Dieses Protokoll beschreibt die zelluläre Prozesse während der Zelle Schicksal Konvertierung in Caenorhabditis Elegans in-vivoStudie. Mit transgenen Tieren, so dass Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Überexpression des Neuron Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktors CHE-1 und RNAi-vermittelten Erschöpfung der Chromatin-regulierende Faktor LIN-53 Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung kann beobachtet werden in Vivo.
Studium der biologischen Prozesse der Zelle während der Umwandlung der Identitäten der spezifischen Zelltypen liefert wichtige Einblicke in den Mechanismus, die pflegen und zelluläre Identität zu schützen. Die Umwandlung von Keimzellen in spezifischen Neuronen in den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Durchführung von genetischen Bildschirme um regulatorische Signalwege zu sezieren, die etablierten Zelle Identitäten zu schützen. Umprogrammierung der Keimzellen auf einen bestimmten Typ von Neuronen genannt ASE erfordert, dass transgene Tiere, mit denen breite Überexpression der Zn-Finger Transkription Faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 äußert sich ausschließlich in zwei Kopf Neuronen und ist erforderlich, um die ASE glutamatergen Neuronen Schicksal angeben, die leicht durch die Gcy-5prom::gfp -Reporter visualisiert werden können. Ein Trans-gen, enthält das Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Che-1 Ausdruck Genkonstrukt ermöglicht breiten MIS Ausdruck des CHE-1 in das gesamte Tier bei Hitze-Schock-Behandlung. Die Kombination von RNAi gegen die Regulierung von Chromatin Faktor LIN-53 und Hitze-Schock-induzierte Che-1 Überexpression führt zur Reprogrammierung von Keimzelle in ASE Neuron-ähnliche Zellen. Wir beschreiben hier die RNAi Sonderverfahren und angemessene Bedingungen für Hitze-Schock-Behandlung von transgenen Tieren um erfolgreich Keimzelle zur Neuron Umkehr induzieren.
Handy-Schicksal Umprogrammierung durch ektopische TF-Expression wie die myogen TF MyoD, die beim überexprimiert, Konvertiten Fibroblasten direkt in den Muskel-wie Zellen1, wurde ein Forschungsschwerpunkt seit Jahrzehnten. Differenzierte Zellen sind jedoch oft refraktär gegenüber diesen Prozess durch Mechanismen, die ihre zelluläre Identität zu wahren. Keimzellen zeigen ein ähnliches Maß an Schutz und gibt es zugrunde liegenden Mechanismen, die oft als ein Hindernis für die Keimzelle Konvertierung in andere Zelltypen bei Überexpression von einem Schicksal-induzierende TF verhindern fungieren. In der Regel auferlegt epigenetischen Regulation wie Histon Änderungen und Chromatinstruktur ein Hindernis für die Bekehrung der Zelle Schicksale2,3. Wir haben zuvor angewendet reverse Genetik mit RNAi Knock-Downs in C. Elegans und identifizierte Faktoren, die zelluläre Identitäten zu schützen und dadurch entgegenwirken Reprogrammierung von Keimzellen in Neuronen4. Insbesondere die Polycomb repressiven Komplex 2 (PRC2) und die hoch konservierte Histon Chaperone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 in den Menschen) zu verhindern, dass die direkte Umwandlung von Keimzellen in bestimmten somatischer Zelltypen wie glutamatergen Geschmack Neuronen in C. Elegans 4 , 5. um diese Keimzelle Umprogrammierung Barriere Faktoren zu identifizieren, wir transgene Tiere tragen die Hitzeschock induzierbaren Zn-Finger TF CHE-1 verwendet. CHE-1 drückt sich normalerweise in zwei Kopf Neuronen von C. Elegans, wo gibt es das Schicksal der glutamatergen Geschmack Neuronen ASE6bezeichnet. Die ASE Neuron Schicksal kann durch Expression von ASE-spezifischen fluoreszierenden Reporter Gcy-5prom::gfpvisualisiert werden. GCY-5 ist ein Chemorezeptor nur in ASE richtige Neuron7zum Ausdruck gebracht. Lin-53 Erschöpfung durch RNAi und Induktion von breiten ektopische Expression von CHE-1 durch einen Hitzeschock können Neuronen in Vivo4,5Keimzellen umgewandelt werden. Wichtig ist, ist das Timing der RNAi-Behandlung besonders wichtig, da nur Erwachsene Würmer (P0 Generation) ausgesetzt, Lin-53 RNAi F1 Nachzucht Tiere mit einem Keimbahn, die freizügig hervorrufen für Reprogrammierung in Neuronen4ist.
Die oben beschriebenen Keimzelle zu Neuron Konvertierungsvorgang in C. Elegans kann verwendet werden, um eine Vielzahl von biologischen Fragen wie die Implikation der Signalwege in der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren. Zum Beispiel haben wir die CHE-1-induzierte Keimzelle Reprogrammierung in ASE Neuronen auf RNAi gegen Lin-53 um die Implikation der Signalweg in den Prozess der Keimzelle Umprogrammierung8Kerbe zu studieren. Durch Ausführen der doppelten RNAi um Lin-53 und der Histon-Demethylase-Codierung Co zum Abbau gen Utx-1 wir, dass die Kerbe Weg entgegenwirkt PRC2-vermittelte Gen-silencing zeigten durch Aktivierung Ausdruck UTX-1 in die Keimbahn8-Signalisierung . Dieses Ergebnis zeigt, dass die Keimzelle Umstellung auf Neuronen, die in diesem Protokoll beschrieben verwendet werden, um einen komplexen biologischen Prozess z. B. zellulären Reprogrammierung im Organismus intakt und im Rahmen der verschiedenen Entwicklungs- und umweltpolitischen studieren Bedingungen. Darüber hinaus bietet es die Perspektive um Keimzellen zu fordern, indem Sie zum Ausdruck über verschiedene Schicksal-induzierende TFs zu ihrer Rolle in der Beschränkung der zellulären Plastizität9studieren oder ihr Potenzial zur Induktion Umprogrammierung der Keimzellen zu bewerten andere Zelltypen in Vivo.
Während Säugetier-Gewebekulturen auch verschiedene Aspekte erlauben der Zelle Schicksal Umprogrammierung zu studieren, haben Zellen in Kultur angebaut eine begrenzte Kapazität, Signalisierung Weg Bedingungen im Vergleich zu einem intakten Organismus zu imitieren. C. Elegans ist demzufolge ein vielseitiges Modell zur Untersuchung der Rollen der verschiedenen biologischen Prozessen wie Notch Signalisierung während Umprogrammierung in Vivo. Darüber hinaus ist es ein leistungsfähiges Modell für genetische Bildschirme, das ist relativ leicht zu pflegen und genetisch zu verändern, für niedrige Kosten.
Während die beschriebene Protokoll mit den transgenen C. Elegans strain BAT28 und RNAi gegen Lin-53 ist einfach, eine Reihe von Schritten sind entscheidend in der Reihenfolge um das erwartete Ergebnis der Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass der Stamm BAT28 zu allen Zeiten vor den Experimenten bei 15 ° C gehalten wird. Bei der Handhabung und Wartung der Belastung muss die Zeit bei Temperaturen über 15 ° C minimiert werden so weit wie möglich. Richtige Hitze-Schock-Bedingungen sind wichtig, da ungenügende Induktion von Che-1 Überexpression nicht Keimzelle zur ASE Neuron Bekehrung führt. Dies kann durch Messung der Phänotyp-Penetranz, wie im Protokoll beschrieben detektiert werden. Umfangreiche Hitzeschock kann zu Letalität der Tiere führen. Zum Beispiel Erfahrung Platten, die oft in der Nähe von den Innenwänden oder auf dem unteren Boden eine statische Luft Inkubator platziert wurden umfangreiche Wärmebehandlung. Daher empfiehlt es sich, einen belüftete Hitze Inkubator zu verwenden. Darüber hinaus ist das Timing der Hitzeschock Induktion kritisch, da Überexpression des Che-1 während der Larvenstadien früher dann L3 auf ektopische Gcy-5prom::gfp Induktion in unterschiedlichen Körperregionen wie der Vulva (Abbildung 3) führen können 9. Darüber hinaus umfangreiche Hitzeschock kann durch den Phänotyp-Penetranz in leerer Vektor RNAi-Tiere, die nicht 5 % und erhöhte Auto-Fluoreszenz anderer Gewebe, nämlich den Darm auszudehnen nachgewiesen werden.
RNAi Bakterien können sporadisch, ihre Tätigkeit um effizient produzieren DsRNA des Zielgens verlieren. Leider kann dies nicht erkannten vor der RNAi-Experiment werden. In solchen Fällen sollten ein frischen Streifen aus dem Glycerin angebaut werden, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben. Wenn gibt es noch keine RNAi verursacht pleiotrope Phänotyp sichtbar, wie der Pvul -Phänotyp durch erfolgreiche RNAi gegen Lin-53, dann ein Plasmid DNA-Isolierung aus den jeweiligen Bakterien verursacht durchgeführt werden sollte und frische HT115 Bakterien müssen sein mit dem L4400 Plasmid mit dem Lin-53 -Sequenz transformiert.
Wichtig ist, der BAT28 Stamm hat eine Walze Phänotypus verursacht durch die Injektion Marker pRF4, die verwendet wurde, während der Transgenese der Tiere mit der Hsp-16.2prom::che-1 DNA-Konstrukt. Gelegentlich Tiere verlieren den rollenden Phänotyp, die darauf hinweisen kann, Schweigen der der Hsp-16.2prom::che-1 Transgen. Um die BAT28 Belastung richtig zu halten, wählen Sie 10 Roller Tiere zu einem frischen Teller und propagieren Sie Auswahl für das rollende Tiere zu.
Die Anwendung des Protokolls beschränkt sich auf das F1 RNAi-Verfahren, was bedeutet, dass Tiere, deren Eltern (P0 Generation) Lin-53 RNAi nicht ausgesetzt wurde, Keimzelle zu Neuron-Umstellung aufgrund mütterlicher Rescue4nicht angezeigt werden. Ein alternatives Verfahren Keimzellen in Neuronen zu konvertieren ist durch Ciosk und Kollegen15 mit RNAi Knock-down Gld-1 und Mex-3 ohne Überexpression des einen Transkriptionsfaktor beschrieben worden. Jedoch die erhaltenen Neuronen gehören nicht zu einer bestimmten Art von Neuronen und Keimzellen umwandeln auch Muskel-wie Zellen auf RNAi-vermittelten Erschöpfung der Gld-1 und Mex-315. Zuvor hat es bewiesen die RNAi gegen Lin-53 erlaubt Keimzelle Umwandlung in GABAergen Neuronen-wie Zellen bei der Überexpression des Transkriptionsfaktors Pitx-Typ Homoedomain UNC-3016 anstelle von CHE-14 . Für zukünftige Richtungen kann verschiedene Schicksal-induzierende Transkription Faktoren geprüft werden können, ob Lin-53 Keimzellen erschöpft in andere Zelltypen als spezifische Neuronen umgewandelt werden. In diesem Zusammenhang induziert Überexpression des myogen bHLH Transkriptionsfaktors HLH-1, Homolog der Säugetier-MyoD17, Umstellung der Keimzelle auf Muskeln auf Lin-53 RNAi5. Die etablierten Umprogrammierung der Keimzellen zu einer bestimmten Körperzelle Typ auf Lin-53 RNAi und Überexpression von einer entsprechenden Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktor kann für eine Reihe von verschiedenen genetischen Bildschirmen verwendet werden. Solche Bildschirme Suppressor oder Enhancer können helfen, sezieren regulatorische Signalwege, die in Zelle Schicksal Konvertierung eine Rolle spielen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Alina El-Khalili und Martina Hajduskova für technische Hilfe. Wir danken Mitglieder des Arbeitskreises Tursun für Kommentare an das Manuskript. Diese Arbeit wurde gesponsert von der ERC-StG-2014-637530 und ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 und stützt sich auf die Max-Biophysik-Centrum für Molekularmedizin in der Helmholtz-Gemeinschaft.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |