Burada biz ayrıntılı işlem nicel dot blot Analizi (QDB) mutlak içerik hedefli bir proteinin belirlenerek aktin proteini, gelsolin gibi (CAPG), üç farklı fare dokularda kapatma göstermek. Biz yüksek üretilen iş, cep ve doku düzeyinde biyomarker doğrulama için uygun, nicel immunoblot tekniği göstermektedir.
Uygun bir eksik, nicel, yüksek üretilen iş immunoblot yöntemi cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğinin mutlak belirlenmesi için önemli ölçüde proteomik araştırma sürüyor engellemektedir. Şu anda kullanılabilir immunoblot teknikleri elde edilen sonuçlar da bağımsız çalışmalar büyük ölçekli bir analiz protein örnekleri ile birleştirmek için her türlü çabanın önlenmesi, görecelidir. Bu çalışmada, nicel nokta leke analiz (QDB) yüksek işlem hacmi kartvizitlere mutlak miktar ulaşmak için süreci göstermektedir. Piyasada bulunan protein standardını kullanarak, biz aktin proteini, gelsolin gibi (CAPG) üç farklı fare dokuları (böbrek, dalak ve prostat) ile birlikte ayrıntılı bir hazırlanan protein örneklerinde kapatma mutlak içeriği tespit edebiliyoruz Deneysel detayları hakkında açıklama. Cep ve doku düzeyinde bireysel proteinlerin mutlak miktar uygun, nicel, yüksek üretilen iş immunoblot yöntemi olarak QDB analiz öneriyorum. Bu yöntem önemli ölçüde biyomarker doğrulama ve yol doğrulama çeşitli alanlarda biyolojik ve Biyomedikal araştırma yardımcı olacak.
Yanında son yıllarda, heyecan verici gelişmeler genom araştırma ile Biyomedikal araştırma alanı da proteomik araştırma önemli gelişme şahit olur. Genomik hem de biyolojik veri birikimi artan ve proteomik düzeyleri, bu verileri çözümlemek için bioinformatic araçlarını kullanarak algılanabilir gelecekte Biyomedikal araştırma odak noktası haline gelmiştir. Sonuç olarak, biyolojik ve Biyomedikal Araştırma Topluluğu verilerden daha fazla ve daha iyi kalite için talep bioinformatical araştırma başarısı yükseltir, bir görev sadece teknik gelişme, genomik yoluyla elde edilebilir ve proteomik düzeyleri.
Kütle spektrometresi (MS) ve immunoblot analiz iki hakim protein analizi Şu anda tekniklerdir. MS proteomik araştırma analiz bireysel proteinler binlerce aynı anda etkinleştirmek için son yıllarda hakim olmuştur. Batı leke ve dot blot, dahil olmak üzere immunoblot tabanlı teknikleri, öte yandan da önemli bir rol protein araştırmada bile onun buluşu1,2,3,4berioynamıştır, 5. Enzim immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 bağlantılı ve ters faz protein mikroarray (RPPM)8,9 immunoblot yüksek aktarım biçimi olarak kabul edilebilir analiz. Ancak, bu immunoassay dışında tüm yöntemleri, ELISA, belirli bir protein göreli ifade düzeyini ölçmek. Analizi aynı anda birden fazla analizler aracılığıyla havuzu boyutunu artırmak için her türlü çabanın önleme yapmanız gerekir olarak bu yöntemler göreli niteliği Nüfus Etütleri, gerçek bir sorun olacaktır. Ayrıca, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar yalnızca yarı kantitatif, böylece herhangi bir veri analizi Biyoinformatik çabalarında zorlaştıran vardır. Bu arada, ELISA yüksek işlem hacmi mutlak analiz protein örnekleri için uygun olsa da, bu teknik düşük bağlama kapasitesi ve10çoğullama nedeniyle hücre ve doku gibi karmaşık ortamlarda zorlukları karşılamak için gibi görünüyor.
Biz uygun, yüksek üretilen iş, nicel ve protein içeriği, mutlak belirlenmesi için uygun olma anahtar özelliklere sahip nüfus çalışmaları için uygun bir immunoblot yöntemi geliştirdik ve bu tekniği nicel nokta leke adlı analiz (QDB)11. Bu çalışmada QDB analiz için detaylı bir protokol sunmak ve mutlak protein içeriği belirli bir protein, CAPG, böbrek, dalak ve prostat gibi üç farklı fare dokularda belirlenerek yöntemi gösterilmektedir. Biz bu detaylı protokolü de fizibilite ve bu yöntem kolaylık gösterir düşünüyorum ve bu yöntemin pratikte potansiyel tuzaklar önlemek nasıl bir kılavuz sağlamak.
Tüm geçerli kullanılabilir immunoassay teknikleri protein analizi ELISA dışında arasında QDB analiz mutlak yüksek işlem hacmi formatında cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğini elde etmek için tek yöntemdir. Kararlı izotop etiketli standart ile kütle spektrometresi birkaç proteinlerin mutlak miktar ulaşmak mümkün olmakla birlikte, bu yöntem henüz yüksek verim performans için tasarlanmış değil. Bu çalışmada, böbrek, dalak ve prostat gibi fare dokularda CAPG protein düzeyinin mutlak kararlılık elde etmek için QDB analiz süreci gösterdi. CAPG düzeyleri 200-360 pg/g fare böbrek dokularda, 460-650 pg/g fare dalağı ve 330-390 pg/g fare prostat dokularında arasında bulunmuştur.
ELISA için karşılaştırıldığında, QDB analiz düzenli bir laboratuarda geliştirilecek için en az çaba gerektirir. İlk olarak, QDB bağlı olarak kaplama adım ELISA’ortadan kaldırmak için bir nitroselüloz membran plakadır. İkinci olarak, QDB analiz sadece bir sandviç ELISA iki belirli antikor yerine gerektirir. Üçüncü olarak, nitroselüloz membran ELISA plaka yüzeyi ile karşılaştırıldığında yüksek bağlama kapasitesi de genellikle arka plan müdahale azaltmak için immunoblot analizinde kullanılan sıkı çamaşır adımları dayanacak şekilde membran sağlar. Bu özellik çok karmaşık lysates hücre ve dokuların hazırlanan analiz yararlıdır. Buna ek olarak, ELISA plakaları nispeten düşük bağlama kapasitesi nedeniyle, gelişim sürecinin gerçek bir meydan okuma karmaşık cep ve doku lysates analiz ederken arka plan azalma olur.
QDB analiz kolayca spesifik antikor erişimi olan herhangi bir laboratuvarda kabul edilebilir. Ancak, antikor özgüllük türler, doku türleri ve hücre tipleri gibi faktörler tarafından sınırlı göreceli bir terim olduğunu belirtmek önemlidir. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi CAPG antikor fare böbrek, dalak ve prostat lysate analiz ederken özeldir ve henüz fare karaciğer analiz ederken belirsiz hale gelir. Aslında, diğer doku türü için aynı türlerden bir doku türü için belirli olmak, ama her zaman belirli bir antikor rutin olarak bulduk. Böylece, önceki western blot Analizi QDB analiz özgüllük sağlamak gereklidir. Üretim şirketi geçirdim ne kadar çaba olursa olsun testin özgüllüğü sağlamak için onlar bütün olası egzoz olamaz gibi aslında, antikor göreli özgüllük çoğu ELISA analizi ile ilgili yanlış sonuçlar neden olabilir örnek kullanıcı türleri ELISA ürünlerini kullanarak analiz seçebilirsiniz.
QDB analiz yöntemi ile ilgili olası bir sorun ile tüm uzun gibi ticari antikor kalitesini tutarlılığını eksikliğidir. Olsa bile bir antikor aynı belirgin kalitesini şirket (aynı katalog numarası, vb.) kullanılan, büyük bir satın alma toplu iş toplu iş değişkenlik nedeniyle diğerine farklılıklar olabilir. Tam güven antikor mevcut kalitesinde elde sürece, bu nedenle, her satın alma üzerine antikor yeniden karakterize önemlidir.
Özetle, biz burada ayrıntılı bir protokol ve bir örnek ne zaman mutlak kantitatif tayin doku düzeyinde belirli bir protein elde etmek için QDB analiz yöntemi kullanarak sağlar. QDB analiz yöntemi yüksek işlem hacmi, nicel immunoblot analiz ilgilenen herkes için uygun bir araç olduğunu göstereceğiz. Cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğinin mutlak kararlılık elde etmek için onun yetenek aynı zamanda geleneksel immunoblot teknikleri bu teknik ayırt etmek. Kombinasyon ve karşılaştırma sonuçları birden fazla analizleri, bir adım daha büyük nüfus çalışmalarda özellikle gerekli ve yakın bir gelecekte ilgili dernek çalışmaları protein düzeyinde gerçekleşmesi için bu özellik sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Taishan akademisyenler İnşaat Mühendisliği (G.T. tarafından), Shandong mükemmel Genç Bilimci Ödülü desteklenir (G. T. ZR2016JL026), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31771284, 3167070448 ve 81641108), Shandong eyalet doğal Bilim Vakfı (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong eyalet bilim ve teknoloji planı (J14LE01 ve J15LK03), Yantai bilim ve teknoloji plan(2015ZH083) ve Binzhou Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), İsveçli Araştırma Konseyi 621-2011-4423 ve 2015-4870 hibe. Bu eser de “Yantai çift yüz yetenek planı” ve “Yantai Hi-Tech bölge mavi okyanus yetenek Plan” tarafından desteklenmektedir.
Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
Hepes | Sigma | H4034 | |
Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
EDTA | Sigma | E9884-500G | |
EGTA | Sigma | BNN1913 | |
Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Glycerol | Sigma | G7757 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
pepstatin | Sigma | Z290033 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
aprotinin | Sigma | A3428 | |
Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
SDS | Sigma | L5750-500G | |
DTT | Sigma | 43815-1G | |
Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
NaF | Sigma | S7920 |