukspyttkjertelen Holme overflaten membran. Faktisk amino gruppene i cellemembranene er svært reaktivt, og som et resultat, tidligere studier har rapportert interaksjoner mellom primære amino grupper med aktivert N– hydroxysuccinimidyl (NHS) ester under fysiologiske forhold14 ,16,21. Videre har omfattende forskning rapportert at innlemmelse av heparin, svært sulfaterte glycosaminoglycan og viktig komponent i den ekstracellulære matrisen, under Holme innkapsling, kan føre til forbedret etter transplantasjon revaskularisering og redusert IBMIR22,23. Vurderer biokompatibilitet av PEG og multivalent egenskaper av heparin brukte vi 8 bevæpnede pinne for maksimal heparin innlasting under fabrikasjon av nanocoating. Heparin ble endret med -NHS, som senere ville reagere med -NH2 grupper på Holme celle membran. Aktiverer kovalent binding dannelsen mellom -NH2 (i celle membran) og -NHS av Hep-pinne, øyene ville være lett “belagt” av heparin-innlemmet PINNEN, dermed danne et nano-tynne lag (nanocoating) på den ytre overflaten av den bukspyttkjertelen holmer.
Den nåværende tilnærmingen er forskjellig fra tidligere publiserte metoder som også valgt pinne som store polymer for Holme microencapsulation at pseudo-bioorthogonal kjemi mellom -NHS (av nanocoating) og -NH2 Holme celle membran ble brukt. Tatt i betraktning at stabiliteten av Holme/mobiltelefon belegg, spesielt i en kompleks virksomhet som plasma, står etter transplantasjon revaskularisering og overlevelse, dannelsen mellom -NHS og -NH2 ville være mer stabil sammenlignet hydrofobe samspillet mellom pinne og cellemembranen24, elektrostatiske interaksjoner9,15,24,25,26 eller biologisk kobling mellom biotin streptavidin14.
Dessuten, i motsetning til Holme krever belegg som baserer seg på LBL tilnærming med utvidet Holme håndtering periode for flerlags deponering14,16,25, nåværende teknikken også minimal behandling og svært kort belegg periode av de isolerte småøyer. Begge disse faktorene er avgjørende for etter transplantasjon Holme overlevelse siden holmer levedyktighet er ofte allerede kompromittert følgende Holme isolasjon på grunn av skadede ECM under enzymatisk fordøyelsen. Imidlertid er en begrensning av nåværende tilnærming at i motsetning LBL, via tykkelsen på den ytre overflaten kan kontrolleres ved å øke eller redusere antall lag deponering, tykkelsen på Hep-pinne nanocoating ikke kan være skreddersydd for tiden.
Videre, på grunn av milde tilstanden der kjemisk reaksjon mellom -NHS og -NH2 finner sted, nåværende tilnærming er aktuelt for levende celle overflaten engineering ikke begrenset til bukspyttkjertelen holmer, men de fleste cellen terapi. I tillegg vurderer at heparin er kjent for å samhandle med en rekke cytokiner og biologisk aktive molekyler, Hep-pinne nanocoating presenterer også en åpen plattform som har potensial for inkorporering av ubegrenset biologiske meglere som grensesnitt for mer komplekse cellen overflaten engineering.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for økonomisk støtte av den nasjonale naturvitenskap midler i Kina (31770968) og Tianjin Research Program av Application Foundation og avansert teknologi (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |