Denne protokollen beskriver hvordan studere cellulære prosesser under cellen skjebne konvertering i Caenorhabditis elegans i vivo. Bruke transgene dyr, slik at varmen-shock promoter-drevet overuttrykte Nevron skjebne-inducing transkripsjon faktoren CHE-1 og RNAi-mediert uttømming av den chromatin-regulere faktor LIN-53 bakterie cellen til Nevron omprogrammering kan observeres i vivo.
Studere celle biologiske prosesser under konvertering identiteten til spesifikke celletyper gir viktig innsikt i mekanismen som opprettholde og beskytte mobilnettet identiteter. Konvertering av bakterie celler i bestemte nerveceller i Rundormer Caenorhabditis elegans (C. elegans) er et kraftig verktøy for å utføre genetiske skjermer for å analysere regulatoriske veier som sikre etablerte celle identiteter. Omprogrammere bakterie celler til en bestemt type av neurons kalt ASE krever transgene dyr at bredt over-uttrykk for Zn finger transkripsjon faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 uttrykkes i to hodet neurons og må angi glutamatergic ASE neurons skjebnen, som lett kan visualiseres reporteren gcy-5prom::gfp . En trans genet som inneholder den varme-shock promoter-drevet che-1 gen uttrykk konstruere kan bred mis uttrykk av CHE-1 i hele dyret på varme-sjokk behandling. Kombinasjonen av RNAi mot chromatin-regulere faktor LIN-53 og over-uttrykk for varme-sjokk-indusert che-1 fører til omprogrammering av bakterie celle i ASE Nevron-lignende celler. Vi beskriver her bestemt RNAi prosedyre og riktig forhold for varme-sjokk behandling av transgene dyr for å indusere vellykket bakterie celle til Nevron konvertering.
Celle skjebne omprogrammering av ektopisk TF uttrykk som den myogenic TF-MyoD, som, når overexpressed, konverterer fibroblaster direkte i muskel-lignende celler1, har vært et fokus i flere tiår. Differensierte celler er imidlertid ofte ildfaste til denne prosessen, på grunn av mekanismer som ivareta sin mobilnettet identitet. Bakterie celler viser en tilsvarende grad av beskyttelse og det underliggende mekanismene som ofte fungerer som en barriere for å forhindre bakterie celle konvertering til andre celletyper ved over-uttrykk for en skjebne-inducing TF. Vanligvis medfører epigenetic regulering som histone endringer og chromatin struktur en hindring for konvertering av cellen skjebne2,3. Vi har tidligere brukt omvendt genetikk hjelp RNAi banke-downs i C. elegans og identifiserte faktorer som sikre mobilnettet identiteter og dermed motvirke omprogrammering av bakterie celler inn neurons4. Spesielt polycomb undertrykkende komplekse 2 (PRC2) og høyt konservert histone Anstandsdame LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 hos mennesker) hindre direkte konvertering av bakterie celler inn bestemt somatisk celletyper som glutamatergic smak nerveceller i C. elegans 4 , 5. for å identifisere disse bakterie celle omprogrammering barriere faktorer, vi brukte transgene dyrene bærer varme-shock induserbart Zn finger TF CHE-1. CHE-1 uttrykkes vanligvis i to hodet nevroner i C. elegans, der den angir skjebnen til glutamatergic smak neurons kalt ASE6. ASE Nevron skjebnen kan visualiseres uttrykk for ASE-spesifikke fluorescerende reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 er en chemoreceptor bare uttrykt i ASE høyre Nevron7. Lin-53 uttømming av RNAi og induksjon av bred ektopisk uttrykk av CHE-1 av varme-sjokk, kan bakterie celler konverteres til neurons i vivo4,5. Viktigere, er tidspunktet for RNAi behandling avgjørende som bare voksne ormene (P0 generasjon) utsatt for lin-53 RNAi gi opphav til F1 avkom dyr med en germline som er tillatte omprogrammere i neurons4.
Ovenfor beskrevet bakterie celle Nevron konvertering prosedyren i C. elegans kan brukes til å studere en rekke biologiske spørsmål som Implikasjonen av signalnettverk trasé i cellen skjebne omprogrammering. For eksempel, brukte vi den CHE-1-indusert bakterie cellen omprogrammering i ASE neurons på RNAi mot lin-53 for å studere Implikasjonen av hakket signalveien under bakterie celle omprogrammering8. Ved å utføre dobbel RNAi for å tømme co lin-53 og histone demethylase-koding genet utx-1 vi viste at hakket signalering veien motvirker PRC2-mediert genet silencing av uttrykket av UTX-1 i germline8 . Dette funnet viser at bakterie celle konvertering til neurons beskrevet i denne protokollen kan brukes til å studere en kompleks biologisk prosess som mobilnettet omprogrammering i en intakt organisme og i forbindelse med ulike utviklingsmessige og miljø forhold. Dessuten, det gir et perspektiv å utfordre bakterie celler ved å uttrykke over forskjellige skjebne-inducing TFs studere deres rolle i begrensningen av mobilnettet plastisitet9eller vurdere sitt potensial for å indusere omprogrammering av bakterie celler andre cellen typer i vivo.
Mens pattedyr vev kulturer tillater også studere ulike aspekter av cellen skjebne omprogrammering, har celler dyrket i kultur begrenset evne til å etterligne signalnettverk veien forhold sammenlignet en intakt organisme. Derfor er C. elegans en allsidig modell for undersøkelse av rollene som ulike biologiske prosesser som hakk signalering under omprogrammering i vivo. I tillegg er det en kraftig modell for genetisk skjermer som er relativt lett å vedlikeholde og genetisk endre for lave kostnader.
Mens beskrevet protokollen ved hjelp av transgene C. elegans sil BAT28 og RNAi mot lin-53 er enkelt, en rekke tiltak er avgjørende for å sikre det forventede resultatet av bakterie celle til Nevron omprogrammering. Det er viktig at belastningen BAT28 holdes på 15 ° C hele tiden før eksperimenter. Under håndtering og vedlikehold av belastningen må samtidig temperaturer over 15 ° C reduseres så mye som mulig. Skikkelig varme-sjokk er viktig siden utilstrekkelig induksjon av che-1 overuttrykte ikke vil resultere i bakterie celle ASE Nevron konvertering. Dette kan oppdages ved å måle fenotypen penetrance som beskrevet i protokollen. Omfattende varme-sjokk føre til dødelighet av dyrene. For eksempel opplever plater som er plassert i nærheten av indre veggene eller på nederste bakken av en statisk luft inkubator ofte omfattende varmebehandling. Derfor anbefales det å bruke en ventilerte varme inkubator. I tillegg er timing av varme-shock induksjon avgjørende siden over-uttrykk for che-1 under larver stadier tidligere så L3 kan føre til ektopisk gcy-5prom::gfp induksjon i ulike kroppen regioner som vulva (Figur 3) 9. videre omfattende varme-sjokk kan oppdages av fenotypen penetrance i tomme vektor RNAi dyr ikke bør strekke 5% og økt auto-fluorescens av andre vev, nemlig tarmen.
Sporadisk, kan RNAi bakterier miste sin aktivitet å effektivt produsere dsRNA av målet genet. Dessverre, dette kan ikke være oppdaget før RNAi eksperimentet. I slike tilfeller bør en fersk strek fra glyserol dyrkes som beskrevet i del 2 av protokollen. Hvis det er fortsatt ingen RNAi-forårsaket pleiotropic fenotypen synlig som pvul fenotypen forårsaket av vellykkede RNAi mot lin-53, deretter en plasmider DNA isolert fra de respektive bakteriene skal utføres og fersk HT115 bakterier må være forvandlet L4400 plasmider inneholder lin-53 sekvensen.
Viktigere, den BAT28 stammen har en berg fenotypen forårsaket av injeksjon markør pRF4, som ble brukt under transgenesis av dyrene med den hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruksjon. Noen ganger dyr miste rullende fenotypen, som kan indikere stanse den hsp-16.2prom::che-1 transgene. For å kunne opprettholde BAT28 belastning, plukke 10 roller dyr til en frisk plate og overføre valg for rullende dyr.
Anvendelsen av protokollen er begrenset til F1 RNAi prosedyren, som betyr at dyr hvis foreldre (P0 generasjon) ikke har vært utsatt for lin-53 RNAi ikke vises bakterie celle til Nevron konvertering på grunn av mors redning4. En alternativ metode for å konvertere bakterie celler til neurons har blitt beskrevet av Ciosk og kolleger15 bruker RNAi sammenleggbare gld-1 og mex-3 uten over-uttrykk for en transkripsjon faktor. Imidlertid fått neurons tilhører ikke en bestemt type nevroner og bakterie celler også konvertere til muskel-lignende celler ved RNAi-mediert uttømming av gld-1 og mex-315. Tidligere har det vært vist RNAi mot lin-53 tillatt bakterie celle konvertering i GABAergic Nevron-lignende celler ved over-uttrykk for Pitx-type homoedomain transkripsjon faktoren UNC-3016 istedet for CHE-14 . For fremtidige retninger, kan annen skjebne-inducing transkripsjon faktorer kan testes om lin-53 utarmet bakterie celler konverteres til andre celletyper enn bestemte neurons. I denne sammenheng induserer overuttrykte myogenic bHLH transkripsjon faktoren klart å etablere-1, homolog av pattedyr MyoD17, konvertering av bakterie celle til muskler ved lin-53 RNAi5. Den etablerte omprogrammering av bakterie celler til en bestemt somatisk cell type ved lin-53 RNAi og over-uttrykk for en passende skjebne-inducing transkripsjon faktor kan brukes for en rekke ulike genetisk skjermer. Slike suppressor eller enhancer skjermer kan hjelpe dissekere regulatoriske veier som spiller en rolle i celle skjebne konvertering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alina El-Khalili og Martina Hajduskova for teknisk assistanse. Vi takker medlemmer av gruppen Tursun for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble sponset av ERC-StG-2014-637530 og ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 og støttes av Max Delbrueck senter for molekylær medisin i Helmholtz foreningen.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |