Her viser vi en detaljeret proces af kvantitative dot skamplet analyse (QDB) ved at bestemme det absolutte indhold af en målrettet protein, udjævningen actin protein, gelsolin-lignende (CAPG), i tre forskellige mus væv. Vi demonstrere en høj produktivitet, praktisk, kvantitative immunblot teknik til biomarkør validering på niveauet cellulære og væv.
Mangler en bekvem, hæmmer kvantitative, høje overførselshastighed immunblot metode for absolut bestemmelse af indholdet af et specifikt protein på cellulære og væv niveau betydeligt fremskridt i proteom forskning. Resultaterne stammer fra aktuelt tilgængelige immunblot teknikker er også relativ, forhindrer ethvert forsøg på at kombinere uafhængige undersøgelser med en omfattende analyse af protein prøver. I denne undersøgelse viser vi processen med kvantitative dot skamplet analyse (QDB) at opnå absolut kvantificering i et format, høj overførselshastighed. Brug en kommercielt tilgængelig protein standard, er vi i stand til at bestemme det absolutte indhold af udjævningen actin protein, gelsolin-lignende (CAPG) i protein prøver fremstillet af tre forskellige mus væv (nyrer, milt og prostata) sammen med en detaljeret forklaring af de eksperimentelle detaljer. Vi foreslår QDB analyse som en praktisk, kvantitative, høje overførselshastighed immunblot metode til absolut kvantificering af individuelle proteiner på niveauet cellulære og væv. Denne metode vil kraftigt støtte biomarkør valideringogverificering pathway i forskellige områder af biologiske og biomedicinsk forskning.
Sammen med de spændende fremskridt inden for genomforskning i de seneste år, vidner biomedicinsk forskningsfelt også den betydelige fremgang i proteom forskning. Med stigende akkumulering af biologiske data på begge genomisk og proteom niveauer, ved hjælp af bioinformatic værktøjer til at analysere disse data er blevet fokus for biomedicinsk forskning i fremtidens iagttages. Derfor succes af bioinformatical forskning rejser krav om mere og bedre kvalitet af data fra Fællesskabets biologiske og biomedicinsk forskning, en opgave kan kun opnås gennem teknik avancement på genomisk og proteom niveauer.
Massespektrometri (MS) og immunblot analyse er to fremherskende teknikker til proteinanalyse i øjeblikket. MS har domineret proteom forskning i de seneste år at aktivere analyse af tusindvis af individuelle proteiner samtidigt. De immunblot-baserede teknikker, herunder vestlige skamplet og dot skamplet, på den anden side har også spillet en betydelig rolle i protein forskning selv siden sin opfindelse1,2,3,4, 5. Enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 og omvendt fase protein microarray (RPPM)8,9 kan anses for høj overførselshastighed format af immunblot analyse. Men alle disse immunassay metoder, undtagen ELISA, måle relative udtryk niveauet af et specifikt protein. Den relative karakter af disse metoder vil blive et reelt problem for befolkningen undersøgelser, som analysen skal ske på samme tid, at forhindre enhver indsats for at øge Gruppestørrelse gennem flere analyser. Resultaterne fra disse undersøgelser er desuden kun semi-kvantitative, således vanskeliggør enhver Bioinformatik indsats i dataanalyse. I mellemtiden, selv om ELISA er velegnet til høj overførselshastighed absolutte analyse af protein prøver, denne teknik synes at møde udfordringer i komplekse miljøer såsom celler eller væv på grund af sin lave bindende kapacitet og multiplexing10.
Vi har udviklet en immunblot metode egnet til befolkningen undersøgelser med Nøglekarakteristika for at være praktisk, høje overførselshastighed, kvantitative, og egnet til absolut bestemmelse af proteinindhold, og navngivet denne teknik kvantitative dot skamplet analyse (QDB)11. I denne undersøgelse, vi præsenterer en detaljeret protokol for QDB analyse og påvise metoden ved bestemmelse af det absolutte proteinindholdet af et bestemt protein, CAPG, i tre forskellige mus væv, herunder nyrer, milt og prostata. Vi mener, at denne detaljerede protokollen godt illustrerer gennemførlighed og bekvemmelighed af denne metode, og vejlede om hvordan man undgår de potentielle faldgruber i praksis af denne metode.
Blandt alle de aktuelle tilgængelige immunassay teknikker til proteinanalyse undtagen ELISA er QDB analyse den eneste metode til at opnå absolutte indhold af et specifikt protein på cellulære og væv niveauer i et format, høj overførselshastighed. Selvom med stabil isotop-mærket standard, massespektrometri er stand til at opnå absolut kvantificering af nogle proteiner, er denne metode endnu ikke udviklet til høj overførselshastighed ydeevne. I denne undersøgelse viste vi processen med QDB analyse at opnå absolut bestemmelse af CAPG protein niveau i mus væv, herunder nyrer, milt og prostata. CAPG niveauer fandtes for at være mellem 200 til 360 pg/g i mus nyre væv, 460 til 650 pg/g i mus milt og 330 til 390 pg/g i mus prostata væv.
I forhold til ELISA, kræver QDB analyse minimum indsats skal udvikles i en regelmæssig lab. Først, QDB pladen er en baseret på nitrocellulose membran til at fjerne belægning trin i ELISA. Andet, QDB analyse kun kræver én i stedet for to specifikke antistoffer i en sandwich ELISA. For det tredje, høj bindende kapacitet nitrocellulose membran i forhold til ELISA plade overflade også tillader membran til at modstå strenge vask trin typisk bruges i immunblot analyse til at reducere baggrund indblandingen. Denne funktion er meget nyttig i at analysere komplicerede lysates fremstillet af celler og væv. I modsætning hertil på grund af den relativt lave bindende kapacitet af ELISA-plader bliver reduktion af baggrunden da analysere komplicerede cellulære og væv lysates en reel udfordring i den udviklingsmæssige proces.
QDB analyse kan vedtages let i enhver lab med adgang til et specifikt antistof. Det er dog vigtigt at nævne, at antistoffet specificitet er et relativt begreb, begrænset af faktorer, herunder arternes, vævstyper og celletyper. Som vist i figur 1A, CAPG antistof er specifik, når du analyserer lysate fra mus nyrer, milt og prostata, og endnu bliver ikke-specifikke, når du analyserer mus lever. I virkeligheden, fandt vi rutinemæssigt en antistof at være specifikke for en vævstype, men ikke altid bestemt til andre væv typer fra samme art. Forudgående western blot analyse er således nødvendige for specificiteten af QDB analysen. Faktisk kan antistoffet relativt specificitet være årsag til falske resultater ofte forbundet med ELISA analyse, som uanset hvor meget indsats for fremstillings-virksomhed kan have brugt for at sikre specificiteten af analysen, de ikke kan udstødning alle mulige typer prøver brugerne kan vælge at analysere ved hjælp af deres ELISA produkter.
Som med alle immunassays, er et potentielt problem med den analysemetode, der er QDB manglen konsistens i kvaliteten af den kommercielle antistof. Selv om den tilsyneladende kvalitet af et antistof fra samme virksomhed (samme butik nummer, osv) er brugt, kan der være store forskelle fra ét køb til en anden på grund af batch til batch variationer. Derfor, medmindre fuld tillid er nået i kvaliteten af den tilgængelige antistof, re kendetegner antistof ved hvert køb er vigtigt.
I sammendrag leverer vi her en detaljeret protokol og et eksempel når du bruger metoden QDB analyse for at opnå absolut kvantitativ bestemmelse af et specifikt protein på niveauet væv. Vi viser, at metoden QDB analyse er et praktisk værktøj for alle, der er interesseret i høj overførselshastighed, kvantitative immunblot analyse. Dens evne til at opnå absolut bestemmelse af indholdet af et specifikt protein på cellulære og væv plan også skelne denne teknik fra traditionelle immunblot teknikker. Denne funktion giver mulighed for kombination og sammenligning af resultater fra flere analyser, et skridt nødvendigt især i større befolkning undersøgelser og realisering af relevante association studier på protein-niveau i den nærmeste fremtid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af Taishan lærde konstruktion Engineering (G.T.), de Shandong fremragende unge videnskabsmand Award (ZR2016JL026 til G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 og 81641108), Shandong provinsens naturlige Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsens videnskab og teknologi Plan (J14LE01 og J15LK03), Yantai videnskab og teknologi plan(2015ZH083) og Binzhou medicinske universitet videnskabelige forskningsmidler (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), det svenske Forskningsråd give 621-2011-4423 og 2015-4870. Dette arbejde er også sponsoreret af “Yantai dobbelt hundrede Talent Plan” og “Yantai Hi-Tech Zone blå Ocean Talent Plan”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |