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Developmental Biology

RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

doi: 10.3791/56889 Published: January 1, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे vivo में Caenorhabditis एलिगेंसमें सेल भाग्य रूपांतरण के दौरान सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए । ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करना, गर्मी सदमे प्रमोटर की अनुमति-ंयूरॉन भाग्य उत्प्रेरण-प्रेरित प्रतिलेखन फैक्टर चे-1 और RNAi की मध्यस्थता घट क्रोमेटिन-विनियमन कारक लिन-५३ रोगाणु कोशिका के लिए ंयूरॉन reprogramming मनाया जा सकता है vivo में

Abstract

विशिष्ट कक्ष प्रकारों की पहचान परिवर्तित करने के दौरान सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने से तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान होती है जो सेलुलर पहचान बनाए रखने और सुरक्षित रखती हैं । निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में विशिष्ट ंयूरॉंस में रोगाणु कोशिकाओं के रूपांतरण के क्रम में आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि सुरक्षा सेल पहचान स्थापित करने के लिए विनियामक रास्ते टुकड़े । रोगाणु कोशिकाओं के एक विशिष्ट प्रकार के लिए reprogramming ंयूरॉंस का पद है ट्रांसजेनिक पशुओं कि व्यापक Zn-उंगली प्रतिलेखन फैक्टर (TF) चे-1 की अभिव्यक्ति की अनुमति की आवश्यकता है । अंतर्जात चे-1 दो सिर न्यूरॉन्स में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है और glutamatergic के लिए आवश्यक है, जो आसानी से gcy-5prom:: gfp रिपोर्टर द्वारा visualized किया जा सकता है). एक ट्रांस गर्मी सदमे प्रमोटर-संचालित चे-1 जीन अभिव्यक्ति का निर्माण युक्त जीन की अनुमति देता है व्यापक गलत-चे की अभिव्यक्ति-गर्मी पर पूरे जानवर में सदमे उपचार । क्रोमेटिन के खिलाफ RNAi के संयोजन-विनियमन कारक लिन-५३ और गर्मी-शॉक-प्रेरित चे-1 ओवर-एक्सप्रेशन के लिए रोगाणु कोशिका के पुनः प्रोग्रामिंग की ओर जाता है, जैसे कोशिकाओं के ंयूरॉन । हम यहां का वर्णन विशिष्ट RNAi प्रक्रिया और ट्रांसजेनिक पशुओं के गर्मी सदमे उपचार के लिए उपयुक्त शर्तों के क्रम में सफलतापूर्वक रोगाणु कोशिका को उत्पंन करने के लिए ंयूरॉन रूपांतरण ।

Introduction

सेल भाग्य reprogramming जैसे अस्थानिक tf अभिव्यक्ति द्वारा myogenic tf MyoD है, जो, जब व्यक्त, fibroblasts सीधे में धर्मांतरित मांसपेशी की तरह कोशिकाओं1, दशकों के लिए एक अनुसंधान ध्यान केंद्रित किया गया है । हालांकि, विभेदित कोशिकाओं को अक्सर इस प्रक्रिया के लिए दुर्दम्य हैं, तंत्र है कि उनकी सेलुलर पहचान की रक्षा के कारण । रोगाणु कोशिकाओं को संरक्षण के समान डिग्री दिखाने के लिए और वहां अंतर्निहित तंत्र है कि अक्सर एक भाग्य उत्प्रेरण-TF की अभिव्यक्ति पर अंय प्रकार के सेल में रोगाणु कोशिका रूपांतरण को रोकने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य कर रहे हैं । आमतौर पर, epigenetic विनियमन जैसे citrullinated संशोधनों और क्रोमेटिन संरचना सेल भाग्य2,3के रूपांतरण के लिए एक बाधा लगाता है । हम पहले सी. एलिगेंस में RNAi दस्तक-चढ़ाव का उपयोग कर रिवर्स आनुवंशिकी लागू किया है और कारकों की पहचान की है कि सेलुलर पहचान की रक्षा और इस तरह न्यूरॉन्स में रोगाणु कोशिकाओं के reprogramming4प्रतिक्रिया । विशेष रूप से, polycomb दमनात्मक जटिल 2 (PRC2) और अत्यधिक संरक्षित citrullinated निगरानी लिन-५३ (सीएएफ-1/RBBP/4/मनुष्यों में रोगाणु कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रूपांतरण जैसे विशिष्ट दैहिक कोशिका प्रकार में glutamatergic स्वाद न्यूरॉन्स में C. एलिगेंस के रूप में रोकें 4 , 5. इन रोगाणु कोशिका reprogramming बाधा कारकों की पहचान करने के लिए, हम ट्रांसजेनिक जानवरों गर्मी शॉक inducible Zn-फिंगर TF चे-1 ले जाने का इस्तेमाल किया । चे-1 आम तौर पर सी. एलिगेंसके दो सिर ंयूरॉंस में व्यक्त किया है, जहां यह glutamatergic स्वाद ंयूरॉंस के भाग्य निर्दिष्ट करता है6। इस रूप में, gcy-5prom:: gfpकी अभिव्यक्ति के द्वारा इस के द्वारा किया जा सकता है । GCY-5 एक chemoreceptor केवल एक ही रूप में व्यक्त की सही ंयूरॉन7लिन-५३ पर RNAi द्वारा कमी और चे के व्यापक अस्थानिक अभिव्यक्ति की प्रेरण-1 द्वारा हीट शॉक, रोगाणु कोशिकाओं में ंयूरॉंस में परिवर्तित किया जा सकता है vivo4,5। महत्वपूर्ण बात, RNAi उपचार के समय केवल वयस्क कीड़े (P0 पीढ़ी) लिन-५३ RNAi को उजागर के रूप में महत्वपूर्ण है एक germline है कि ंयूरॉंस में reprogramming के लिए स्वतंत्र है के साथ F1 संतान पशुओं को जंम दे4

इसके बाद के संस्करण-वर्णित रोगाणु कोशिका को सी. एलिगेंस में ंयूरॉन रूपांतरण प्रक्रिया के लिए सेल भाग्य reprogramming में रास्ते संकेत के निहितार्थ के रूप में जैविक प्रश्नों की एक किस्म का अध्ययन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम चे-1-प्रेरित रोगाणु कोशिका reprogramming के खिलाफ RNAi पर लिन-५३ में आदेश के निहितार्थ का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया रोगाणु कोशिका reprogramming की प्रक्रिया में पायदान संकेतन8। डबल RNAi के प्रदर्शन से सह चूस लिन-५३ और citrullinated demethylase-एंकोडिंग जीन utx-1 हमें पता चला है कि पायदान संकेतन मार्ग PRC2-1 में मुंह की अभिव्यक्ति सक्रिय द्वारा utx मध्यस्थता जीन germline को प्रभावहीन8 . यह खोज दर्शाता है कि रोगाणु कोशिका परिवर्तन इस प्रोटोकॉल में वर्णित ंयूरॉंस के लिए एक बरकरार जीव में सेलुलर reprogramming के रूप में एक जटिल जैविक प्रक्रिया का अध्ययन किया जा सकता है और विभिंन विकासात्मक और पर्यावरण के संदर्भ में स्थितियों. इसके अलावा, यह परिप्रेक्ष्य के लिए अधिक से रोगाणु कोशिकाओं को चुनौती प्रदान करता है अलग भाग्य-उत्प्रेरण TFs सेलुलर प्लास्टिक की9के प्रतिबंध में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए, या रोगाणु कोशिकाओं के reprogramming उत्प्रेरण के लिए अपनी क्षमता का आकलन करने के लिए विवो मेंअन्य सेल प्रकार.

जबकि स्तनधारी ऊतक संस्कृतियों भी सेल भाग्य reprogramming के विभिंन पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति, संस्कृति में उगाई कोशिकाओं सीमित क्षमता के लिए एक बरकरार जीव की तुलना में संकेत मार्ग स्थितियों की नकल है । इसलिए, C. एलिगेंस vivo मेंreprogramming के दौरान संकेतन पायदान के रूप में विभिंन जैविक प्रक्रियाओं की भूमिकाओं की परीक्षा के लिए एक बहुमुखी मॉडल है । इसके अतिरिक्त, यह आनुवंशिक स्क्रीन है कि अपेक्षाकृत आसान है बनाए रखने के लिए और आनुवंशिक रूप से कम लागत के लिए संशोधित करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है ।

Protocol

सभी तरीकों के साथ यहां वर्णित पशु देखभाल के संबंध LaGeSo बर्लिन, जर्मनी द्वारा अनुमोदित किया गया है

1. समाधान तैयारी

  1. NGM-आगर प्लेट्स (1 L)
    1. NaCl के 3 जी, peptone मीडिया के २.५ ग्राम (जैसे, Bacto-peptone), और आगर के 20 ग्राम जोड़ें । autoclaving के बाद इसमें 1 मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल (5 मिलीग्राम/एमएल ९५% ेतोः स्टॉक में), 1 मीटर MgSO4की 1 मिलीलीटर, 1 मीटर CaCl2 की 25 मिलीलीटर, 1 मीटर K2PO4, और amphotericin बी की 1 मिलीलीटर (२.५ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) जोड़ें ।
  2. NGM-आगर RNAi प्लेट्स (1 L)
    1. NaCl के 3 ग्राम, peptone मीडिया के २.५ ग्राम, और आगर के 20 ग्राम जोड़ें । autoclaving के बाद, 1 मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल (5 मिलीग्राम/एमएल ९५% ेतोः स्टॉक में), 1 मीटर MgSO4की 1 मिलीलीटर, 1 मीटर CaCl2 की 1 मिलीलीटर, 1 m K2पीओ4की 1 मिलीलीटर, amphotericin बी की एक एमएल (२.५ mg/एमएल स्टॉक), 1 मीटर की 1 मिलीलीटर IPTG , और 1 मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन (५० मिलीग्राम/
  3. LB-आगर (1 L)
    1. peptone मीडिया के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 5 ग्राम, आगर के 20 ग्राम, 1 मीटर Tris पीएच ८.० के 10 मिलीलीटर जोड़ें । ज2O को 1 L में जोड़ें । autoclaving के बाद, ५० मिलीग्राम/एमएल कार्बेनिसिलिन और २.५ मिलीलीटर की 5 मिलीग्राम/एमएल टेट्रासाइक्लिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. पौंड मध्यम (1 एल)
    1. peptone मीडिया के 10 जी, खमीर निकालने के 5 जी, NaCl के 5 ग्राम, और 1 एम Tris पीएच ८.० के 10 मिलीलीटर जोड़ें । ज2O को 1 L में जोड़ें । autoclaving के बाद, ५० मिलीग्राम/एमएल कार्बेनिसिलिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. M9-बफर (1 एल)
    1. जोड़ें ६.० g Na की2HPO4, 3 जी की KH2पीओ4, 5 जी की NaCl, और ५० मिलीग्राम की जिलेटिन. उपयोग करने से पहले, 1 M MgSO4का 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. ब्लीचिंग समाधान (10 mL)
    1. NaClO के 1 मिलीलीटर और 5 एन NaOH के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिलीलीटर के लिए H2O जोड़ें ।

2. RNAi प्लेट्स तैयार करना

नोट: C. एलिगेंस आमतौर पर प्रयोगशाला में 6 सेमी पेट्री प्लेटों पर निमेटोड ग्रोथ मीडियम आगार (NGM-आगर)10,11की ७.५ मिलीलीटर युक्त है । इस प्रोटोकॉल 15 डिग्री सेल्सियस पर रखा कीड़े के लिए अनुकूलित है । NGM के साथ प्लेट तैयार करने के लिए, कवक और बैक्टीरियल संदूषण को रोकने के लिए मानक बाँझ तकनीक का उपयोग करें । निंनलिखित प्रोटोकॉल NGM RNAi के लिए रिएजेंट के साथ पूरक प्लेटें तैयार है ।

  1. तैयार 6-सेमी NGM-आगर RNAi प्लेट्स जिसमें 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) और ५० µ g/mL कार्बेनिसिलिन है । उंहें अंधेरे में कमरे के तापमान पर 24-४८ ज के लिए शुष्क12
    1. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर RNAi प्लेट रखें । 14 दिनों से अधिक पुराने का उपयोग न करें ।
  2. RNAi बैक्टीरिया (ई कोलाई HT115) क्लोन के साथ L4440 प्लाज्मिड युक्त का चयन करें लिन-५३ जीन डीएनए अनुक्रम से जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से13 पौंड पर उपलब्ध RNAi पुस्तकालय ५० µ जी से युक्त प्लेटें/ कार्बेनिसिलिन और १२.५ µ g/मब टेट्रासाइक्लिन तीन चरण के धारिता प्रतिमान का उपयोग करके । ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया रात भर बढ़12। इस क्लोन की अनुमति देता है IPTG पर निर्भर उत्पादन लिन-५३ dsRNA बैक्टीरिया में ।
    1. इसके अतिरिक्त, RNAi बैक्टीरिया है कि खाली वेक्टर नियंत्रण14के रूप में किसी भी जीन अनुक्रम के बिना L4440 प्लाज्मिड होते हो जाना ।
  3. अगले दिन, लिन-५३ या खाली वेक्टर पौंड-आगर एक २०० µ एल पिपेट टिप और एक अलग संस्कृति ट्यूब में उनमें से प्रत्येक के 2 मिलीलीटर तरल पौंड मध्यम14 ५० µ g/एमएल कार्बेनिसिलिन के साथ पूरक का उपयोग कर प्लेटों से एक एकल कॉलोनी उठाओ । बढ़ती संस्कृतियों ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात जब तक वे ०.६-०.८ के ६०० एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) तक पहुंचने । एक spectrophotometer15का उपयोग कर आयुध डिपो को मापने ।
    चेतावनी: तरल पौंड मीडिया ग्लिसरॉल स्टॉक से बैक्टीरिया लकीर के लिए इस्तेमाल किया पौंड-आगर प्लेट के विपरीत में टेट्रासाइक्लिन शामिल नहीं करना चाहिए, के बाद से खिलाने के दौरान टेट्रासाइक्लिन का समावेश एक कम RNAi दक्षता की ओर जाता है 12
  4. प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के ५०० µ एल जोड़ें (लिन-५३ या खाली सदिश) 6 सेमी NGM-आगर RNAi एक multipipette का उपयोग कर प्लेटें । शुष्क करने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर बंद ढक्कन के साथ मशीन । इस समय के दौरान, NGM प्लेटों में IPTG बैक्टीरिया में dsRNA के उत्पादन को प्रेरित करेगा ।
    1. प्रयोग प्रति बैक्टीरियल संस्कृति प्रति कम से कम 3 प्लेट का प्रयोग करें । यह प्रत्येक प्रयोग के लिए 3 तकनीकी प्रतिकृति प्रदान करेगा ।
  5. सूखे NGM-आगर RNAi प्लेटें बैक्टीरिया के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में दो सप्ताह तक के लिए ।

3. C. एलिगेंस तनाव BAT28 की तैयारी

  1. बनाए रखने के कीड़ा तनाव BAT288 transgenes otIs305 युक्त [hsp-16.2 प्रोम:: चे-1, rol-6 (su1006)] और ntIs1 [gcy-5prom:: gfp] पर OP50 बैक्टीरिया का उपयोग कर मानक NGM-आगर प्लेटों पर 15 ° c.
    नोट: निमेटोड कल्चर पर विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए,10देखें । rol-6 (su1006) एक प्रमुख एलील और आमतौर पर इस्तेमाल किया phenotypic इंजेक्शन मार्कर16 कि ठेठ रोलिंग आंदोलन का कारण बनता है । यह otIs305 transgene में प्रयोग किया जाता है ट्रैक करने के लिए hsp-16.2 प्रोम:: चे-1
    1. हर समय 15 डिग्री सेल्सियस पर BAT28 तनाव रखें ताकि hsp-16.2 प्रोम:: चे-1 transgene के सावधान सक्रियण को रोकने के लिए । अधिक से अधिक तापमान के लिए जोखिम कम 15 ° c जबकि जितना संभव हो उतना तनाव से निपटने.
  2. उम्र के लिए-कीड़े सिंक्रनाइज़, ब्लीचिंग तकनीक का उपयोग करें17.
    1. बंद धो 6 सेमी NGM-आगर ९०० µ l M9 बफर का उपयोग कर BAT28 के वयस्कों और अंडे युक्त प्लेटें । 1 मिनट के लिए ९०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कीड़े supernatant निकालें ।
    2. जोड़ें ०.५-ब्लीचिंग समाधान के 1 मिलीलीटर और लगभग 1 मिनट के लिए ट्यूब हिला जब तक वयस्क कीड़े के लिए खुला फट शुरू करते हैं । मॉनिटर एक मानक stereomicroscope का उपयोग कर ।
    3. 1 मिनट के लिए ९०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कीड़े supernatant निकालें ।
    4. M9 बफर के ८०० µ एल जोड़कर कीड़ा गोली 3 बार धो और ९०० x g पर केंद्रापसारक
    5. ताजा NGM पर जरुर अंडे रखें-OP50 बैक्टीरिया के साथ बीज प्लेटें । 15 डिग्री सेल्सियस पर OP50 बैक्टीरिया पर एक प्रक्षालित जनसंख्या बढ़ने जब तक वे L4 चरण (लगभग 4 दिन) तक पहुंचने । L4 लार्वा एक सफेद पैच द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है लगभग आधे रास्ते में कीड़ा18 के ventral पक्ष के साथ एक मानक stereomicroscope का उपयोग कर ।
      नोट: लिन-५३की कमी पर ंयूरॉन रूपांतरण phenotype को रोगाणु कोशिका प्राप्त करने के लिए, यह पैतृक पीढ़ी (P0) में समाप्त होने की जरूरत है ।
रूपांतरण phenotype के लिए स्कोरिंग निम्न उत्पादन (filial जनरेशन F1) में किया जाता है । P0 में पहले से ही चूस लिन-५३ हासिल करने के लिए, L4 जानवरों RNAi के अधीन हैं ।
  • मैनुअल एक NGM प्लेट कि किसी भी बैक्टीरिया शामिल नहीं है और कीड़े किसी भी हस्तांतरित OP50 बैक्टीरिया से दूर जाने के लिए एक प्लैटिनम तार का उपयोग कर दोहराने प्रति ५० L4 चरण कीड़े स्थानांतरण । कीड़े के आसपास 5 मिनट के लिए थाली पर चलते हैं । NGM-आगर RNAi प्लेटों से बैक्टीरिया का प्रयोग करें पहले लिन-५३ RNAi बैक्टीरिया (या खाली वेक्टर नियंत्रण) के साथ वरीयता प्राप्त करने के लिए संबंधित RNAi प्लेटों को हस्तांतरण ।
    1. वास्तविक RNAi प्लेटों के लिए OP50 बैक्टीरिया स्थानांतरित करने से बचें । 15 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के लिए तनाव के समय जोखिम को कम करने के लिए तेजी से काम ।
  • NGM पर गर्मी कीड़े-आगर RNAi प्लेटें 15 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 7 दिनों तक के लिए कीड़े की F1 संतान L3-L4 मंच तक पहुंचता है । वे स्पष्ट रूप से P0 पशुओं से अलग किया जा सकता है क्योंकि वे बड़े और F1 संतति से मोटी हैं ।
    1. नेत्रहीन एक मानक stereomicroscope के तहत जांच करें कि क्या F1 संतति कीड़े फैला योनी (pvul) phenotype के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । RNAi लिन-५३ के विरुद्ध pleiotropic प्रभाव पड़ता है और pvul phenotype का कारण बनता है जिसका आंकलन किया जा सकता है कि क्या RNAi के विरुद्ध लिन-५३ सफल हुआ है ।
      नोट: लिन-५३ के खिलाफ RNAi भी F1 भ्रूण की घातकता पैदा कर सकता है । यह प्रभाव बढ़ जाता है अगर प्लेटें 15 डिग्री से अधिक डिग्री के लिए सामने आ रहे है इससे पहले कि पशुओं L3-L4 चरण तक पहुंच । मृत भ्रूण गिरफ्तार विकास और सेने के अभाव से पहचाना जा सकता है ।
    2. अंधेरे में मशीन प्लेट IPTG के बाद से प्रकाश संवेदनशील है ।
  • 4. रोगाणु कोशिका reprogramming की प्रेरण

    1. RNAi लिन-५३ और खाली वेक्टर RNAi से युक्त प्लेटों की जांच की 30 मिनट के लिए F1 संतति उपचार में ३७ ° c अंधेरे में चे-1 को सक्रिय करने के लिए । एक निकाली मशीन का प्रयोग करें क्योंकि यह एक अधिक कुशल गर्मी सदमे के लिए अनुमति देता है ।
    2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए गर्मी से सदमे में जानवरों की अनुमति दें और फिर अंधेरे में रातोंरात 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें ।
    3. एक मानक एक प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत के लिए युग्मित stereomicroscope का उपयोग करना, के लिए GFP फ़िल्टर के तहत पशुओं की जांच gcy-5prom:: GFP-कीड़े के मध्य शरीर क्षेत्र में व्युत्पंन संकेत के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । GFP संकेतों के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें: उत्तेजना ५०९ एनएम पर उत्सर्जन अधिकतम के साथ ४८८ एनएम पर अधिकतम ।
    4. आगर पैड पर मध्य शरीर क्षेत्र में GFP संकेतों के साथ बढ़ते जानवरों द्वारा ंयूरॉन रूपांतरण के लिए रोगाणु कोशिका की डिग्री का मूल्यांकन करें माइक्रोस्कोपी स्लाइड19.
      1. phenotype penetrance का आकलन करने के लिए अंधेरे जानवरों बनाम ंयूरॉन रूपांतरण के लिए रोगाणु कोशिका दिखा जानवरों की संख्या गिनती । आमतौर पर, पशुओं के 30% के आसपास germline में असतत GFP संकेत लिन-५३ कम करने पर दिखाने के लिए, जबकि पशुओं के 5% से अधिक नहीं खाली वेक्टर RNAi पर germline में फैलाना GFP संकेत दिखा ।

    Representative Results

    के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है, F1 जानवरों है कि प्रदर्शन pvul phenotype लिन-५३ RNAi के सफल अनुप्रयोग वर्णन । इन जानवरों के लिए अपने रोगाणु कोशिकाओं के रूपांतरण की अनुमति देने के लिए संभावना है-- 1 से अधिक अभिव्यक्ति के रूप में चित्रा 2में सचित्र के रूप में गर्मी के सदमे प्रेरण-कोशिकाओं पर । कीड़े कि नियंत्रण खाली वेक्टर RNAi लिन-५३ RNAi उपचार पर बढ़ी के विपरीत में पशु है कि प्रदर्शन अस्थानिक GFP-गर्मी सदमे और 25 डिग्री सेल्सियस के बाद रात भर के शरीर के मध्य क्षेत्र में संकेतों को प्रदर्शित करेगा के रूप में पहले वर्णित4, 8. इन कीड़ों की एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के तहत करीब परीक्षा से पता चलता है कि GFP संकेतों को दिखाने कोशिकाओं को भी न्यूरॉन की तरह अनुमानों (चित्रा बी2, सफेद तीर) प्रदर्शित कि न्यूरॉन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं. यदि लिन-५३ के खिलाफ RNAi सफल या गर्मी-सदमे की स्थिति नहीं थी अनुपयुक्त GFP संकेतों नियंत्रण में उन लोगों के लिए समान होगा RNAi इलाज जानवरों (चित्रा 2) । महत्वपूर्ण बात, चे-1 की अभिव्यक्ति पर उत्प्रेरण से बचने के लिए गर्मी प्रेरण से पहले पशुओं के मध्य L3 चरण तक पहुंचने । पशु कि चे-1 के समय में भी जवान थे एक्सप्रेस प्रेरण प्रदर्शित कर सकते हैं अस्थानिक gcy-5prom:: जैसे विकासशील योनी के रूप में शरीर के अन्य क्षेत्रों में gfp अभिव्यक्ति चित्रा 3में दिखाया गया13.

    Figure 1
    चित्र 1: Pvul phenotype के विरुद्ध RNAi द्वारा लिन-५३ के कारण । शीर्ष) L4/युवा वयस्क चरण के उद्योग के चित्र F1 संतति कीड़े नियंत्रण या लिन से व्युत्पंन -५३ RNAi माताओं का इलाज किया । स्केल पट्टियां = 20 µm. (नीचे) lin-५३ के साथ इलाज किया गया जानवर RNAi-फैलाई योनी (pvul) phenotype (काला तीर-तोला) प्रदर्शित करें । pvul phenotype पुष्टि करता है कि RNAi लिन-५३ के खिलाफ सफल रहा । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 2
    चित्र 2: न्यूरॉन्स में सफलतापूर्वक पुनर्कार्यक्रम रोगाणु कोशिका के साथ कीड़े. () BAT28 तनाव खाली वेक्टर पर उगाए गए germline में GFP संकेतों को नहीं दिखाते हैं, गर्मी के बाद चे-1 के झटके प्रेरण । डैश्ड व्हाइट लाइन कीड़ा रूपरेखा । स्केल बार्स = 20 µm. (B) BAT28 तनाव जानवरों के विपरीत खाली वेक्टर पर उगाए गए नियंत्रण RNAi पर उगाए गए जानवर -५३ RNAi प्रदर्शन gcy-5prom:: gfp मध्य शरीर क्षेत्र में संकेत । 63X आवर्धन पर लिया GFP संकेतों के साथ मध्य शरीर अनुभाग के चित्र GFP-सकारात्मक कोशिकाओं की दखलंदाजी दिखा (सफेद तीर-सिर) । यह रूपात्मक सुविधा इंगित करता है कि रोगाणु कोशिकाओं को एक प्रकार का न्यूरॉन ंयूरॉन में रूपांतरण की तरह कोशिकाओं । सफेद तारक चिह्न आंत-व्युत्पंन ऑटो-प्रतिदीप्ति । सभी चित्रों 20X इज़ाफ़ा और 63X आवर्धन के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । डैश्ड व्हाइट लाइन कीड़े रूपरेखा । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्र 3: अस्थानिक GFP के साथ प्रारंभिक चरण कृमि । BAT28 तनाव खाली वेक्टर RNAi बैक्टीरिया है कि गर्मी-सदमे थे पर बड़े हो गए चे के लिए प्रेरित -1 इस तरह के मध्य शरीर क्षेत्र (सफेद तारों) में L2 शो GFP संकेतों के रूप में जल्दी लार्वा चरणों में एक्सप्रेस । इन संकेतों रोगाणु कोशिका reprogramming के कारण नहीं कर रहे हैं । डैश्ड व्हाइट लाइन कीड़ा रूपरेखा । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Discussion

    जबकि वर्णित प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस तनाव BAT28 और RNAi के खिलाफ लिन-५३ का उपयोग कर सीधा है, कदम के एक नंबर के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में रोगाणु कोशिका की उंमीद के परिणाम को सुनिश्चित करने के लिए ंयूरॉन reprogramming । यह महत्वपूर्ण है कि तनाव BAT28 15 डिग्री सेल्सियस पर हर समय पहले प्रयोगों के लिए रखा जाता है । हैंडलिंग और तनाव के रखरखाव के दौरान, 15 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर समय के रूप में अधिक से अधिक के रूप में संभव के रूप में कम करने की जरूरत है । उचित गर्मी-सदमे की स्थिति के बाद से चे-1 एक्सप्रेस के अपर्याप्त प्रेरण रोगाणु कोशिका में नहीं होगा ंयूरॉन रूपांतरण के परिणाम के बाद महत्वपूर्ण हैं । यह प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में phenotype penetrance को मापने के द्वारा पता लगाया जा सकता है । व्यापक गर्मी सदमे जानवरों की घातकता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्लेटों है कि भीतरी दीवारों के पास या एक स्थिर हवा मशीन के नीचे जमीन पर रखा गया है अक्सर व्यापक गर्मी उपचार का अनुभव । इसलिए, यह एक वेंट गर्मी मशीन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । इसके अतिरिक्त, हीट शॉक प्रेरण के समय से अधिक के बाद से महत्वपूर्ण है चे-1 की अभिव्यक्ति लार्वा चरणों के दौरान पहले तो L3 अस्थानिक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं gcy-5prom:: gfp योनी के रूप में विभिन्न शरीर क्षेत्रों में प्रेरण (चित्रा 3) 9. इसके अलावा, व्यापक गर्मी सदमे खाली वेक्टर RNAi पशुओं में phenotype penetrance द्वारा पता लगाया जा सकता है जो 5% का विस्तार नहीं करना चाहिए और अंय ऊतकों की वृद्धि की ऑटो प्रतिदीप्ति, अर्थात् आंत ।

    छिटपुट, RNAi बैक्टीरिया कुशलता से लक्ष्य जीन की dsRNA उत्पादन करने के लिए अपनी गतिविधि खो सकते हैं । दुर्भाग्य से, यह RNAi प्रयोग करने से पहले नहीं पाया जा सकता है । ऐसे मामलों में ग्लिसरॉल से एक ताजा लकीर प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित के रूप में उगाया जाना चाहिए । अगर अभी भी कोई RNAi-कारण pleiotropic phenotype दृश्यमान जैसे pvul phenotype के खिलाफ सफल RNAi के कारण लिन-५३, तो संबंधित बैक्टीरिया से एक प्लाज्मिड डीएनए अलगाव और प्रदर्शन किया जाना चाहिए ताजा HT115 बैक्टीरिया की जरूरत है लिन-५३ अनुक्रम वाले L4400 प्लाज्मिड के साथ रूपांतरित ।

    महत्वपूर्ण बात, BAT28 तनाव एक रोलर phenotype इंजेक्शन मार्कर pRF4, जो पशुओं के transgenesis के दौरान इस्तेमाल किया गया था की वजह से है hsp-16.2 प्रोम:: चे-1 डीएनए का निर्माण । कभी-कभार, पशु रोलिंग phenotype को खो देते हैं, जो hsp-16.2 प्रोम:: चे-1 transgene के मुंह संकेत कर सकते हैं । ठीक से BAT28 तनाव बनाए रखने के लिए, एक ताजा थाली के लिए 10 रोलर जानवरों उठाओ और रोलिंग जानवरों के लिए चयन का प्रचार ।

    प्रोटोकॉल के आवेदन F1 RNAi प्रक्रिया है, जिसका अर्थ है कि जानवरों जिनके माता पिता (P0 पीढ़ी) लिन को उजागर नहीं किया गया है करने के लिए सीमित है -५३ RNAi रोगाणु कोशिका को नहीं दिखाएगा के लिए मातृ बचाव4के कारण परिवर्तन ंयूरॉन । एक वैकल्पिक प्रक्रिया रोगाणु कोशिकाओं को बदलने के लिए न्यूरॉन्स Ciosk और सहकर्मियों द्वारा वर्णित किया गया है15 RNAi दस्तक के नीचे का उपयोग gld-1 और mex-3 के बिना पर एक प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति. हालांकि, प्राप्त न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स और रोगाणु कोशिकाओं के एक विशिष्ट प्रकार से संबंधित नहीं है भी RNAi पर मांसपेशियों की तरह कोशिकाओं में परिवर्तित-मध्यस्थ की कमी gld-1 और mex-315. पहले, यह लिन-५३ के खिलाफ RNAi का प्रदर्शन किया गया है GABAergic ंयूरॉन में रोगाणु सेल रूपांतरण की तरह पर कोशिकाओं Pitx-प्रकार homoedomain प्रतिलेखन कारक UNC-3016 के बजाय चे-14 की अभिव्यक्ति . भविष्य दिशाओं के लिए, अलग भाग्य उत्प्रेरण प्रतिलेखन कारकों परीक्षण किया जा सकता है कि लिन-५३ समाप्त रोगाणु कोशिकाओं विशिष्ट ंयूरॉंस से अंय कोशिका प्रकार के लिए परिवर्तित किया जा सकता है । इस संदर्भ में, myogenic bHLH प्रतिलेखन कारक HLH-1, स्तनधारी MyoD17के homolog, लिन-५३ RNAi5 पर मांसपेशियों को रोगाणु कोशिका के रूपांतरण लाती है । लिन-५३ RNAi पर एक विशिष्ट शारीरिक कोशिका प्रकार के लिए रोगाणु कोशिकाओं की स्थापना की reprogramming और एक उपयुक्त भाग्य-प्रतिलेखन कारक के अधिक अभिव्यक्ति अलग आनुवंशिक स्क्रीन के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के दमन या बढ़ाने स्क्रीन कोशिका भाग्य रूपांतरण के दौरान एक भूमिका निभानी है कि नियामक रास्ते विदारक मदद कर सकते हैं ।

    Disclosures

    लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम अलीना El-खलीली, और मार्टिना Hajduskova तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए त्रस्न समूह के सदस्यों को धंयवाद । यह काम ईआरसी-StG-2014-637530 और ईआरसी CIG PCIG12-GA-2012-333922 द्वारा प्रायोजित किया गया था और Delbrueck एसोसिएशन में आणविक चिकित्सा के लिए मैक्स Helmholtz सेंटर द्वारा समर्थित है ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals 
    Agar-Agar, Kobe I Roth 5210.1
    Bactopeptone  A. Hartenstein GmbH 211 677 Peptone Media 
    Yeast extract  AppliChem A1552,0100
    Amphotericin B USBiological A2220
    CaCl2 Merck Biosciences 208290
    Cholesterol Roth 8866.2
    Gelatine Roth 4275.3
    IPTG Sigma 15502-10G
    K2PO4 Roth T875.2
    KH2PO4 Roth  3904.2
    MgSO4 VWR 25,163,364
    Na2HPO4 Roth P030.1
    NaCl Roth 9265.1
    NaClO Roth 9062.3
    NaOH (5 N) Roth  KK71.1
    Tris Roth AE15.2
    Carbenicillin Roth 634412
    Tetracycline Roth 2371.2
    Incubators
    Incubator  New Brunswick Scientific C24 M1247-0052 for heat-shock
    Incubator  Sanyo MIR-5 5534210 for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
    Microscopes
    Fluorescence microscope M205 FA Leica
    Microscope (Imaging) + camera Axio Imager 2 Zeiss
    Microscope (Imaging) + camera Sensicam PCO
    Stereomicroscope SMZ745 Nikon
    Bacterial strains
    Escherichia coli HT115 F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5
    promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse
    III minus).
    Escherichia coli OP50  Uracil auxotroph E. coli strain
    Worm strains
    BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
    3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.
    derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
    RNAi Clones
    lin-53 SourceBioscience ID I-4D14 Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
    empty vetor: L4440 Addgene  #1654
    Misc.
    Worm pick  self-made using a pasteur pipette and a platinum wire

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    References

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    RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए <em>सी. एलिगेंस</em> में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram
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    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).More

    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).

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