Summary
Denne protokollen har overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer med en heparin-innlemmet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kjemi mellom N- hydroxysuccinimide gruppen av nanocoating og Amin typer Holme cellemembranen.
Abstract
Cellen overflaten engineering kan beskytte implantert celler fra verten immun angrep. Det kan også omforme mobilnettet landskapet for å forbedre pode funksjon og overlevelse etter transplantasjon. Denne protokollen mål å oppnå overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer med en supertynn heparin-innlemmet starPEG (Hep-PEG) nanocoating. Vil generere Hep-pinne nanocoating bukspyttkjertelen Holme overflaten engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) ble først syntetisert av endring av sin carboxylate grupper med N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etyl carbodiimide hydrochloride (EDC) og N- hydroxysuccinimide (NHS). Hep-pinne blandingen ble deretter dannet av crosslinking amino slutten-functionalized åtte bevæpnede starPEG (starPEG-(NH2)8) og Heparin-NHS. Til Holme Overflateforedling ble musa holmer isolert via collagenase fordøyelsen og gradient rensing med Histopaque. Isolerte småøyer ble deretter behandlet med isen kalde Hep-pinne løsning for 10 min å tillate kovalente binding mellom NHS og Amin typer Holme celle membran. Nanocoating med Hep-pinne innebærer minimal endring islet størrelse og volum og heparinization av holmer med Hep-pinne kan også redusere øyeblikkelig blod-mediert inflammatorisk reaksjon under Holme transplantasjon. Denne "lett-å-adoptere" tilnærmingen er mild nok overflate engineering av levende celler uten at cellen levedyktighet. Tatt i betraktning at heparin har vist forpliktende tilhørighet til flere cytokiner, Hep-pinne nanocoating gir også en åpen plattform som muliggjør innlemmelse av ubegrenset funksjonelle biologiske meglere og flerlags overflater for levende celleoverflaten bioteknologi.
Introduction
Terapeutiske effekten av cellen-basert behandling er begrenset av lave celle oppbevaring og dårlig overlevelse1,2. For å forbedre resultatet av cellen terapi, celle overflaten engineering via enzymatisk manipulasjon, har peptid Bøyning, bioorthogonal kjemi og fysiske innkapsling med biologisk materiale blitt utnyttet3,4, 5,,6,,7,,8,,9,,10. Gjeldende protokollen mål å oppnå overflaten prosjektering av levende celler ved hjelp av en "lett-å-adoptere"-metoden ved å bruke en supertynn heparin-innlemmet starPEG (heparin-PEG) nanocoating til celleoverflaten. Overflaten engineering av bukspyttkjertelen holmer ble presentert som et eksempel på grunn av heterogene natur av holmer Langerhans og nedsettende resultatene av gjeldende kliniske Holme transplantasjon.
Faktisk klinisk Holme transplantasjon utføres nå ved direkte injeksjon av isolerte småøyer i hepatic portalen blodåre, og denne prosedyren er bare tilgjengelig for selektiv pasienter på grunn av knapphet på donor materialer og lav terapeutiske effekten 11. konvensjonelt, alginate har vært den vanligste biomateriale for Holme innkapsling og overflate endring, selv om det er mindre enn ideell på grunn av kjemisk ustabilitet i alginate og provoserende-relaterte fibrose12, 13. Videre er i forhold til naturlige størrelsen av holmer som spenner mellom 100 til 200 µm, alginate-Holme microcapsules større, varierer mellom 400 og 800 µm, som overstiger fysiologiske spre avstanden av oksygen. Conformal Holme innkapsling, dvs., innkapsle holmer uten betydelig endring av Holme volum, og utviklet. Dermed deponering av nanomembranes består av PEG, tetrafluoroethylene, silisium membran eller flerlags nanocoating (også kjent som "lag-på-lag" [LBL] teknikken) er rapportert, noe som resulterer i bedre i vitro Holme overlevelse14 ,15,16,17,18, selv om LBL tilnærming ofte krever omfattende holmer levere periode til deponering av flere lag, noe som kan kompromittere Holme levedyktighet . Videre reiser ustabilitet av nanomembranes som elektrostatisk eller kovalente interaksjoner mellom biomembrane lag eller hydrofobe interaksjoner mellom nanomembranes og Holme overflaten også spørsmål9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En annen begrensende faktor som encumbers terapeutiske utfallet av intraportal Holme transplantasjon er øyeblikkelig blod-mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR) forårsaket av direkte kontakt med implantert holmer med blod, som resulterer i plateaggregering, koagulering og immun bivirkning eller uønsket aktivering9. For å løse disse problemene, var en ultra-tynne nanocoating består av stjerneformet polyetylenglykol (starPEG) forberedt for sin etablerte biocompatibility og allsidighet som Holme boliger materiale. Heparin, en svært sulfaterte glycosaminoglycan, ble også innlemmet i starPEG-nanocoating for anti-inflammatorisk, anti-koagulere egenskaper og evne til rette for endometrial blodkar ved rekruttering pro-angiogenic vekstfaktorer22, 23.
Protocol
1. fabrikasjon av Heparin-innlemmet Starpeg Nanocoating
-
Syntese av heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS)
- Veie ut 0,69 g av heparin og løses i 2.0 mL iskald deionisert vann.
- Veie ut 0,23 g NHS og løses i 0,5 mL iskald deionisert vann i en runde bunn kolbe.
- Veie ut 0.77 g EDC og løses i 0,5 mL iskald deionisert vann i en runde bunn kolbe.
- Mix NHS og EDC løsninger i en runde bunn kolbe. La blandet løsningen på benken ved romtemperatur for 30 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge EDC NHS blandingen 5,031 x g i 10 min å fjerne overflødig EDC og NHS.
- Legge til 30 mL kaldt etanol blanding løsningen og sentrifuge 5,031 x g for 10 min.
- Gjenta to ganger.
-
Utarbeidelse av starPEG-heparin nanocoating
- Tilsett 1,0 mL av 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 til en runde bunn kolbe.
- Legg 0.67 mL 10% (w/v) heparin-NHS til samme runde bunn kolbe.
- Sett blandet løsning av starPEG-(NH2)8 og heparin-NHS i en inkubator ved 25 ° C for 20 min å få en klar løsning med viskositet.
Merk: For eksperimenter der fluorescently merket heparin (FAM-heparin) var nødvendig, fabrikasjon fremgangsmåten er de samme bortsett fra at star - PEG-(NH2)8 ble oppløst i deionisert vann med 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (molar ratio) starPEG-(NH2)8. )
-
Karakteristikk av heparin-pinne nanocoating av Fourier transformere infrarødspektroskopi (FT-IR)
- Før du starter, skyll agat mørtel, pistil og pelleting enheten (lite plater med diameter på 13 mm) med aceton og deionisert vann. Tørr glass i en ovn før bruk.
- Mix ca 0,1 til 1% heparin-pinne utvalg med 200-250 mg KBr pulver.
- Plasser heparin-pinne og KBr blanding i agat mørtelen og fint pulverisere i små pellets med diameter på 2 µm.
- Overføre blandingen inn i en pelleting enhet. Bruk høy komprimering kraft (8 T/cm2) i et vakuum i 1-2 min til gjennomsiktig pellets.
- Trekk forsiktig utvalg pellets fra pelleting enheten. Pass på at du ikke dra for hardt så ikke å pådra sprekker.
- Overføre eksempel pellets nøye til en Fourier transformere infrarød spektroskopisk å finne eksempel kjemiske strukturen.
-
Undersøkelse av de interne porøse strukturene i heparin-pinne nanocoating av skannede elektronmikroskop (SEM)
- For følgende fremgangsmåter forberede standard 48-vel celle kultur plate og pipetter.
- Pipetter heparin-pinne copolymer løsningen i brønnene av en 48-brønnen plate.
- Fryse platen ved-80 ° C i 24 timer.
- Lypophilize eksempler på-50 ° C i vakuum miljø (0,1 Pa) for 24 timer.
- Spredt prøver over sticky overflaten av en aluminium-stub.
- Coat prøvene med gull og observere under skannede elektronmikroskop å observere interne porøse strukturer.
-
Undersøkelse av heparin-pinne nanocoating overflaten av atomic force mikroskopi (AFM)
- Rengjør silica glass lysbilder med piranha løsning (70% H2SO4, 30% H2O2) på 80 ° C i 40 minutter.
- Sonicate lysbildene i metanol i 10 min og deretter i toluen i 10 min.
- Tørr lysbildene ved vakuumtørking.
- Vask lysbildene med mange 3-aminopropyl-triethoxysilane løsning (2% i toluen), riste forsiktig.
- Sonicate lysbildene i metanol for 10 min da i toluen i 10 min.
- Sted 100 µL av 3% heparin-pinne løsning over overflaten på lysbildene ved hjelp av en standard pipette.
- Undersøke overflaten av heparin-pinne under en atomic force mikroskop (en resonans frekvensen av 50-80 kHz, tvinge konstant 0.350 N m 21, tips radius av 600 nm).
2. musen Holme overflaten Engineering med Heparin-pinne Nanocoating
-
Musen Holme overflate belegg med heparin-pinne nanocoating
- Ekstra musen holmer av collagenase fordøyelsen og histopaque gradient rensing som tidligere rapportert i JoVE19.
- Håndplukke 200 holmer under disseksjon mikroskop slik 1,5 mL.
- Legg til 500 µL av PBS holmer og sentrifuge 503 x g for 1 min.
- Ta av nedbryting og legge til 250 µL av heparin-pinne løsningen og holde blandingen på is 10 min. Pipette opp og ned for å tillate holmer å blande frisk med heparin-pinne løsningen.
- Sentrifuger 503 x g for 1 min.
- Fjern nedbryting og legge 500 µL av PBS. Pipetter opp og ned for å blande godt.
- Sentrifuge 503 x g for 1 min og fjern nedbryting og holde holmer for videre bruk. For undersøkelse av musen holmer belagt med heparin-pinne, ble FAM-heparin-pinne brukt for Holme belegg følgende fremgangsmåte.
-
Undersøkelse av musen holmer belagt med FAM-heparin-pinne-nanocoating
- Legg til 1-2 mL RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovin serum til belagt øyene og overføre disse holmer i en ikke-ladet sterilt bakteriell kultur parabol.
- Observere morfologi og fluorescens signaler av FAM-heparin-pinne nanocoating-belagt holmer under en invertert fluorescens mikroskop.
3. funksjon av Heparin-pinne belagt musen holmer sammenlignet med ikke-belagt holmer
-
Levedyktigheten til heparin-pinne belagt musen holmer
- Håndplukker 20 av heparin-pinne belagt musen holmer og plassere dem i en brønn av en 96-brønns celle kultur plate.
- Fyll totalt 10 med 20 heparin-pinne belagt musen holmer for hver brønn.
- Håndplukker 20 av noncoated kontroll holmer og plassere dem i en brønn av samme 96-brønns celle kultur plate.
- Fyll totalt 10 med 20 noncoated kontroll holmer for hver brønn.
- Sett 200 µL av RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovin serum i hver brønn av 96-brønns plate som inneholder holmer og opprettholde i kultur for 14 dager.
- Erstatte Holme kultur medier hver 2 dager.
- Behandle øyene med en live/døde flekker kit på slutten av 14 dager i kultur og observert under en invertert fluorescens mikroskop.
- Telle PI+ (rød) celler i hver Holme under en invertert fluorescens mikroskop.
-
Revaskularisering av heparin-pinne belagt musen holmer i vitro
- Pre-avkjøle alle eksperimentelle plast inkludert kultur plate og pipette tips minst 12 h før bruk.
- Plass et 24-godt sted på en kjøling pad. Legge til 250 µL av is kaldt vekst faktor-reduserte Matrigel i hver brønn av en 24-vel celle kultur plate. Plass belagt 24-vel platen på 4 ° C i minst 30 min.
- Mens matrix løsningen er å sette i kjøleskapet, trypsinize musen bukspyttkjertelen Holme Mile Sven 1 (MS1) endotelceller.
- Fjern alle kultur medier fra vev kultur kolbe. Skyll flasken 5 mL av PBS.
- Fjern PBS og legge 3 mL trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 3 minutter i en standard inkubator.
- Lett trykk bunnen av flasken koble cellene og legge 5 mL av serum-supplert media.
- Samle cellene i en 15 mL sentrifuge rør og sentrifuge 1000 x g for 5 min.
- Ta av nedbryting og legge 5 mL av PBS. Pipetter opp og ned for å blande godt.
- Sentrifuge 1000 x g i 5 min og ta av nedbryting.
- Legg serum-supplert DMEM media inn i røret og frø 50.000 celler i hver brønn av matrix-løsning-belagt 24-vel plate.
- Legge til 5 heparin-pinne belagt holmer eller noncoated kontroll holmer i hver brønn.
- Legge til serum-supplert DMEM media i hver brønn totalt 500 µL per brønn.
- Observere tube formasjon etter 4h og 24-timers inkubasjon under lys mikroskop.
-
Glukose-stimulert insulinsekresjon av heparin-pinne belagt holmer
Merk: For å vurdere om nanocoating vil påvirke funksjonen til musen holmer, glukose-stimulert insulinsekresjon av heparin-pinne belagt og noncoated holmer ble vurdert.- Håndplukke 30 heparin-pinne belagt holmer eller noncoated kontroll holmer i en 1,5 mL tube. Forbered totalt 10 rør for belagt holmer og noncoated holmer.
- Legg 1 mL av fysiologisk saltløsning supplert med 2 mmol/L glukose20 og ruge ved 37 ° C i 2 timer.
Merk: For oppskriften av fysiologiske salt løsning, se tabell 1. Holde hetten av rør løs under inkubasjonen i inkubator. - Fjerne løsningen så mye som mulig.
- Stimulere holmer ved å legge til 600 µL av fysiologisk saltløsning supplert med 20 mmol/L glukose på 37 ° C i 30 min.
- Samle 200 µL av nedbryting fra hver rør for insulin ELISA kvantifisering bruker en kommersiell insulin ELISA kit.
Representative Results
Heparin-pinne nanocoating ble syntetisert av Bøyning av starPEG-(NH2)8 og heparin av EDC og NHS kopling agenter (figur 1). Kjemisk struktur av heparin-pinne nanocoating ble undersøkt av FT-IR og som vist i figur 2, karakteristiske toppene av heparin kunne observeres på 3.300-3600 cm-1, tilsvarer hydroksyl gruppene av heparin (figur 2 rød). Nedgangen i amplituden til toppen på 3.300-3600 cm-1 (figur 2 blå) representerer Bøyning mellom starPEG-(NH2)8 amid grupper og heparin karbonyl gruppe. Amplituden til toppen 1650 cm-1 tilsvarer amid karbonyl strekk var også redusert, indikerer nok reaksjon mellom carboxylate gruppene av heparin med succinimidyl succinate og Amin starPEG-(NH2) 8. overflatestruktur av heparin-pinne nanocoating ble undersøkt av atomic force mikroskopi og vises fra Lou et al., nanocoating var ca 30 nm i høyde og 2 µm i bredde med små porøse funksjoner (mørke flekker) mellom 100 til 200 nm i diameter10. Data fra skannede elektronisk mikroskopi også bekrefte svært sammenvevd porøse strukturen i heparin-pinne (Figur 3), antyder at det kunne være egnet for cellen overlevelse i vivo underveis.
Overflatebelegg isolert musen holmer ble undersøkt og som presenteres i Figur 4, tynt lag av nanocoating, vises som grønne fluorescens ble avsatt jevnt over overflaten på bestrøket holmer uten forårsaker tydelig endringer på Holme volumstørrelsen. Under belegg anbefales det å holde ligger på isen for å opprettholde sin levedyktighet. Tilsvarende var belegg perioden, 10 min i dette tilfellet også optimalisert slik at vedlikehold av holmer levedyktighet. Det er verdt å merke seg at for bedre observasjon av nanocoating, elektronmikroskop som undersøker tverrsnitt av belagt holmer tidligere rapportert9,16 ville være mer hensiktsmessig, selv om dataene, genereres fra faste og innebygde holmer i stedet for levende holmer i kultur.
Om overlevelse og funksjon av belagt holmer, Holme revaskularisering og funksjoner i har vært vurdert i vitro. Vurderer de fordelaktige egenskapene av heparin, kan heparin functionalization på Holme overflaten forenkle Holme revaskularisering kultur og følgelig overlevelse. Vi har observert at heparin-pinne belagt musen holmer utstilt robust Holme levedyktighet i kultur (figur 5). Betydelig mer avansert vaskulær formasjon var også tydelig fra Holme endotelceller (MS1) som var co kultivert med heparin-pinne belagt holmer, angitt med langstrakt microvessel-lignende strukturer og nettverk som vaskulære strukturer (figur 6 ).
Nanocoating prosessen påløper ingen effekten glukose-stimulert insulin sekretoriske evne av heparin-pinne belagt holmer. Lavt nivå av insulinsekresjon ble observert i alle behandlingsgrupper når holmer var parfyme med fysiologisk saltløsning supplert med sub-stimulatory nivået av glukose (2 mmol/L; Figur 7). Når holmer ble stimulert med et supra fysiologiske glukose (20 mmol/L glukose), ble det observert økning i insulinsekresjon i alle behandlingsgrupper.
Figur 1: Kjemiske strukturen til Hep-pinne nanocoating bukspyttkjertelen Holme overflaten engineering. Holme belegg ble oppnådd av kovalente crosslinking mellom heparin-NHS og primære aminer i cellemembranen og star - PEG-(NH2)8. Hver heparin molekyl har flere carboxyl grupper som ble endret til å ha en NHS gruppe hver. NHS-aktivert carboxyl gruppene vil reagere med primære aminer protein skjemaet amid forbindelser, via nanocoating Hep-pinne og holmer har stabilisert seg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Infrarød spekteret av star - PEG-(NH2)8, heparin og Hep-pinne nanocoating i tørket staten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skannet elektronisk mikroskopi bilder av Hep-pinne tørket tilstanden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant bilder av heparin-pinne belagt holmer under fluorescens mikroskop.
Heparin var pre merket med FAM (vist i grønt). Bilder er representant for 100 holmer. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Heparin-pinne belagt holmer utstilt robust Holme levedyktighet. (A) Data som mean± betyr, n standardfeil = 50 holmer per gruppe. (B) levende celler ble vist i grønt og døde celler i rødt. Skala bar = 100 µm. bilder er representant for 50 holmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Heparin-pinne nanocoating forenkler intra-Holme revaskularisering. Matrigel rør dannelsen av MS1 celler co kultivert med heparin-pinne belagt holmer og noncoated kontroll holmer. Bildene ble tatt på 4 og 24 h. skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Heparin-pinne nanocoating innebærer ingen endring Holme insulin sekresjon funksjonen. Heparin-pinne belagt holmer og noncoated kontroll holmer (30 hver) ble utsatt for 2 mmol/L (hvite linjen) eller 20 mmol/L (svart bar) glukose for 30 min. Insulin sekret Grunna 20 mmol/L glukose var sammenlignbar mellom belegg og kontrollere holmer. Dataene vises som gjennomsnittlig ± standardfeil for midler, n = 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I denne artikkelen viser vi en "lett-å-adoptere" tilnærming for levende celleoverflaten engineering en heparin-innlemmet starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kjemi mellom N- hydroxysuccinimide av nanocoating og Amin grupper av bukspyttkjertelen Holme overflaten membran. Faktisk amino gruppene i cellemembranene er svært reaktivt, og som et resultat, tidligere studier har rapportert interaksjoner mellom primære amino grupper med aktivert N- hydroxysuccinimidyl (NHS) ester under fysiologiske forhold14 ,16,21. Videre har omfattende forskning rapportert at innlemmelse av heparin, svært sulfaterte glycosaminoglycan og viktig komponent i den ekstracellulære matrisen, under Holme innkapsling, kan føre til forbedret etter transplantasjon revaskularisering og redusert IBMIR22,23. Vurderer biokompatibilitet av PEG og multivalent egenskaper av heparin brukte vi 8 bevæpnede pinne for maksimal heparin innlasting under fabrikasjon av nanocoating. Heparin ble endret med -NHS, som senere ville reagere med -NH2 grupper på Holme celle membran. Aktiverer kovalent binding dannelsen mellom -NH2 (i celle membran) og -NHS av Hep-pinne, øyene ville være lett "belagt" av heparin-innlemmet PINNEN, dermed danne et nano-tynne lag (nanocoating) på den ytre overflaten av den bukspyttkjertelen holmer.
Den nåværende tilnærmingen er forskjellig fra tidligere publiserte metoder som også valgt pinne som store polymer for Holme microencapsulation at pseudo-bioorthogonal kjemi mellom -NHS (av nanocoating) og -NH2 Holme celle membran ble brukt. Tatt i betraktning at stabiliteten av Holme/mobiltelefon belegg, spesielt i en kompleks virksomhet som plasma, står etter transplantasjon revaskularisering og overlevelse, dannelsen mellom -NHS og -NH2 ville være mer stabil sammenlignet hydrofobe samspillet mellom pinne og cellemembranen24, elektrostatiske interaksjoner9,15,24,25,26 eller biologisk kobling mellom biotin streptavidin14.
Dessuten, i motsetning til Holme krever belegg som baserer seg på LBL tilnærming med utvidet Holme håndtering periode for flerlags deponering14,16,25, nåværende teknikken også minimal behandling og svært kort belegg periode av de isolerte småøyer. Begge disse faktorene er avgjørende for etter transplantasjon Holme overlevelse siden holmer levedyktighet er ofte allerede kompromittert følgende Holme isolasjon på grunn av skadede ECM under enzymatisk fordøyelsen. Imidlertid er en begrensning av nåværende tilnærming at i motsetning LBL, via tykkelsen på den ytre overflaten kan kontrolleres ved å øke eller redusere antall lag deponering, tykkelsen på Hep-pinne nanocoating ikke kan være skreddersydd for tiden.
Videre, på grunn av milde tilstanden der kjemisk reaksjon mellom -NHS og -NH2 finner sted, nåværende tilnærming er aktuelt for levende celle overflaten engineering ikke begrenset til bukspyttkjertelen holmer, men de fleste cellen terapi. I tillegg vurderer at heparin er kjent for å samhandle med en rekke cytokiner og biologisk aktive molekyler, Hep-pinne nanocoating presenterer også en åpen plattform som har potensial for inkorporering av ubegrenset biologiske meglere som grensesnitt for mer komplekse cellen overflaten engineering.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for økonomisk støtte av den nasjonale naturvitenskap midler i Kina (31770968) og Tianjin Research Program av Application Foundation og avansert teknologi (17JCZDJC33400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
| 488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
| Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
| Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
| Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
| Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |
References
- Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
- Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
- Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
- Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
- Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
- Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
- Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
- Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
- Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
- Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
- Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
- Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
- Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
- Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
- Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
- Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
- Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
- Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).
