Här visar vi en detaljerad process av kvantitativa dot blot analys (QDB) genom att fastställa absoluta innehållet i ett riktade protein, tak aktin protein, gelsolin-liknande (CAPG), i tre olika mus vävnader. Vi visar en hög genomströmning, bekväm, kvantitativa immunoblot teknik för biomarkör validering på cellulär och vävnaden nivå.
Saknar ett bekvämt, försvårar kvantitativa, hög genomströmning immunoblot metod för absoluta bestämning av halten av ett visst protein på cellulär och vävnaden nivå avsevärt framstegen i proteomiska forskning. Resultaten härrör från tillgängliga immunoblot tekniker är också relativ, förhindra alla ansträngningar för att kombinera oberoende studier med en omfattande analys av protein prover. I denna studie visar vi processen för kvantitativa dot blot analys (QDB) för att uppnå absolut kvantifiering i en hög genomströmning format. Använder en kommersiellt tillgänglig protein standard, har vi möjlighet att fastställa absoluta innehållet i tak aktin protein, gelsolin-liknande (CAPG) i protein prov beredd från tre olika mus vävnader (njure, mjälte och prostata) tillsammans med en detaljerad förklaring av de experimentella detaljerna. Vi föreslår QDB analysen som en bekväm, kvantitativa, hög genomströmning immunoblot metod för absolut kvantifiering av enskilda proteiner på cellulär och vävnaden nivå. Denna metod kommer väsentligt stöd biomarkör validering och pathway verifiering inom olika områden av biologisk och biomedicinsk forskning.
Tillsammans med spännande framsteg inom genomisk forskning under de senaste åren, vittnen biomedicinsk forskningsfältet också betydande framsteg inom proteomiska forskning. Med ökande ansamling av biologiska data både genomisk och proteomiska nivåer, använda bioinformatiska verktyg för att analysera dessa data har blivit fokus för biomedicinsk forskning i uppfattbar framtiden. Följaktligen, framgången för bioinformatiska forskning höjer efterfrågan på mer och bättre kvalitet på data från gemenskapens biologisk och biomedicinsk forskning, en uppgift kan endast uppnås genom teknik befordran på genomisk och proteomiska nivåer.
Masspektrometri (MS) och immunoblot analys är två rådande tekniker för proteinanalys för närvarande. MS har dominerat proteomiska forskningen under de senaste åren att möjliggöra analys av tusentals enskilda proteiner samtidigt. De immunoblot-baserade tekniker, inklusive western blot och dot blot, däremot, har också spelat en betydande roll i protein forskningen även sedan dess uppfinning1,2,3,4, 5. Enzym kopplad immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 och omvänd fas protein microarray (RPPM)8,9 kan anses hög genomströmning formatet för immunoblot analys. Men mäta alla dessa immunoassay metoder, utom ELISA, relativ uttryck ett specifikt protein. Den relativa naturen av dessa metoder blir ett verkligt problem för befolkningsstudier, analysen måste göras samtidigt, förhindrar alla ansträngningar för att öka storleken på poolen genom flera analyser. Resultaten från dessa studier är dessutom endast semikvantitativt, således komplicerande någon bioinformatik ansträngningar i dataanalysen. Under tiden, även om ELISA lämpar sig väl för hög genomströmning absolut analys av protein prover, denna teknik verkar möta utmaningar i komplexa miljöer såsom celler eller vävnader på grund av dess låga bindande kapacitet och multiplexing10.
Vi har utvecklat en immunoblot metod lämplig för befolkningsstudier med de viktigaste egenskaperna för att vara bekväm, hög genomströmning, kvantitativa, och lämplig för absoluta bestämning av proteinhalten, och heter denna teknik kvantitativa dot blot analys (QDB)11. I denna studie vi presentera ett detaljerat protokoll för QDB analys och demonstrera metoden genom bestämning av absoluta proteininnehållet av ett specifikt protein, CAPG, i tre olika mus vävnader inklusive njure, mjälte och prostata. Vi tror att detta detaljerade protokoll väl illustrerar genomförbarhet och bekvämlighet av denna metod, och ger vägledning om hur man undviker de potentiella fallgroparna i praktiken av denna metod.
Bland alla aktuella tillgängliga immunoassay tekniker för proteinanalys utom ELISA är QDB analys det enda sättet att uppnå absolut innehåll av ett specifikt protein på cellulär och vävnad i en hög genomströmning format. Visserligen med stabil isotop-märkt standard, masspektrometri kunna uppnå absolut kvantifiering av några proteiner, är denna metod ännu inte avsedd för hög genomströmning prestanda. I denna studie visade vi processen för QDB analys att uppnå absolut bestämning av CAPG proteinnivå i mus vävnader inklusive njure, mjälte och prostata. CAPG konstaterades vara mellan 200 till 360 pg/g i mus njure vävnad, 460 till 650 pg/g i mus mjälte och 330 till 390 pg/g i mus prostata vävnader.
Jämfört med ELISA, kräver QDB analysen minsta ansträngningar att utvecklas i en vanlig labb. Första är QDB plattan en utifrån en nitrocellulosa-membran för att eliminera steget beläggning i ELISA. Det andra kräver QDB analys endast en istället för två specifika antikroppar i en sandwich-ELISA. Tredje, höga bindande kapacitet av nitrocellulosa membran jämfört med ELISA platta ytan kan även membranet klarar stränga tvätt stegen används vanligtvis i immunoblot analys för att minska bakgrunden störningar. Denna funktion är mycket användbar i att analysera komplicerade lysates beredd från celler och vävnader. Däremot på grund av den relativt låga bindande kapaciteten av ELISA-plattorna blir minskning av bakgrunden när analysera komplicerade cellulära och vävnad lysates en verklig utmaning i utvecklings processen.
QDB analys kan antas lätt i någon lab med åtkomst till en specifik antikropp. Det är dock viktigt att nämna att antikroppens specificitet är en relativ term, begränsas av faktorer, inklusive arterna och vävnadstyper celltyper. Som visas i figur 1A, CAPG antikropp är specifik när analysera lysat från mus njure, mjälte och prostata, och ändå blir icke-specifik när analysera mus lever. I själva verket fann vi rutinmässigt en antikropp vara specifika för en vävnadstyp, men inte alltid specifika för andra vävnadstyp från samma art. Tidigare western blot analys är således nödvändigt att säkerställa specificitet QDB analysen. I själva verket kan den relativa specificiteten av antikropp vara orsaken till falska resultat ofta förknippas med ELISA analys, som oavsett hur mycket arbete det tillverkande företaget kan ha tillbringat för att säkerställa specificiteten av analysen, de inte kan uttömma alla tänkbara typer av prover användarna kan välja att analysera med hjälp av sina ELISA produkter.
Som med alla immunanalyser, är ett potentiellt problem med analysmetoden som QDB bristen på konsekvens av kvaliteten på den kommersiella antikroppen. Även om den skenbara kvaliteten av en antikropp från samma företag (samma katalog nummer, etc.) används, kan det vara stora skillnader från ett köp till en annan på grund av sats till sats variabilitet. Därför, om inte fullt förtroende uppnås av antikroppen tillgängliga kvalitet, åter kännetecknar antikroppen vid varje köp är viktigt.
Sammanfattningsvis ger vi här ett detaljerat protokoll och ett exempel när du använder metoden QDB analys för att uppnå absolut kvantitativ bestämning av ett specifikt protein på nivån vävnad. Vi visar att analysmetoden som QDB är ett bekvämt verktyg för alla som är intresserade av hög genomströmning, kvantitativa immunoblot analys. Dess förmåga att uppnå absolut bestämning av halten av ett visst protein på cellulär och vävnaden nivå också skilja denna teknik från traditionella immunoblot tekniker. Denna funktion möjliggör kombinationen och jämförelse av resultat från flera analyser, ett steg som är nödvändiga särskilt i större befolkningsstudier och förverkligandet av relevanta associationsstudier på proteinnivå inom en snar framtid.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Taishan forskare Construction Engineering (gt), The Shandong utmärkt ung vetenskapsman Award (ZR2016JL026 till G. T.), National Natural Science Foundation Kina (31771284, 3167070448 och 81641108), Shandong provinsiella naturlig Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsiella vetenskap och teknik (J14LE01 och J15LK03), Yantai vetenskap och teknik plan(2015ZH083) och Binzhou medicinska universitet vetenskapliga forskningsmedel (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), Vetenskapsrådet beviljar 621-2011-4423 och 2015-4870. Detta arbete är också sponsrad av ”Yantai dubbel hundra talang Plan” och ”Yantai Hi-Tech Zone blå Ocean talang Plan”.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |