在这里, 我们展示了定量斑点杂交分析 (QDB) 的详细过程, 通过确定目标蛋白的绝对含量, 帽肌动蛋白, gelsolin 样 (CAPG), 在三种不同的小鼠组织。我们展示了高通量, 方便, 定量应用免疫印迹技术的生物标志物验证在细胞和组织水平。
缺乏方便、定量、高通量的应用免疫印迹方法, 在细胞和组织水平上绝对确定特定蛋白质的含量, 大大阻碍了蛋白质组研究的进展。从目前可用的应用免疫印迹技术获得的结果也是相对的, 防止任何努力将独立研究与蛋白质样品的大规模分析结合起来。在本研究中, 我们演示了定量斑点杂交分析 (QDB) 的过程, 以实现在高吞吐量格式的绝对量化。利用商业上可用的蛋白质标准, 我们能够确定在三种不同的小鼠组织 (肾脏, 脾脏和前列腺) 制备的蛋白质样品中, gelsolin (CAPG) 的上限肌动蛋白的绝对含量, 以及详细的对实验细节的解释。我们建议 QDB 分析作为一种方便、定量、高通量的应用免疫印迹方法, 在细胞和组织水平上对个体蛋白质进行绝对量化。这种方法将极大地帮助生物和生物医学研究的各个领域的标志物验证和通路验证。
随着近年来基因组研究的令人振奋的进展, 生物医学研究领域也见证了蛋白质研究的显著进展。随着生物数据在基因组和蛋白质水平上的不断积累, 利用生物信息学工具分析这些数据已成为生物医学研究的热点。因此, bioinformatical 研究的成功提高了生物和生物医学研究界对更多和更好的数据质量的需求, 只有通过基因组和蛋白水平的技术进步才能实现这一任务。
质谱 (MS) 和应用免疫印迹分析是目前蛋白质分析的两种主流技术。近年来, MS 在蛋白质组研究中占据主导地位, 能够同时对数以千计的个体蛋白质进行分析。应用免疫印迹的技术, 包括西方印迹和斑点杂交, 另一方面, 也发挥了重要作用, 在蛋白质研究, 甚至自其发明1,2,3,4, 5。酶联免疫吸附试验 (ELISA)5、6、7和反相蛋白微阵列 (RPPM)8、9可视为应用免疫印迹的高通量格式分析。然而, 所有这些免疫检测方法, 除了 ELISA, 测量的相对表达水平的特定蛋白质。这些方法的相对性质将成为人口研究的一个真正问题, 因为必须同时进行分析, 防止通过多种分析增加池大小的努力。此外, 这些研究得出的结果仅仅是半定量的, 从而使数据分析中的生物信息学努力复杂化。同时, 尽管 ELISA 非常适合于蛋白质样品的高通量绝对分析, 但由于其结合能力低, 复用10, 这种技术似乎在细胞或组织等复杂环境中遇到挑战。
我们开发了一种适合人口研究的应用免疫印迹方法, 具有方便、高通量、定量的特点, 适用于蛋白质含量的绝对测定, 并命名为该技术的定量斑点杂交分析 (QDB)11。在本研究中, 我们提出了 QDB 分析的详细协议, 并通过测定三种不同的小鼠组织, 包括肾脏, 脾脏, 前列腺的绝对蛋白质含量, 证明了该方法的 CAPG。我们认为这一详细的协议很好地说明了该方法的可行性和方便性, 为如何避免这种方法在实践中的潜在缺陷提供了指导。
除了 ELISA 之外, 目前所有现有的蛋白质分析免疫检测技术中, QDB 分析是在细胞和组织水平上以高通量格式实现特定蛋白质绝对含量的唯一方法。虽然用稳定的同位素标记标准, 质谱法能够实现对少数几种蛋白质的绝对量化, 但这种方法尚未设计出高吞吐量的性能。在本研究中, 我们展示了 QDB 分析的过程, 以达到绝对确定的 CAPG 蛋白水平的小鼠组织, 包括肾脏, 脾脏, 前列腺。CAPG 水平被发现在200到 360 pg/克之间的小鼠肾脏组织, 460 到 650 pg/g 在小鼠脾, 330 至 390 pg/g 在小鼠前列腺组织。
与 ELISA 相比, QDB 分析需要在常规实验室中进行最低限度的努力。首先, QDB 板是一种以硝化膜为基础, 消除酶联免疫吸附的涂层步骤。第二, QDB 分析只需要一个, 而不是两个特定的抗体在三明治 ELISA。第三, 抗硝化膜的高结合能力与 ELISA 板表面相比, 也允许膜经受住严格的洗涤步骤, 通常用于应用免疫印迹分析, 以减少背景干扰。这一特点是非常有用的分析复杂的裂解物制备的细胞和组织。相比之下, 由于 ELISA 板的结合能力相对较低, 在分析复杂的细胞和组织裂解物时, 背景的减少成为了发展过程中的一个真正的挑战。
QDB 分析可以很容易地在任何实验室采用特定抗体的访问。然而, 重要的是要指出, 抗体的特异性是一个相对的术语, 受影响的因素, 包括物种, 组织类型和细胞类型。如图 1A所示, CAPG 抗体在分析小鼠肾脏、脾脏和前列腺中的裂解液时是特异的, 但在分析小鼠肝脏时却变得不特异。事实上, 我们经常发现一种抗体是特定的一种组织类型, 但并不总是特定于其他组织类型从同一物种。因此, 先验的西方印迹分析是必要的, 以确保 QDB 分析的特殊性。事实上, 抗体的相对特异性可能是与 ELISA 分析相关的错误结果的原因, 无论制造公司花了多大力气来确保化验的特异性, 它们都不能用尽所有可能的用户可以选择使用其 ELISA 产品分析的样本类型。
与所有免疫一样, QDB 分析方法的一个潜在问题是商业抗体质量缺乏一致性。即使使用同一公司的抗体的外观质量 (相同的目录号, 等等), 也可能有大的差异, 从一个购买到另一个由于批次到批次的可变性。因此, 除非对抗体的质量有充分的信心, 否则每次购买时重新鉴定抗体是很重要的。
总之, 我们提供了一个详细的协议和一个例子, 当使用 QDB 分析方法, 以实现绝对定量测定特定的蛋白质在组织水平。结果表明, QDB 分析方法对于任何对高通量、定量应用免疫印迹分析都有兴趣的人来说是一种方便的工具。它在细胞和组织水平上实现对特定蛋白质含量的绝对测定的能力也将这种技术与传统的应用免疫印迹技术区别开来。这项功能允许对多种分析结果进行组合和比较, 这是必要的步骤, 特别是在较大的人口研究中, 以及在不久的将来在蛋白质水平上实现相关的关联研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了泰山学者建设工程 (G.T.)、山东优秀青年科学家奖 (ZR2016JL026 G.T.)、中国国家自然科学基金 (31771284、3167070448、81641108)、山东省自然科学基金会 (ZR2016JL026, 2017GSF18103), 山东省科技计划 (J14LE01 和 J15LK03), 烟台科技计划 (2015ZH083) 和滨州医科大学科研基金 (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18),瑞典研究理事会赠款621-2011-4423 和2015-4870。 这项工作还由 “烟台双百人才计划” 和 “烟台高新区蓝海人才计划” 赞助。
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |