Denne protokol beskriver hvordan man studerer cellulære processer under celle skæbne konvertering i Caenorhabditis elegans in vivo. Ved hjælp af transgene dyr, så heat-shock promotor-drevet overekspression af neuron skæbne-inducerende transskription faktor CHE-1 og RNAi-medieret nedbrydning af den kromatin-regulerende faktor LIN-53 kimcelle til neuron omprogrammering kan observeres i vivo.
At studere cellen biologiske processer under konvertering identiteter af specifikke celletyper giver vigtig indsigt i mekanisme, at bevare og beskytte cellulære identiteter. Omdannelse af kønsceller til specifikke neuroner i den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis elegans (C. elegans) er et kraftfuldt værktøj til at udføre genetiske skærme for at dissekere regulerende veje, der sikrer etablerede celle identiteter. Omprogrammering af kønsceller til en bestemt type af neuroner kaldes ASE kræver transgene dyr, der giver mulighed for bred over udtryk for Zn-finger transskription faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 udtrykkes udelukkende i to hoved neuroner og er forpligtet til at angive glutamatergic ASE neuroner skæbne, som nemt kan visualiseres ved gcy-5prom::gfp -reporter. En trans gen indeholdende heat-shock promotor-drevet che-1 gen expression konstruktion giver mulighed for bred mis udtryk af CHE-1 i hele dyret på heat-shock behandling. Kombination af RNAi mod kromatin-regulerende faktor LIN-53 og heat-shock-induceret che-1 over udtryk fører til omprogrammering af kønsceller til ASE neuron-lignende celler. Vi beskriver her særlig RNAi procedure og passende betingelser for heat-shock behandling af transgene dyr for at kunne fremkalde kimcelle til neuron konvertering.
Celle skæbne omprogrammering af ektopiske TF udtryk såsom den myogenic TF MyoD, som når overexpressed, konverterer fibroblaster direkte ind i muskel-lignende celler1, har været et forskningsfokus i årtier. Differentierede celler er dog ofte refraktære over for denne proces, som følge af mekanismer, der sikrer deres cellulære identitet. Kønsceller viser en tilsvarende grad af beskyttelse og der er underliggende mekanismer, der ofte fungerer som en barriere til at forhindre kønscelle omregning til andre celletyper ved overdrevne udtryk af en skæbne-inducerende TF. Typisk, epigenetisk regulering som Histon ændringer og kromatin struktur pålægger en hindring for konverteringen af celle skæbner2,3. Vi har tidligere anvendt omvendt genetik ved hjælp af RNAi knock-downs i C. elegans og identificerede faktorer, der beskytte cellulære identiteter og derved modvirke omprogrammering af kønsceller til neuroner4. Specifikt, polycomb repressive komplekse 2 (PRC2) og meget velbevarede Histon anstandsdame LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 hos mennesker) forhindre den direkte omdannelse af kønsceller til specifikke somatiske celletyper såsom glutamatergic smag neuroner i C. elegans 4 , 5. for at identificere disse kønscelle omprogrammering barriere faktorer, vi brugte transgene dyr transporterer heat-shock inducerbar Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 udtrykkes normalt i to hoved neuroner af C. elegans, hvor den angiver skæbnen af glutamatergic smag neuroner kaldes ASE6. ASE neuron skæbne kan visualiseres ved ekspression af ASE-specifikke fluorescerende reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 er en chemoreceptor kun udtrykt i ASE rigtige neuron7. Lin-53 udtynding af RNAi og induktion af brede Ektopisk udtryk for CHE-1 ved heat-shock, kan kønsceller konverteres til neuroner i vivo4,5. Vigtigere, er timing af RNAi behandling afgørende som kun voksne orme (P0 generation) udsat for lin-53 RNAi give anledning til F1 afkom dyr med en genom, som er eftergivende for omprogrammering i neuroner4.
Den ovenfor beskrevne kimcelle til neuron omregningsproceduren i C. elegans kan bruges til at studere en bred vifte af biologiske spørgsmål såsom konsekvenserne af signalering veje i celle skæbne omprogrammering. For eksempel, brugte vi den CHE-1-induceret kønscelle omprogrammering til ASE neuroner ved RNAi mod lin-53 for at studere konsekvenserne af Notch signalering pathway ved at kønscelle omprogrammering8. Ved at udføre dobbelt RNAi for at co nedbryder lin-53 og Histon demethylase-kodning gen utx-1 vi viste, at Notch signalering pathway modvirker PRC2-medieret genhæmning ved at aktivere udtryk for UTX-1 i genom8 . Dette resultat viser, at kønscelle konvertering til neuroner i denne protokol beskrevne kunne bruges til at studere et komplekst biologisk proces såsom cellulære omprogrammering i en intakt organisme og i forbindelse med forskellige udviklings- og miljømæssige betingelser. Derudover, det giver perspektiv til at udfordre kønsceller over udtrykke forskellige skæbne-inducerende TFs at studere deres rolle i begrænsning af cellulære plasticitet9eller vurdere deres potentiale for at fremkalde omprogrammering af kønsceller til andre celler typer in vivo.
Mens pattedyr vævskulturer giver også mulighed for at studere forskellige aspekter af celle skæbne omprogrammering, har celler dyrkes i kultur begrænset kapacitet til at efterligne signaling pathway vilkår i forhold til en intakt organisme. C. elegans er derfor en alsidig model for undersøgelse af rollerne som forskellige biologiske processer såsom Notch signalering under omprogrammering i vivo. Desuden er det en kraftfuld model for genetiske skærme, der er relativt nemme at vedligeholde og genetisk ændre til lave omkostninger.
Mens den beskrevne protokol bruger den transgene C. elegans stamme BAT28 og RNAi mod lin-53 er ligetil, en række skridt er afgørende for at sikre det forventede resultat af kønsceller til neuron omprogrammering. Det er vigtigt at stamme BAT28 holdes ved 15 ° C på alle tidspunkter forud for forsøgene. Under håndtering og vedligeholdelse af stammen skal tid ved temperaturer over 15 ° C minimeres så meget som muligt. Ordentlig heat-shock betingelser er vigtige, da utilstrækkelige induktion af che-1 overekspression ikke vil resultere i kimcelle til ASE neuron konvertering. Dette kan påvises ved at måle fænotype penetrans, som beskrevet i protokollen. Omfattende heat-shock kan føre til dødelighed af dyrene. For eksempel, opleve plader, der er anbragt i nærheden af den indvendige vægge eller på bunden jorden af en statisk luft inkubator ofte omfattende varmebehandling. Det anbefales derfor, at bruge en ventileret varme inkubator. Derudover er timing af heat-shock induktion kritiske siden overdrevne udtryk af che-1 larve stadier tidligere derefter L3 kan føre til ektopisk gcy-5prom::gfp induktion i forskellige kroppen regioner såsom vulva (figur 3) 9. Endvidere omfattende heat-shock kan påvises ved fænotype penetrans i tomme vektor RNAi dyr, som ikke bør udvide 5% og øget auto-fluorescens i andre væv, nemlig i tarmen.
Sporadisk, kan RNAi bakterier miste deres aktivitet for at effektivt producere dsRNA af target-genet. Desværre kan dette ikke være registreret forud for RNAi eksperiment. I sådanne tilfælde bør en frisk streak fra glycerol dyrkes som beskrevet i afsnit 2 i protokollen. Hvis der er stadig ingen RNAi-forårsaget pleiotrope fænotype synlige såsom pvul fænotype forårsaget af vellykket RNAi mod lin-53, derefter et plasmid DNA isoleret fra de respektive bakterier skal udføres og friske HT115 bakterier skal være transformeret med det L4400 plasmid som indeholder lin-53 sekvens.
Vigtigere er, BAT28 stammen har en rulle fænotype forårsaget af injektion markør pRF4, som blev brugt under transgenese af dyr med den hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruktion. Lejlighedsvis, dyr mister den rullende fænotype, hvilket kan indikere hæmning af den hsp-16.2prom::che-1 transgenet. For at ordentligt vedligeholde BAT28 stammen, vælge 10 roller dyr til en frisk plade og udbrede valg for rullende dyr.
Protokollens anvendelse er begrænset til F1 RNAi-proceduren, hvilket betyder, at dyr hvis forældre (P0 generation) ikke har været udsat for lin-53 RNAi ikke vil vise kimcelle til neuron konvertering på grund af moderens rescue4. Alternativ procedure at konvertere kønsceller til neuroner er blevet beskrevet af Ciosk og kolleger15 ved hjælp af RNAi knock-down af gld-1 og mex-3 uden overdrevne udtryk for en transkriptionsfaktor. Men de opnåede neuroner tilhører ikke en bestemt type af neuroner og kimceller også konvertere til muskel-lignende celler ved RNAi-medieret nedbrydning af gld-1 og mex-315. Tidligere, det er blevet påvist RNAi mod lin-53 tilladt kønscelle omdannelse til GABAergic neuron-lignende celler ved overdrevne udtryk for Pitx-type homoedomain transskription faktor UNC-3016 i stedet for CHE-14 . For fremtidige retninger, kan anderledes skæbne-inducerende transskription faktorer kan testes om lin-53 forarmet kønsceller konverteres til andre celletyper end specifikke neuroner. I denne forbindelse inducerer overekspression af myogenic bHLH transskription faktor HLH-1, homolog af den mammale MyoD17, konvertering af kønsceller til musklerne på lin-53 RNAi5. Den etablerede omprogrammering af kønsceller til en bestemt somatisk celletype på lin-53 RNAi og overdrevne udtryk for en passende skæbne-inducerende transskription faktor kan bruges til en række forskellige genetiske skærme. Sådanne suppressor eller forstærker skærme kan hjælpe dissekere regulerende veje, der spiller en rolle i celle skæbne konvertering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alina El-Khalili og Martina Hajduskova for teknisk bistand. Vi takker medlemmerne af gruppen Tursun for kommentarer på manuskriptet. Dette arbejde blev sponsoreret af ERC-StG-2014-637530 og ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 og understøttes af Max Delbrueck Center for Molekylær medicin i Helmholtz Association.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |