Nous démontrons un processus détaillé de l’analyse quantitative dot tache (QDB) par détermination de la teneur absolue d’une protéine ciblée, plafonnement protéines actine, gelsoline-like (CAPG), dans trois tissus de souris différente. Nous démontrons un haut débit, la technique d’immunoblot commode, quantitative pour validation des biomarqueurs au niveau cellulaire et tissulaire.
Faute d’une commode, méthode immunoblot quantitative, haut débit pour la détermination absolue de la teneur d’une protéine spécifique au niveau cellulaire et tissulaire entrave considérablement les progrès dans la recherche de la protéomique. Résultats provenant de techniques d’immunotransfert actuellement disponibles sont également relatifs, empêchant tout effort visant à combiner les études indépendantes avec une analyse à grande échelle des échantillons de protéines. Dans cette étude, nous montrons le processus de l’analyse quantitative dot tache (QDB) pour réaliser une quantification absolue dans un format haut débit. À l’aide d’un niveau de protéine disponibles dans le commerce, nous sommes en mesure de déterminer la teneur absolue du plafonnement protéines actine, la gelsoline ressemblant (CAPG) dans des échantillons de protéines préparées à partir de trois tissus de souris différents (rein, rate et la prostate), ainsi qu’un détail explication des détails expérimentaux. Nous vous proposons l’analyse QDB comme une méthode d’immunoblot commode, quantitative, haut débit de quantification absolue de protéines individuelles au niveau cellulaire et tissulaire. Cette méthode facilitera considérablement le biomarqueur validation et vérification de la voie dans les différents domaines de la recherche biologique et biomédicale.
Aux côtés d’avec les avancements passionnants en recherche en génomique dans les dernières années, le domaine de la recherche biomédicale témoins aussi l’avancement significatif dans la recherche de la protéomique. Avec l’augmentation de l’accumulation de données biologiques à la fois génomiques et protéomiques, utilisant des outils bioinformatiques pour analyser ces données est devenue le centre de recherche biomédicale à l’avenir perceptible. Par conséquent, le succès de la recherche bioinformatical déclenche la demande de nombre et de meilleure qualité des données de la communauté de la recherche biologique et biomédicale, une tâche ne peut être atteint que grâce à l’avancement de la technique à la génomique et protéomique.
Spectrométrie de masse (SM) et l’analyse par immunotransfert sont actuellement deux techniques dominantes de l’analyse des protéines. MS a dominé la recherche protéomique dans les dernières années pour permettre l’analyse de milliers de protéines individuelles en même temps. Les techniques basées sur immunoblot, y compris la tache occidentale et la dot blot, d’autre part, ont également joué un rôle important dans la recherche de protéines même depuis son invention1,2,3,4, 5. Enzymatique immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 et inversion de phase protéine microarray (RPPM)8,9 peut être considéré comme le format haut débit d’immunoblot analyse. Cependant, toutes ces méthodes de dosage immunologique, sauf ELISA, mesurent le niveau de l’expression relative d’une protéine spécifique. Le caractère relatif de ces méthodes va devenir un véritable problème pour les études de population, comme l’analyse doit se faire en même temps, empêchant tout effort visant à augmenter la taille de la piscine au moyen d’analyses multiples. En outre, les résultats provenant de ces études ne sont semi-quantitatifs, ce qui complique toute tentative de bio-informatique dans l’analyse des données. Pendant ce temps, bien qu’ELISA est bien adaptée pour l’analyse des échantillons de protéines absolu à haut débit, cette technique semble relever des défis dans des environnements complexes tels que les cellules ou tissus en raison de sa capacité de fixation faible et le multiplexage,10.
Nous avons développé une méthode d’immunoblot adaptée aux études sur la population ayant les caractéristiques principales d’être pratique, haut débit, quantitatif et adapté à la détermination absolue de la teneur en protéines et nommé cette technique quantitative point de tache analyse (QDB)11. Dans cette étude, nous présenter un protocole détaillé pour QDB analyse et illustrent la méthode de détermination de la teneur en protéines absolue d’une protéine spécifique, CAPG, dans trois tissus de souris différents, y compris les reins, la rate et la prostate. Nous pensons que ce protocole détaillé illustre bien la faisabilité et la commodité de cette méthode et fournir des conseils sur comment éviter les pièges potentiels dans la pratique de cette méthode.
Parmi tous les test immunologique disponible les techniques actuelles d’analyse des protéines sauf ELISA, analyse QDB est la seule méthode pour obtenir la teneur absolue d’une protéine spécifique aux niveaux cellulaire et tissulaire dans un format haut débit. Bien que stable isotope-étiqueté standard, spectrométrie de masse est en mesure de réaliser une quantification absolue de quelques protéines, cette méthode n’est pas encore conçue pour des performances haut débit. Dans cette étude, nous avons démontré le processus d’analyse QDB pour atteindre la détermination absolue du niveau de protéine du GPAW en tissus de souris, y compris les reins, la rate et la prostate. CAPG s’observait entre 200 à 360 pg/g dans les tissus de rein de souris, 460 à 650 pg/g de rates de souris et 330 à 390 pg/g dans les tissus de la prostate souris.
Par rapport à l’ELISA, analyse QDB nécessite des efforts minimales pour être développé dans un laboratoire régulier. Tout d’abord, la plaque QDB est basée sur une membrane de nitrocellulose pour éliminer l’étape de revêtement en ELISA. Deuxièmement, analyse QDB exige seulement un au lieu de deux anticorps spécifiques dans un sandwich ELISA. Troisièmement, la capacité de liaison haute de membrane de nitrocellulose par rapport à la surface de la plaque ELISA permet aussi la membrane supporter les étapes de lavage rigoureux généralement utilisés dans l’analyse d’immunoblot pour réduire les parasites de fond. Cette fonctionnalité est très utile dans l’analyse compliquées lysats préparés à partir de cellules et de tissus. En revanche, en raison de la capacité de liaison relativement faible des plaques ELISA, la réduction de l’arrière-plan lors de l’analyse des lysats cellulaires et tissulaires compliqués devient un véritable défi dans le processus de développement.
Analyse QDB peut être adopté facilement dans n’importe quel laboratoire avec l’accès d’un anticorps spécifique. Cependant, il est important de mentionner que la spécificité de l’anticorps est un terme relatif, limité par des facteurs incluant les espèces, les types de tissus et types de cellules. Comme le montre la Figure 1A, CAPG anticorps est spécifique lors de l’analyse de lysat de la prostate, rate et le rein de souris et devient encore non spécifiques lors de l’analyse de foie de souris. En effet, on retrouve régulièrement un anticorps à être spécifiques d’un tissu type, mais pas toujours spécifique à l’autre type de tissu de la même espèce. Ainsi, immunobuvardage préalable est nécessaire pour assurer la spécificité de l’analyse QDB. En effet, la relative spécificité de l’anticorps peut être la cause de faux résultats, souvent liées à l’analyse d’ELISA, comme n’importe quel effort de l’entreprise de fabrication peut avoir passé afin d’assurer la spécificité de l’essai, ils ne peuvent pas épuiser tous les possibles types d’échantillons, les utilisateurs peuvent choisir d’analyser à l’aide de leurs produits d’ELISA.
Comme avec tous les tests immunologiques, un problème potentiel avec la méthode d’analyse QDB est le manque d’uniformité de la qualité de l’anticorps commerciaux. Même si la qualité apparente d’un anticorps de la même compagnie (même Catalogue numéro, etc.) est utilisé, il pourrait y avoir des différences importantes d’un achat à l’autre en raison de la variabilité de lot. Par conséquent, sauf si est atteint la pleine confiance dans la qualité de l’anticorps disponibles, re-qualifier l’anticorps lors de chaque achat est important.
En résumé, nous fournissons ici un protocole détaillé et un exemple lorsque vous utilisez la méthode d’analyse QDB pour atteindre absolue détermination quantitative d’une protéine spécifique au niveau des tissus. Nous montrons que la méthode d’analyse QDB est un outil pratique pour quiconque s’intéresse à haut débit, l’analyse quantitative par immunotransfert. Sa capacité à atteindre l’absolue détermination de la teneur d’une protéine spécifique au niveau cellulaire et tissulaire distingue aussi cette technique d’immunoblot traditionnelles techniques. Cette fonctionnalité permet la combinaison et la comparaison des résultats d’analyses multiples, une étape nécessaire surtout dans les grandes études de population et la réalisation des études d’association pertinents au niveau de la protéine dans un proche avenir.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par Taishan érudits Construction Engineering (G.T.), le Shandong Excellent Young Scientist Award (ZR2016JL026 à G. T.), National Fondation sciences naturelles de Chine (31771284, 3167070448 et 81641108), Shandong naturelles provinciales Fondation de la science (ZR2016JL026, 2017GSF18103)-sciences provinciale Shandong et technologie Plan (J14LE01 et J15LK03), plan(2015ZH083) de science et technologie Yantai et Binzhou médicale Université scientifique fonds de recherche (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), le Conseil de recherche suédois accorder 621-2011-4423 et 2015-4870. Ce travail est également parrainé par « Yantai Double cent talents Plan » et « Yantai Hi-Tech Zone océan Talent Plan bleu ».
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |