Hier tonen we een gedetailleerd proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) door de vaststelling van de absolute inhoud van een gerichte eiwit, aftopping actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG), in drie verschillende muis weefsels. We tonen een hoge doorvoer, handige, kwantitatieve immunoblot techniek voor biomerker validatie op het niveau van cellulaire en weefsel.
Bij gebrek aan een handige, belemmert kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode voor absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op cellulair en weefsel niveau aanzienlijk de vooruitgang in Proteoom onderzoek. Resultaten afgeleid van de momenteel beschikbare immunoblot technieken zijn ook relatief, elke poging tot onafhankelijke studies combineren met een grootschalige analyse van EiwitSteekproeven voorkomen. In deze studie tonen wij het proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) om absolute kwantificering in een hoge doorvoer-indeling. Met behulp van een standaard verkrijgbare eiwit, zijn wij in staat om te bepalen van de absolute hoeveelheid van de aftopping van actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG) in EiwitSteekproeven bereid uit drie verschillende muis weefsels (nieren, milt en prostaat) samen met een gedetailleerde uitleg van de experimentele gegevens. Wij stellen de QDB analyse als een handige, kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode van absolute kwantificering van individuele eiwitten op het niveau van cellulaire en weefsel. Deze methode zal aanzienlijk steun biomerker validatie en verificatie van het traject in verschillende gebieden van biologische en biomedische onderzoek.
Naast met de spannende ontwikkelingen in de genomische onderzoek in de afgelopen jaren, getuige biomedisch onderzoeksveld ook van de aanzienlijke vooruitgang in Proteoom onderzoek. Met de toenemende accumulatie van biologische gegevens zowel genomic en proteomic niveaus, met behulp van bioinformatic hulpmiddelen voor het analyseren van deze gegevens is geworden de focus van het biomedisch onderzoek in de waarneembare toekomst. Bijgevolg, het succes van bioinformatical onderzoek verhoogt vraag naar meer en betere kwaliteit van de gegevens van de biologische en biomedische onderzoeksgemeenschap, een taak kan alleen worden bereikt door de vooruitgang van de techniek aan de genomic en proteomic niveaus.
De Spectrometrie van de massa (MS) en analyse van de immunoblot momenteel twee heersende technieken van eiwit analyse. MS heeft het proteoom onderzoek in de afgelopen jaren om de analyse van duizenden individuele eiwitten gelijktijdig gedomineerd. De immunoblot gebaseerde technieken, met inbegrip van de westelijke vlek en stip blot, aan de andere kant, ook een belangrijke rol hebben gespeeld in het eiwit onderzoek zelfs sinds haar uitvinding1,2,3,4, 5. Enzym-verbonden immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 en omgekeerde fase eiwit microarray (RPPM)8,9 kan worden beschouwd als de indeling van de hoge doorvoer van immunoblot analyse. Echter meet al deze immunoassay methoden, met uitzondering van ELISA, het niveau van de relatieve expressie van een specifieke proteïne. De relativiteit van deze methoden wordt een reëel probleem voor bevolkingsvraagstukken, zoals de analyse moet worden gedaan op hetzelfde moment, alle inspanningen om de grootte van de groep door meerdere analyses voorkomen. Bovendien zijn de resultaten afgeleid van deze studies slechts semi-kwantitatieve, complicerende dus alle inspanningen van de bio-informatica in de data-analyse. Ondertussen, hoewel ELISA leent zich uitstekend voor hoge doorvoer absolute analyse van EiwitSteekproeven, deze techniek lijkt om uitdagingen in complexe omgevingen zoals cellen of weefsels vanwege zijn lage bindingscapaciteit en multiplexing van10.
We hebben ontwikkelde een immunoblot methode geschikt voor bevolkingsonderzoeken met de belangrijkste kenmerken van het zijn handige, hoge doorvoer, kwantitatieve, en geschikt voor absolute bepaling van het gehalte aan andere melkeiwitten, en noemde deze techniek kwantitatieve dot Smet analyse (QDB)11. In deze studie, we presenteren een gedetailleerd protocol voor QDB analyse en demonstreren de methode door bepaling van het absolute eiwitgehalte van een specifieke proteïne, CAPG, in drie verschillende muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. Wij denken dat dit gedetailleerde protocol goed de haalbaarheid en het gemak van deze methode illustreert, en als leidraad over hoe om te voorkomen dat de potentiële valkuilen in de praktijk van deze methode.
Onder alle huidige beschikbaar immunoassay technieken van eiwit analyse behalve ELISA is QDB analyse de enige methode om absolute inhoud van een specifieke proteïne op cellulair en weefsel niveaus in een hoge doorvoer-indeling. Hoewel met stabiele isotoop-label standaard, massaspectrometrie staat om absolute kwantificering van een paar eiwitten, is deze methode niet nog ontworpen voor hoge doorvoer prestaties. In dit onderzoek aangetoond we het proces van QDB analyse om absolute bepaling van CAPG eiwit gehalte in muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. CAPG niveaus bleken te zijn tussen de 200 tot 360 pg/g in muis nier weefsels, 460 tot en met 650 pg/g in de milt van de muis en 330 tot 390 pg/g in muis prostaat weefsels.
Vergeleken met ELISA, vereist QDB analyse minimale inspanningen worden ontwikkeld in een regelmatige lab. Ten eerste, de QDB plaat is een op basis van een membraan van het nitrocellulose te elimineren van de coating stap in ELISA. Ten tweede, QDB analyse vereist slechts één in plaats van twee specifieke antilichamen in een sandwich-ELISA. Ten derde, de hoge bindingscapaciteit van membraan van het nitrocellulose ten opzichte van het oppervlak van de plaat ELISA staat ook het membraan te weerstaan de stappen van de strenge wassen meestal gebruikt bij de analyse van de immunoblot te verminderen de interferentie van de achtergrond. Deze functie is handig bij het analyseren van ingewikkelde lysates bereid uit cellen en weefsels. In tegenstelling, als gevolg van de relatief lage bindingscapaciteit van ELISA-plaatjes wordt de vermindering van de achtergrond bij het analyseren van complexe cellulaire en weefsel lysates een echte uitdaging in het ontwikkelings proces.
QDB analyse kan gemakkelijk worden vastgesteld in een lab met de toegang van een specifiek antilichaam. Het is echter belangrijk te vermelden dat de specificiteit van het antilichaam een relatief begrip is is, beperkt door factoren met inbegrip van de soorten, de weefseltypes (HLA) en celtypes. Zoals blijkt uit Figuur 1A, CAPG antilichaam is specifiek bij het analyseren van lysate van muis nier en milt, prostaat en nog aspecifieke wordt bij het analyseren van de lever van de muis. In feite, vonden we regelmatig één antilichaam aan zijn specifiek voor één weefseltype, maar niet altijd specifiek om andere weefseltype van dezelfde soorten. Voorafgaande westelijke vlekkenanalyse is dus noodzakelijk zijn om het specifieke karakter van de QDB analyse. In feite, de relatieve specificiteit van het antilichaam mogelijk de oorzaak van valse resultaten vaak geassocieerd met ELISA analyse, zoals ongeacht hoeveel moeite het productiebedrijf mag hebben besteed het om ervoor te zorgen de specificiteit van de test, kunnen niet zij alle mogelijke uitlaat soorten monsters de gebruikers kunt analyseren met behulp van hun ELISA-producten.
Zoals met alle immunoassay, is een potentieel probleem met de analysemethode QDB het gebrek aan samenhang van de kwaliteit van het commerciële antilichaam. Zelfs als de zichtbare kwaliteit van een antilichaam uit hetzelfde bedrijf (dezelfde catalogus nummer, etc.) wordt gebruikt, kunnen er grote verschillen ten opzichte van één aankoop naar de andere als gevolg van-charges-variabiliteit. Daarom, tenzij het volste vertrouwen in de kwaliteit van het antilichaam beschikbaar wordt bereikt, opnieuw het karakteriseren van het antilichaam bij elke aankoop is belangrijk.
Kortom bieden wij hier een gedetailleerde protocol en een voorbeeld bij het gebruik van de methode van de analyse van de QDB om absolute kwantitatieve bepaling van een specifieke proteïne op het niveau van het weefsel. We laten zien dat de analysemethode QDB is een handig hulpmiddel voor iedereen die geïnteresseerd is in hoge-doorvoer, kwantitatieve immunoblot analyse. Deze techniek haar vermogen om absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op een cellulaire en weefsel niveau ook onderscheiden van traditionele immunoblot technieken. Deze functie zorgt voor de combinatie en de vergelijking van de resultaten van meerdere analyses, een stap die nodig zijn met name in grotere bevolkingsonderzoeken en de realisatie van relevante vereniging studies op het niveau van eiwit in de nabije toekomst.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door Taishan geleerden Construction Engineering (gt), de Shandong uitstekende Young Scientist Award (ZR2016JL026 naar G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 en 81641108), Shandong provinciale natuurlijke Stichting voor Wetenschappen (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinciale wetenschap en technologie Plan (J14LE01 en J15LK03), Yantai wetenschap en technologie plan(2015ZH083) en Binzhou medische universiteit wetenschappelijke onderzoeksfondsen (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), de Zweedse Onderzoeksraad verlenen 621-2011-4423 en 2015-4870. Dit werk is ook gesponsord door “Yantai dubbele honderd Talent Plan” en “Yantai Hi-Tech Zone blauwe oceaan Talent Plan”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |