Hier zeigen wir einen detaillierte Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB) durch die Bestimmung des absoluten Inhalts eines gezielten Proteins Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG), in drei verschiedenen Maus Geweben. Wir zeigen ein hoher Durchsatz, bequem, quantitative Immunoblot-Technik für die Validierung der Biomarker auf zelluläre und Gewebe.
Fehlt eine bequeme, behindert quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode zur absoluten Bestimmung des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene deutlich den Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Ergebnisse von derzeit verfügbaren Immunoblot-Techniken abgeleitet sind auch relativ, Verhinderung jeglicher Bemühungen um unabhängige Studien mit einer umfangreichen Analyse der Proteinproben kombinieren. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB), absolute Quantifizierung in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Mit einem im Handel erhältlichen Protein-Standard, sind wir in der Lage, den absoluten Inhalt der Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG) in Proteinproben von drei verschiedenen Maus-Gewebe (Niere, Milz und Prostata) zusammen mit einer detaillierten bestimmen Erklärung der experimentellen Details. Wir schlagen die QDB-Analyse als bequeme, quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode der absolute Quantifizierung der einzelnen Proteine auf Mobilfunk und Gewebe. Diese Methode wird im wesentlichen Biomarker Validierung und Verifizierung der Weg in den verschiedenen Bereichen der biologischen und biomedizinischen Forschung unterstützen.
Neben Zeugen biomedizinische Forschung mit der aufregenden Zuführungen in der Genomforschung in den letzten Jahren auch den bedeutenden Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Mit zunehmender Anhäufung von biologischen Daten an beiden genomic und Proteomic Ebenen, im Mittelpunkt der biomedizinischen Forschung in der wahrnehmbaren Zukunft geworden mit bioinformatischen Tools, um diese Daten zu analysieren. Folglich, der Erfolg von laborprotokollen Forschung wirft Nachfrage für mehr und bessere Qualität der Daten aus der biologischen und biomedizinischen Forschung, eine Aufgabe kann nur erreicht werden, durch Weiterentwicklung der Technik bei genomischen und Proteomik.
Massenspektrometrie (MS) und Immunoblot Analyse sind derzeit zwei vorherrschenden Techniken der Proteinanalytik. MS hat in den letzten Jahren zur Analyse von Tausenden von einzelnen Proteine gleichzeitig ermöglichen die Proteomic Forschung dominiert. Der Immunoblot-basierten Techniken, einschließlich western-Blot und Dot-Blot, auf der anderen Seite haben auch eine bedeutende Rolle in der Proteinforschung sogar seit seiner Erfindung1,2,3,4gespielt, 5. Enzym verbunden Immunosorbentprobe Assay (ELISA)5,6,7 und umgekehrter Phase Protein Microarray (RPPM)8,9 das Hochdurchsatz-Format der Immunoblot angesehen werden kann Analyse. Aber messen alle diese Immunoassay-Methoden außer ELISA, die relative Expression eines spezifischen Proteins. Die relative Natur dieser Methoden wird ein echtes Problem für Bevölkerungsstudien, wie die Analyse zum gleichen Zeitpunkt getan werden muss, alle Anstrengungen zur Erhöhung der Größe des Pools durch mehrere Analysen zu verhindern. Darüber hinaus sind die Ergebnisse aus diesen Studien abgeleitet nur semi-quantitativen, so komplizieren Bioinformatik Bemühungen in der Datenanalyse. Unterdessen zwar ELISA gut geeignet für hohen Durchsatz absolute Analyse der Proteinproben, scheint diese Technik, Herausforderungen in komplexen Umgebungen wie Zellen oder Gewebe wegen seiner niedrigen Bindungskapazität und multiplexing10entsprechen.
Wir entwickeln ein Immunoblot-Verfahren geeignet für Bevölkerungsstudien mit den wichtigsten Merkmalen, bequem, hoher Durchsatz, quantitative und eignet sich für absolute Bestimmung der Proteingehalt, und nannte diese Technik quantitative Dot-blot Analyse (QDB)11. In dieser Studie wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur QDB-Analyse und die Methode durch die Bestimmung des absoluten Proteingehalts eines spezifischen Proteins CAPG, in drei verschiedenen Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu demonstrieren. Wir denken, dass dieses ausführliche Protokoll auch die Machbarkeit und den Komfort dieser Methode veranschaulicht und geben Hinweise auf die möglichen Fallstricke in der Praxis dieser Methode zu vermeiden.
Unter all den aktuellen verfügbaren Immunoassay Techniken der Proteinanalytik mit Ausnahme von ELISA ist QDB Analyse die einzige Methode zur absoluten Inhalt eines spezifischen Proteins auf Zell- und Gewebe Ebenen in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Obwohl mit stabilen Isotopen-Label Standard, Massenspektrometrie in der Lage, absolute Quantifizierung von ein paar Proteine zu erreichen ist, ist diese Methode noch nicht für hohe Durchsatzleistung entwickelt. In dieser Studie haben wir den Prozess der QDB Analyse zur absoluten Bestimmung der CAPG Protein-Ebene in Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu erreichen. CAPG Ebenen erwiesen sich zwischen 200 bis 360 Pg/g in Maus Niere Geweben, 460 bis 650 Pg/g in Maus Milz und 330 bis 390 Pg/g in Maus Prostata Gewebe.
Im Vergleich zu ELISA, erfordert QDB Analyse minimale Anstrengungen in einem normalen Labor entwickelt werden. Erstens ist die QDB-Platte eine basiert auf eine Nitrocellulose-Membran den Beschichtung Schritt bei ELISA zu beseitigen. Zweitens erfordert QDB Analyse nur eine statt zwei spezifische Antikörper in einem Sandwich ELISA. Drittens ermöglicht die hohe Bindungskapazität der Nitrozellulose-Membran im Vergleich zu der ELISA-Platte-Oberfläche auch die Membran gegen die strengen Waschschritte, die normalerweise in der Immunoblot Analyse verwendet, um den Hintergrund Störungen zu reduzieren. Diese Funktion ist sehr nützlich bei der Analyse von komplizierterer Lysates aus Zellen und Geweben hergestellt. Im Gegensatz dazu wird die Reduzierung des Hintergrunds bei der Analyse der komplizierten Mobilfunk und Gewebe Lysates aufgrund der relativ geringen Bindungskapazität von ELISA-Platten, eine echte Herausforderung in den Entwicklungsprozess.
QDB-Analyse kann problemlos in jedem Labor beim Zugriff auf einen spezifischen Antikörper übernommen werden. Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass die Spezifität des Antikörpers ein relativer Begriff ist, durch Faktoren wie die Art, die Gewebetypen und Zelltypen begrenzt. Wie in Abbildung 1Agezeigt, CAPG Antikörper ist spezifisch, bei der Analyse der lysate aus Mausniere, Milz und Prostata, und noch wird unspezifisch bei der Analyse der Maus Leber. In der Tat fanden wir routinemäßig einen Antikörper spezifisch für einen Gewebetyp, aber nicht immer konkrete zu anderen Gewebetyp von derselben Art sein. So ist die vorherige western-Blot Analyse notwendig, um die Spezifität der QDB Analyse zu gewährleisten. In der Tat kann die relative Spezifität des Antikörpers die falsche Ergebnisse, die oft im Zusammenhang mit ELISA Analyse verursachen wie egal wie viel Mühe die Herstellerfirma kann verbracht haben um die Spezifität des Assays, gewährleisten sie alle möglichen erschöpfen kann nicht Arten von Proben die Benutzer können mit ihren ELISA-Produkten zu analysieren.
Wie bei allen Immunoassays, ist möglicherweise ein Problem mit der QDB-Analyse-Methode die fehlende Konsistenz der Qualität des kommerziellen Antikörpers. Auch wenn die scheinbare Qualität eines Antikörpers aus der gleichen Firma (gleiche Katalog, usw.) wird verwendet, könnte es große Unterschiede von einem Kauf zum anderen aufgrund der Variabilität von Charge zu Charge. Daher, wenn volles Vertrauen in die Qualität der verfügbaren Antikörper erreicht wird, ist neu Charakterisierung des Antikörpers bei jedem Einkauf wichtig.
Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir hier ein detailliertes Protokoll und ein Beispiel, wenn die QDB-Analyse-Methode verwenden, um absolute quantitative Bestimmung eines spezifischen Proteins Ebene der Gewebe zu erreichen. Wir zeigen, dass die QDB-Analyse-Methode ein praktisches Werkzeug für jedermann ist, hoher Durchsatz, quantitative Immunoblot Analyse interessiert ist. Dessen Eignung zur Sicherstellung der unbedingte Wille des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene auch zeichnen diese Technik aus traditionellen Immunoblot-Techniken. Diese Funktion ermöglicht die Kombination und Vergleich der Ergebnisse aus mehreren Analysen, ein Schritt notwendig, vor allem in größeren Bevölkerungsstudien und die Realisierung von relevanten Assoziationsstudien auf proteinebene in naher Zukunft.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird unterstützt durch Taishan Gelehrten Bau Engineering (gt), die Shandong ausgezeichnete Young Scientist Award (ZR2016JL026, G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 und 81641108), Shandong Provinz natürlichen Wissenschaftsstiftung (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong Provinz Wissenschaft und Technologie (J14LE01 und J15LK03), Yantai Wissenschaft und Technologie plan(2015ZH083) und Binzhou Medizinische Universität wissenschaftliche Forschungsmittel (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), die schwedischen Forschungsrat gewähren 621-2011-4423 und 2015-4870. Diese Arbeit wird auch von “Yantai doppelte hundert Talent planen” und “Yantai Hi-Tech Zone Blue Ocean Talent Plan” gesponsert.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |