Detta protokoll syftar till att uppnå yta konstruktion av Langerhanska använder ett heparin-införlivade starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellan grupperna N– hydroxysuccinimide av nanocoating och amine grupperna av holme cellmembranet.
Cellen ytbehandlar teknik kan skydda implanterade cellerna från värd immun attack. Det kan också omforma cellulära landskap för att förbättra transplantatfunktion och överlevnaden efter transplantation. Detta protokoll syftar till ytan engineering av Langerhanska använder en ultrathin heparin-införlivade starPEG (Hep-PEG) nanocoating. För att generera den Hep-PEG nanocoating för bukspottskörteln holme ytan engineering, heparin succinimidyl succinat (Heparin-NHS) syntetiserades första gången genom ändring av dess bildas grupper använder N-(3-dimethylamino propyl) –N’-etyl carbodiimide hydroklorid (EDC) och N– hydroxysuccinimide (NHS). Hep-PEG blandningen bildades sedan av crosslinking av amino slutet-functionalized åttaarmad starPEG (starPEG-(NH2)8) och Heparin-NHS. För Holmen ytbeläggning isolerades mus holmar via kollagenas matsmältningen och gradient rening med hjälp av Histopaque. Isolerade Langerhanska behandlades sedan med is kall Hep-PEG lösning för 10 min att tillåta kovalent bindning mellan NHS och amine grupper av islet cell membran. Nanocoating med Hep-PEG medför minimal förändring till islet storlek och volym och heparinization av kobbar och skär med Hep-PEG kan också minska instant blod-medierad inflammatorisk reaktion under ö-transplantation. ”Lätt att anta” är mild nog för surface engineering av levande celler utan att kompromissa med cellernas viabilitet. Med tanke på att heparin har visat affinitet till flera cytokiner, den Hep-PEG nanocoating ger också en öppen plattform som möjliggör införlivandet av obegränsad funktionella biologiska medlare och flera lager ytor för levande cellens yta bioteknik.
Den terapeutiska effekten av cellbaserade terapier begränsas av lågt retention och dålig överlevnad1,2. För att förbättra resultatet av cellterapi, cell surface engineering via enzymatiska manipulation, har peptid konjugation, bioorthogonal kemi och fysiska inkapsling med biomaterial varit exploaterade3,4, 5,6,7,8,9,10. Det nuvarande protokollet syftar till ytan engineering av levande celler med en ”lätt att anta” metod genom att tillämpa en ultrathin heparin-införlivade starPEG (heparin-PEG) nanocoating på cellytan. Yta konstruktion av Langerhanska presenterades här som ett exempel på grund av hur heterogena Langerhanska öar och nedvärderande resultaten av nuvarande klinisk ö-transplantation.
Faktiskt, klinisk ö-transplantation utförs för närvarande av direktinsprutning av isolerade öar i nedsatt portalen ven och proceduren är endast tillgänglig för selektiv patienter på grund av knappa givaren material och låga terapeutiska effekt 11. konventionellt, alginat har varit den vanligaste biomaterial för holme inkapsling och ytmodifiering, även om det är mindre än idealisk på grund av kemisk instabilitet av alginat och inflammatoriska-relaterade fibros12, 13. Jämfört med naturliga storleken på holmar som varierar mellan 100 till 200 µm, är alginat-holme mikrokapslarna dessutom större, mellan 400 och 800 µm, som överstiger fysiologiska diffuserande distansera av syre. Conformal holme inkapsling, dvs., encapsulating holmar utan signifikant förändrad holme volym, utvecklades sedan. Således, nedfall av nanomembranes består av PEG, tetrafluoreten, kisel membran eller flerskiktad nanocoating (även känd som den ”lager-för-lager” [LBL] tekniken) har rapporterats, vilket resulterar i förbättrad in vitro- holme överlevnad14 ,15,16,17,18, även om LBL närma ofta kräver omfattande holmar dela period för nedfall av flera skikt, som kan äventyra holme livskraft . Dessutom väcker instabilitet av nanomembranes som bygger på elektrostatisk eller kovalenta interaktioner mellan biomembrane lager eller hydrofoba interaktioner mellan nanomembranes och holme ytan också oro9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
En annan begränsande faktor som försvårar terapeutiska resultatet av intraportal ötransplantation är omedelbar blod-medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR) orsakad av direkt kontakt av implanterade holmar med blod, vilket resulterar i trombocytaggregation koagulation och immun biverkning eller oönskad cellulär aktivering9. För att lösa dessa problem, var en ultra-tunn nanocoating består av stjärnformade polyetylenglykol (starPEG) förberedd för dess etablerade biokompatibilitet och mångsidighet som holme Kapslingsmaterial. Heparin, ett starkt sulfaterade glykosaminoglykan, inkorporerades också i den starPEG nanocoating för dess antiinflammatoriska, antikoagulantia egenskaper och förmåga att underlätta vaskularisering av rekrytera proangiogena tillväxtfaktorer22, 23.
I denna artikel, vi visar en ”lätt att anta” strategi för levande cellens yta iscensätta ett heparin-införlivade starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal kemi mellan N– hydroxysuccinimide grupperna av nanocoating och Amin grupper av bukspottskörteln holme ytan membran. I själva verket de amino grupperna inom cellmembran är mycket reaktiva och därmed tidigare studier har rapporterat interaktioner mellan primära aminogrupper med aktiverade N– hydroxysuccinimidyl (NHS) ester under fysiologiska betingelser14 ,16,21. Dessutom har omfattande forskning rapporterat att införlivandet av heparin, starkt sulfaterade glykosaminoglykan och en viktig komponent i den extracellulära matrixen, under holme inkapsling, kan leda till förbättrad efter transplantation revaskularisering och minskad IBMIR22,23. Med tanke på biokompatibiliteten av PEG och multivalenta egenskaper av heparin använde vi 8-beväpnade PEG för maximal heparin lastning under tillverkning av nanocoating. Heparin ändrades med -NHS, som därefter skulle reagera med -NH2 grupper på islet cell membran. Genom att aktivera kovalent bindning bildas mellan -NH2 (av cellmembranet) och -NHS av Hep-PEG, holmarna skulle vara lätt ”coated” av heparin-införlivas PEG, således bildar ett nano-tunna lager (nanocoating) på den yttre ytan av den pankreas holmar.
Den nuvarande metoden skiljer sig från tidigare publicerade metoder som också valt PEG som stora polymeren för holme microencapsulation däri pseudo-bioorthogonal kemi mellan -NHS (av nanocoating) och -NH2 av cellen holme membran användes. Med tanke på att stabilitet av holme deponicell beläggning, särskilt i en komplex miljö såsom plasma, är avgörande för efter transplantation revaskularisering och överlevnad, bildandet mellan -NHS och -NH2 skulle bli stabilare jämfört hydrofob interaktion mellan PEG och cellmembranet24, elektrostatiska interaktioner9,15,24,25,26 eller biologiska kopplingen mellan biotin streptividin14.
Dessutom i motsats till islet kräver beläggning tillvägagångssätt som bygger på metoden LBL med utökade holme hantering period för multi-layer nedfall14,16,25, den nuvarande tekniken också minimal bearbetning och mycket kort beläggning under isolerade kobbar och skär. Båda dessa faktorer är avgörande för efter transplantation holme överlevnad eftersom holmar livskraft är ofta redan komprometterad följande ö-isolering på grund av skadade ECM under enzymatisk nedbrytning. En begränsning av den nuvarande metoden är dock att, till skillnad från LBL, via vilken tjocklek av yttre beläggningen kunde kontrolleras genom att öka eller minska antalet lager nedfall, tjockleken på den Hep-PEG nanocoating inte kan skräddarsys för tillfället.
Dessutom på grund av den milda tillstånd där kemisk reaktion mellan -NHS och -NH2 äger rum, den nuvarande metoden är tillämplig för levande cellen ytbehandlar engineering inte begränsad till Langerhanska, men de flesta cellterapi. Dessutom, med tanke på att heparin är kända för att interagera med en rad cytokiner och biologiskt aktiva molekyler, den Hep-PEG nanocoating presenterar också en öppen plattform som har potential för inkorporering av obegränsad biologiska mediatorer som gränssnitt för mer komplexa cell ytbehandlingsteknik.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för ekonomiskt stöd från den nationella naturvetenskapliga medel i Kina (31770968) och Tianjin forskning Program av Application Foundation och Advanced Technology (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |