इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे vivo में Caenorhabditis एलिगेंसमें सेल भाग्य रूपांतरण के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए । ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करना, गर्मी सदमे प्रमोटर की अनुमति-ंयूरॉन भाग्य उत्प्रेरण-प्रेरित प्रतिलेखन फैक्टर चे-1 और RNAi की मध्यस्थता घट क्रोमेटिन-विनियमन कारक लिन-५३ रोगाणु कोशिका के लिए ंयूरॉन reprogramming मनाया जा सकता है vivo में।
विशिष्ट कक्ष प्रकारों की पहचान परिवर्तित करने के दौरान सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने से तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान होती है जो सेलुलर पहचान बनाए रखने और सुरक्षित रखती हैं । निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में विशिष्ट ंयूरॉंस में रोगाणु कोशिकाओं के रूपांतरण के क्रम में आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि सुरक्षा सेल पहचान स्थापित करने के लिए विनियामक रास्ते टुकड़े । रोगाणु कोशिकाओं के एक विशिष्ट प्रकार के लिए reprogramming ंयूरॉंस का पद है ट्रांसजेनिक पशुओं कि व्यापक Zn-उंगली प्रतिलेखन फैक्टर (TF) चे-1 की अभिव्यक्ति की अनुमति की आवश्यकता है । अंतर्जात चे-1 दो सिर न्यूरॉन्स में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है और glutamatergic के लिए आवश्यक है, जो आसानी से gcy-5prom:: gfp रिपोर्टर द्वारा visualized किया जा सकता है). एक ट्रांस गर्मी सदमे प्रमोटर-संचालित चे-1 जीन अभिव्यक्ति का निर्माण युक्त जीन की अनुमति देता है व्यापक गलत-चे की अभिव्यक्ति-गर्मी पर पूरे जानवर में सदमे उपचार । क्रोमेटिन के खिलाफ RNAi के संयोजन-विनियमन कारक लिन-५३ और गर्मी-शॉक-प्रेरित चे-1 ओवर-एक्सप्रेशन के लिए रोगाणु कोशिका के पुनः प्रोग्रामिंग की ओर जाता है, जैसे कोशिकाओं के ंयूरॉन । हम यहां का वर्णन विशिष्ट RNAi प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक पशुओं के गर्मी सदमे उपचार के लिए उपयुक्त शर्तों के क्रम में सफलतापूर्वक रोगाणु कोशिका को उत्पंन करने के लिए ंयूरॉन रूपांतरण ।
सेल भाग्य reprogramming जैसे अस्थानिक tf अभिव्यक्ति द्वारा myogenic tf MyoD है, जो, जब व्यक्त, fibroblasts सीधे में धर्मांतरित मांसपेशी की तरह कोशिकाओं1, दशकों के लिए एक अनुसंधान ध्यान केंद्रित किया गया है । हालांकि, विभेदित कोशिकाओं को अक्सर इस प्रक्रिया के लिए दुर्दम्य हैं, तंत्र है कि उनकी सेलुलर पहचान की रक्षा के कारण । रोगाणु कोशिकाओं को संरक्षण के समान डिग्री दिखाने के लिए और वहां अंतर्निहित तंत्र है कि अक्सर एक भाग्य उत्प्रेरण-TF की अभिव्यक्ति पर अंय प्रकार के सेल में रोगाणु कोशिका रूपांतरण को रोकने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य कर रहे हैं । आमतौर पर, epigenetic विनियमन जैसे citrullinated संशोधनों और क्रोमेटिन संरचना सेल भाग्य2,3के रूपांतरण के लिए एक बाधा लगाता है । हम पहले सी. एलिगेंस में RNAi दस्तक-चढ़ाव का उपयोग कर रिवर्स आनुवंशिकी लागू किया है और कारकों की पहचान की है कि सेलुलर पहचान की रक्षा और इस तरह न्यूरॉन्स में रोगाणु कोशिकाओं के reprogramming4प्रतिक्रिया । विशेष रूप से, polycomb दमनात्मक जटिल 2 (PRC2) और अत्यधिक संरक्षित citrullinated निगरानी लिन-५३ (सीएएफ-1/RBBP/4/मनुष्यों में रोगाणु कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रूपांतरण जैसे विशिष्ट दैहिक कोशिका प्रकार में glutamatergic स्वाद न्यूरॉन्स में C. एलिगेंस के रूप में रोकें 4 , 5. इन रोगाणु कोशिका reprogramming बाधा कारकों की पहचान करने के लिए, हम ट्रांसजेनिक जानवरों गर्मी शॉक inducible Zn-फिंगर TF चे-1 ले जाने का इस्तेमाल किया । चे-1 आम तौर पर सी. एलिगेंसके दो सिर ंयूरॉंस में व्यक्त किया है, जहां यह glutamatergic स्वाद ंयूरॉंस के भाग्य निर्दिष्ट करता है6। इस रूप में, gcy-5prom:: gfpकी अभिव्यक्ति के द्वारा इस के द्वारा किया जा सकता है । GCY-5 एक chemoreceptor केवल एक ही रूप में व्यक्त की सही ंयूरॉन7। लिन-५३ पर RNAi द्वारा कमी और चे के व्यापक अस्थानिक अभिव्यक्ति की प्रेरण-1 द्वारा हीट शॉक, रोगाणु कोशिकाओं में ंयूरॉंस में परिवर्तित किया जा सकता है vivo4,5। महत्वपूर्ण बात, RNAi उपचार के समय केवल वयस्क कीड़े (P0 पीढ़ी) लिन-५३ RNAi को उजागर के रूप में महत्वपूर्ण है एक germline है कि ंयूरॉंस में reprogramming के लिए स्वतंत्र है के साथ F1 संतान पशुओं को जंम दे4।
इसके बाद के संस्करण-वर्णित रोगाणु कोशिका को सी. एलिगेंस में ंयूरॉन रूपांतरण प्रक्रिया के लिए सेल भाग्य reprogramming में रास्ते संकेत के निहितार्थ के रूप में जैविक प्रश्नों की एक किस्म का अध्ययन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम चे-1-प्रेरित रोगाणु कोशिका reprogramming के खिलाफ RNAi पर लिन-५३ में आदेश के निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया रोगाणु कोशिका reprogramming की प्रक्रिया में पायदान संकेतन8। डबल RNAi के प्रदर्शन से सह चूस लिन-५३ और citrullinated demethylase-एंकोडिंग जीन utx-1 हमें पता चला है कि पायदान संकेतन मार्ग PRC2-1 में मुंह की अभिव्यक्ति सक्रिय द्वारा utx मध्यस्थता जीन germline को प्रभावहीन8 . यह खोज दर्शाता है कि रोगाणु कोशिका परिवर्तन इस प्रोटोकॉल में वर्णित ंयूरॉंस के लिए एक बरकरार जीव में सेलुलर reprogramming के रूप में एक जटिल जैविक प्रक्रिया का अध्ययन किया जा सकता है और विभिंन विकासात्मक और पर्यावरण के संदर्भ में स्थितियों. इसके अलावा, यह परिप्रेक्ष्य के लिए अधिक से रोगाणु कोशिकाओं को चुनौती प्रदान करता है अलग भाग्य-उत्प्रेरण TFs सेलुलर प्लास्टिक की9के प्रतिबंध में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए, या रोगाणु कोशिकाओं के reprogramming उत्प्रेरण के लिए अपनी क्षमता का आकलन करने के लिए विवो मेंअन्य सेल प्रकार.
जबकि स्तनधारी ऊतक संस्कृतियों भी सेल भाग्य reprogramming के विभिंन पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति, संस्कृति में उगाई कोशिकाओं सीमित क्षमता के लिए एक बरकरार जीव की तुलना में संकेत मार्ग स्थितियों की नकल है । इसलिए, C. एलिगेंस vivo मेंreprogramming के दौरान संकेतन पायदान के रूप में विभिंन जैविक प्रक्रियाओं की भूमिकाओं की परीक्षा के लिए एक बहुमुखी मॉडल है । इसके अतिरिक्त, यह आनुवंशिक स्क्रीन है कि अपेक्षाकृत आसान है बनाए रखने के लिए और आनुवंशिक रूप से कम लागत के लिए संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है ।
जबकि वर्णित प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस तनाव BAT28 और RNAi के खिलाफ लिन-५३ का उपयोग कर सीधा है, कदम के एक नंबर के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में रोगाणु कोशिका की उंमीद के परिणाम को सुनिश्चित करने के लिए ंयूरॉन reprogramming । यह महत्वपूर्ण है कि तनाव BAT28 15 डिग्री सेल्सियस पर हर समय पहले प्रयोगों के लिए रखा जाता है । हैंडलिंग और तनाव के रखरखाव के दौरान, 15 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर समय के रूप में अधिक से अधिक के रूप में संभव के रूप में कम करने की जरूरत है । उचित गर्मी-सदमे की स्थिति के बाद से चे-1 एक्सप्रेस के अपर्याप्त प्रेरण रोगाणु कोशिका में नहीं होगा ंयूरॉन रूपांतरण के परिणाम के बाद महत्वपूर्ण हैं । यह प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में phenotype penetrance को मापने के द्वारा पता लगाया जा सकता है । व्यापक गर्मी सदमे जानवरों की घातकता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्लेटों है कि भीतरी दीवारों के पास या एक स्थिर हवा मशीन के नीचे जमीन पर रखा गया है अक्सर व्यापक गर्मी उपचार का अनुभव । इसलिए, यह एक वेंट गर्मी मशीन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । इसके अतिरिक्त, हीट शॉक प्रेरण के समय से अधिक के बाद से महत्वपूर्ण है चे-1 की अभिव्यक्ति लार्वा चरणों के दौरान पहले तो L3 अस्थानिक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं gcy-5prom:: gfp योनी के रूप में विभिन्न शरीर क्षेत्रों में प्रेरण (चित्रा 3) 9. इसके अलावा, व्यापक गर्मी सदमे खाली वेक्टर RNAi पशुओं में phenotype penetrance द्वारा पता लगाया जा सकता है जो 5% का विस्तार नहीं करना चाहिए और अंय ऊतकों की वृद्धि की ऑटो प्रतिदीप्ति, अर्थात् आंत ।
छिटपुट, RNAi बैक्टीरिया कुशलता से लक्ष्य जीन की dsRNA उत्पादन करने के लिए अपनी गतिविधि खो सकते हैं । दुर्भाग्य से, यह RNAi प्रयोग करने से पहले नहीं पाया जा सकता है । ऐसे मामलों में ग्लिसरॉल से एक ताजा लकीर प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित के रूप में उगाया जाना चाहिए । अगर अभी भी कोई RNAi-कारण pleiotropic phenotype दृश्यमान जैसे pvul phenotype के खिलाफ सफल RNAi के कारण लिन-५३, तो संबंधित बैक्टीरिया से एक प्लाज्मिड डीएनए अलगाव और प्रदर्शन किया जाना चाहिए ताजा HT115 बैक्टीरिया की जरूरत है लिन-५३ अनुक्रम वाले L4400 प्लाज्मिड के साथ रूपांतरित ।
महत्वपूर्ण बात, BAT28 तनाव एक रोलर phenotype इंजेक्शन मार्कर pRF4, जो पशुओं के transgenesis के दौरान इस्तेमाल किया गया था की वजह से है hsp-16.2 प्रोम:: चे-1 डीएनए का निर्माण । कभी-कभार, पशु रोलिंग phenotype को खो देते हैं, जो hsp-16.2 प्रोम:: चे-1 transgene के मुंह संकेत कर सकते हैं । ठीक से BAT28 तनाव बनाए रखने के लिए, एक ताजा थाली के लिए 10 रोलर जानवरों उठाओ और रोलिंग जानवरों के लिए चयन का प्रचार ।
प्रोटोकॉल के आवेदन F1 RNAi प्रक्रिया है, जिसका अर्थ है कि जानवरों जिनके माता पिता (P0 पीढ़ी) लिन को उजागर नहीं किया गया है करने के लिए सीमित है -५३ RNAi रोगाणु कोशिका को नहीं दिखाएगा के लिए मातृ बचाव4के कारण परिवर्तन ंयूरॉन । एक वैकल्पिक प्रक्रिया रोगाणु कोशिकाओं को बदलने के लिए न्यूरॉन्स Ciosk और सहकर्मियों द्वारा वर्णित किया गया है15 RNAi दस्तक के नीचे का उपयोग gld-1 और mex-3 के बिना पर एक प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति. हालांकि, प्राप्त न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स और रोगाणु कोशिकाओं के एक विशिष्ट प्रकार से संबंधित नहीं है भी RNAi पर मांसपेशियों की तरह कोशिकाओं में परिवर्तित-मध्यस्थ की कमी gld-1 और mex-315. पहले, यह लिन-५३ के खिलाफ RNAi का प्रदर्शन किया गया है GABAergic ंयूरॉन में रोगाणु सेल रूपांतरण की तरह पर कोशिकाओं Pitx-प्रकार homoedomain प्रतिलेखन कारक UNC-3016 के बजाय चे-14 की अभिव्यक्ति . भविष्य दिशाओं के लिए, अलग भाग्य उत्प्रेरण प्रतिलेखन कारकों परीक्षण किया जा सकता है कि लिन-५३ समाप्त रोगाणु कोशिकाओं विशिष्ट ंयूरॉंस से अंय कोशिका प्रकार के लिए परिवर्तित किया जा सकता है । इस संदर्भ में, myogenic bHLH प्रतिलेखन कारक HLH-1, स्तनधारी MyoD17के homolog, लिन-५३ RNAi5 पर मांसपेशियों को रोगाणु कोशिका के रूपांतरण लाती है । लिन-५३ RNAi पर एक विशिष्ट शारीरिक कोशिका प्रकार के लिए रोगाणु कोशिकाओं की स्थापना की reprogramming और एक उपयुक्त भाग्य-प्रतिलेखन कारक के अधिक अभिव्यक्ति अलग आनुवंशिक स्क्रीन के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के दमन या बढ़ाने स्क्रीन कोशिका भाग्य रूपांतरण के दौरान एक भूमिका निभानी है कि नियामक रास्ते विदारक मदद कर सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम अलीना El-खलीली, और मार्टिना Hajduskova तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए त्रस्न समूह के सदस्यों को धंयवाद । यह काम ईआरसी-StG-2014-637530 और ईआरसी CIG PCIG12-GA-2012-333922 द्वारा प्रायोजित किया गया था और Delbrueck एसोसिएशन में आणविक चिकित्सा के लिए मैक्स Helmholtz सेंटर द्वारा समर्थित है ।
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
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Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |