Qui dimostriamo un dettagliato processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) determinando il contenuto assoluto di una proteina mirato, tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG), in tre tessuti di diverso tipo di mouse. Dimostriamo un throughput elevato, la tecnica di immunoblot conveniente, quantitativa per la convalida di biomarcatore a livello cellulare e tissutale.
In mancanza di un conveniente, metodo immunoblot quantitativa, high throughput per assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale significativamente ostacola il progresso della ricerca proteomica. Risultati derivati dalle tecniche di immunoblot attualmente disponibili sono anche relativi, impedendo qualsiasi sforzo di combinare studi indipendenti con un’analisi su larga scala di campioni della proteina. In questo studio, dimostriamo il processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) per raggiungere quantificazione assoluta in un formato di throughput elevato. Utilizzando uno standard di proteina commercialmente disponibili, siamo in grado di determinare il contenuto assoluto di tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG) nei campioni della proteina preparato da tre tessuti di diverso tipo di mouse (rene, milza e prostata) insieme ad una dettagliata spiegazione dei dati sperimentali. Vi proponiamo l’analisi QDB come metodo immunoblot conveniente, quantitativi, ad alta velocità effettiva di quantificazione assoluta delle singole proteine a livello cellulare e tissutale. Questo metodo sarà sostanzialmente di aiuto biomarcatore validazione e verifica di percorso nelle varie aree di ricerca biologica e medica.
A fianco con gli avanzamenti emozionanti nella ricerca genomica negli ultimi anni, campo di ricerca biomedica testimonia anche l’avanzamento significativo nella ricerca proteomica. Con l’aumento dell’accumulo di dati biologici a entrambi di genomica e proteomica livelli, utilizzando strumenti bioinformatici per analizzare questi dati è diventata il fulcro della ricerca biomedica in futuro percepibile. Di conseguenza, il successo di bioinformatical ricerca genera domanda di maggiore e migliore qualità dei dati della comunità di ricerca biologica e medica, un’attività può essere raggiunto solo attraverso avanzamento tecnica in genomica e proteomica livelli.
Spettrometria di massa (MS) e l’analisi di immunoblot sono attualmente prevalente due tecniche di analisi della proteina. MS ha dominato la ricerca proteomica negli ultimi anni per consentire l’analisi di migliaia di singole proteine contemporaneamente. Le tecniche basate su immunoblot, tra cui il western blot e macchia del puntino, d’altra parte, hanno anche svolto un ruolo significativo nella ricerca della proteina anche dal suo invenzione1,2,3,4, 5. Enzima collegata dell’immunosorbente (ELISA) dosaggio5,6,7 e fase inversa proteina microarray (RPPM)8,9 può essere considerato il formato elevato throughput di immunoblot analisi. Tuttavia, tutti questi metodi di immunoassay, tranne ELISA, misurano il livello di espressione relativa di una proteina specifica. Il carattere relativo di questi metodi diventerà un vero problema per gli studi di popolazione, come l’analisi deve essere fatto allo stesso tempo, impedendo qualsiasi gli sforzi per aumentare la dimensione del pool attraverso analisi multiple. Inoltre, i risultati derivati da questi studi sono solo semi-quantitativi, complicando così eventuali sforzi di bioinformatica nell’analisi dei dati. Nel frattempo, anche se ELISA è adatta per analisi assoluta throughput elevato di campioni della proteina, questa tecnica sembra di affrontare sfide in ambienti complessi come le cellule o tessuti a causa della sua capacità di legare basso e multiplexing10.
Abbiamo sviluppato un metodo di immunoblot adatto per gli studi di popolazione con le caratteristiche chiave di essere conveniente, ad alta velocità effettiva, quantitativa e adatto per assoluta determinazione del tenore di proteine e denominato questa macchia del puntino quantitativa di tecnica analisi (QDB)11. In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per analisi QDB e dimostrare il metodo di determinazione del contenuto di proteina assoluta di una proteina specifica, CAPG, in tre tessuti del mouse differenti tra cui rene, milza e la prostata. Pensiamo che questo protocollo dettagliato illustra bene la fattibilità e la convenienza di questo metodo e fornire indicazioni su come evitare i trabocchetti potenziali nella pratica di questo metodo.
Tra tutte le tecniche attuali di immunoassay disponibili di analisi della proteina tranne ELISA, analisi QDB sono l’unico metodo per ottenere contenuto assoluto di una proteina specifica a livello cellulare e tessutale in un formato di throughput elevato. Anche se con standard con etichetta isotopo stabile, spettrometria di massa è in grado di raggiungere quantificazione assoluta di alcune proteine, questo metodo non è ancora progettato per alte prestazioni. In questo studio, abbiamo dimostrato il processo di analisi QDB raggiungere assoluta determinazione del livello della proteina CAPG nei tessuti del mouse tra cui rene, milza e la prostata. CAPG livelli sono stati trovati per essere tra 200 a 360 pg/g nei tessuti del rene del mouse, 460 a 650 pg/g in milze del mouse e 330 a 390 pg/g nei tessuti della prostata del mouse.
Rispetto a ELISA, QDB analisi richiede sforzi minimi per essere sviluppato in un normale laboratorio. In primo luogo, la piastra QDB è basato su una membrana di nitrocellulosa per eliminare il passo di rivestimento in ELISA. In secondo luogo, analisi QDB richiede solo uno invece di due anticorpi specifici in un sandwich ELISA. In terzo luogo, la capacità di legame di membrana di nitrocellulosa rispetto la superficie della piastra ELISA consente inoltre la membrana sopportare i passaggi di lavaggio rigorose in genere utilizzati nell’analisi di immunoblot per ridurre le interferenze di sfondo. Questa funzione è molto utile per analizzare complicati lisati preparato dalle cellule e tessuti. Al contrario, a causa della capacità di associazione relativamente basso delle piastre ELISA, la riduzione dello sfondo quando si analizzano complicati lisati cellulari e tissutali diventa una vera e propria sfida nel processo inerente allo sviluppo.
Analisi QDB possono essere adottata facilmente in qualsiasi laboratorio con l’accesso di un anticorpo specifico. Tuttavia, è importante ricordare che la specificità dell’anticorpo è un termine relativo, limitato da fattori tra cui la specie, i tipi di tessuto e delle cellule. Come illustrato nella Figura 1A, CAPG anticorpo è specifico quando si analizzano lisato da prostata, milza e rene del topo e diventa ancora non specifici quando si analizza il fegato di topo. In realtà, abbiamo trovato ordinariamente un anticorpo ad essere specifici per il tipo di un tessuto, ma non sempre specifiche per altro tipo di tessuto dalla stessa specie. Così, l’analisi western blot preventiva è necessario garantire la specificità dell’analisi QDB. Infatti, la relativa specificità dell’anticorpo può essere la causa di risultati falsi, spesso associati all’analisi ELISA, come non importa quanto sforzo dell’azienda di produzione può avere speso per garantire la specificità del test, non può esaurire tutte le possibili tipi di campioni gli utenti possono scegliere di analizzare l’utilizzo dei loro prodotti di ELISA.
Come con tutti i test immunologici, un potenziale problema con il metodo di analisi QDB è la mancanza di coerenza della qualità dell’anticorpo commerciale. Anche se la qualità apparente di un anticorpo dalla stessa azienda (stesso catalogo numero ecc.) viene utilizzato, ci potrebbero essere grandi differenze da un acquisto a un altro a causa della variabilità lotto. Pertanto, a meno che nella qualità dell’anticorpo disponibile è raggiunto piena fiducia, ri-che caratterizza l’anticorpo su ogni acquisto è importante.
In sintesi, forniamo qui un protocollo dettagliato e un esempio quando si utilizza il metodo di analisi QDB per raggiungere assoluta determinazione quantitativa di una proteina specifica a livello tissutale. Indichiamo che il metodo di analisi QDB è un comodo strumento per chiunque sia interessato a resa elevata, l’analisi di immunoblot quantitativa. Sua capacità di raggiungere l’assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale anche distinguere questa tecnica da immunoblot tradizionali tecniche. Questa funzionalità consente la combinazione ed il confronto dei risultati delle analisi multiple, un passo necessario soprattutto nei più grandi studi di popolazione e la realizzazione di studi di associazione relativa al livello della proteina nel prossimo futuro.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato da Taishan studiosi Construction Engineering (G.T.), The Shandong eccellente Young Scientist Award (ZR2016JL026 a G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 e 81641108), Shandong Provinciale naturale la ricerca scientifica (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provincia scienza e tecnologia piano (J14LE01 e J15LK03), plan(2015ZH083) di scienza e tecnologia di Yantai e Binzhou medica ricerca fondi Università scientifica (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), il Consiglio di ricerca svedese concedere 621-2011-4423 e 2015-4870. Questo lavoro è sponsorizzato dal “Yantai doppia cento talenti piano” e “Yantai Hi-Tech Zone Blu oceano talento piano”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |