Détermination de la concentration protéique par spectrophotométrie
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Overview
Mesure de la concentration est une étape fondamentale de nombreuses épreuves biochimiques. Détermination photométrique protéine tire parti du fait que plus un échantillon contient des substances absorbant la lumière, moins la lumière transmettra à travers elle. La relation entre la concentration et l’absorption étant linéaire, ce phénomène peut être utilisé pour mesurer la concentration dans les échantillons où on ne sait pas.
Cette vidéo décrit les rudiments de la détermination des protéines photométrique et introduit l’analyse de Bradford et la méthode de Lowry. La procédure décrite dans la vidéo couvrira une analyse typique de Bradford. Les applications couvertes incluent une mesure directe de très petites quantités d’acides nucléiques pour caractériser la concentration et de la pureté, la détermination de l’efficacité d’un matériau biomimétiques et une autre variante de détermination photométrique de protéine à l’aide de colorant Remazol de couplage.
Détermination de la concentration d’une protéine dans les échantillons est une étape fondamentale dans nombreuses épreuves biochimiques. Détermination photométrique peut être faite avec la petite taille des échantillons. Plus un échantillon contient des substances absorbant la lumière, moins la lumière transmettra à travers elle. Ceci fournit une mesure quantitative des substances absorbantes. Ces concepts sont si essentielle à la science que les articles qui introduit deux des techniques sont dans le trois plus cité dans les documents de tous les temps. Cette vidéo va montrer les concepts derrière certains de la protéine photométrique plus commune des techniques de dosage, comment ils sont effectués, et comment les données recueillies sont analysées.
Détermination des protéines photométrique est basée sur la relation entre la concentration et la capacité d’absorption lumineuse. Ceci est connu comme la Loi de Beer-Lambert, qui stipule que la concentration d’une espèce absorbant la lumière est proportionnelle à son absorbance.
Ce principe sous-tend toutes les méthodes de détermination photométrique de protéine.
Pour l’analyse de l’absorption directe, les valeurs d’absorbance des échantillons de protéines non altérées sont mesurés. En raison de leur chaîne latérale aromatique, résidus de tryptophane et de la tyrosine donnent les plus hautes mesures d’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm.
Toutefois, ces acides aminés, qui sont deux des protéines-sont moins fréquemment trouvé dans présents en quantités différentes dans chaque protéine, donc chaque dosage est unique. Pour surmonter cette limitation, les dosages plus complexes-qui ne sont pas dépendants de ces acides aminés-ont été développés.
Un exemple est l’analyse de Bradford, où colorant coloré est ajouté à l’échantillon. Le colorant appelé bleu de Coomassie, répond proportionnellement le plus de protéines présentes, les liaison des événements plus avec le colorant.
Ensuite, la concentration de protéines est déterminée en mesurant l’absorbance du colorant bleu de Coomassie lié, qui absorbe la lumière à 594 nm. Toutefois, l’analyse de Bradford est linéaire sur un court intervalle de concentrations, donc dilutions sont souvent nécessaires avant l’analyse.
La méthode de Lowry combine le réactif du Biuret, une solution alcaline d’ions de cuivre qui réagissent avec les liaisons peptidiques et le réactif de Folin-Ciocâlteu, qui oxyde les résidus protéiques aromatiques. Le changement de la couleur résultante de l’échantillon est proportionnel à la concentration de protéine.
L’absorbance du réactif de Folin réduit peut être déterminée à 750 nm. Comme l’absorption directe, chaque protéine a une réponse unique et doit être étalonné pour la protéine d’intérêt. Maintenant que nous avons passé en revue les principes fondamentaux derrière certaines des analyses plus courantes, nous allons étudier comment direct d’absorption et de l’analyse de Bradford sont effectuées.
Pour commencer une analyse directe de l’absorption, le spectrophotomètre est calibré avec un blanc pour déterminer le zéro d’absorbance. Solutions étalons sont préparées à utiliser pour la création de la courbe d’étalonnage. Ensuite, une partie aliquote de la première norme est ajoutée à une cuvette et placée dans le spectrophotomètre.
La valeur d’absorbance à 280 nm est alors enregistrée. Ce processus est répété pour chaque norme, à l’aide d’une cuvette propre de chaque série. Une fois terminé, une courbe d’étalonnage est créée en traçant l’absorbance versus la concentration. La pente de cette droite est le coefficient d’atténuation molaire, qui concerne l’absorbance à la concentration.
Ensuite, l’échantillon inconnu est ajouté à une cuvette, et la valeur de l’absorbance est enregistrée. Comme l’analyse des données pour les méthodes de détermination photométrique différente est similaire, nous allons couvrir qui après que nous regarder l’analyse de Bradford.
Ici, l’analyse de protéine de Bradford est réalisée avec une norme de BSA sur une plaque à 96 puits. Pour commencer, BSA solutions mères sont préparées.
Les solutions inconnues sont diluées avec de l’eau déionisée pour s’assurer que les concentrations sont à portée de l’essai. Selon le kit, le colorant bleu de Coomassie peut également exiger dilution. Ensuite, la courbe d’étalonnage est mises en place en ajoutant les normes de BSA à la plaque à 96 puits.
L’eau déminéralisée est ajouté pour atteindre la concentration nécessaire pour générer une courbe d’étalonnage. L’échantillon inconnu s’ajouteront à la plaque en réanalysés pour assurer qu’une mesure précise est prise ; Colorant bleu de Coomassie est ensuite ajouté à chaque puits, mélanger à l’aide de la pipette.
L’eau déminéralisée est ajouté à un puits vide comme un blanc, pour mesurer l’absorbance. Après avoir attendu 5 min pour le colorant lier, l’absorbance est mesurée dans un lecteur de plaque à 590 nm.
Maintenant que nous avons effectué quelques tests, regardons comment analyser les données. Chaque méthode de détermination photométrique de protéine est issu de la Loi de Beer-Lambert.
L’absorbance mesurée des normes est utilisé pour créer une courbe d’étalonnage, qui est ensuite utilisée pour déterminer la concentration des échantillons inconnus. Cette courbe peut être tracée manuellement, même si les plus récents outils spectrophotométriques créera la courbe d’étalonnage, une fois que tous les standards ont été mesurées. Ces systèmes calculera également la concentration de protéines comme échantillons inconnus sont analysés.
Maintenant que nous avons examiné comment analyser des données de détermination photométrique de protéine, regardons quelques-unes des façons que ces procédures sont utilisées.
Les principes de détermination photométrique protéine permet également de mesurer directement la concentration de l’acide nucléique. Le spectrophotomètre nanodrop accepte des échantillons de très petit volume sur un piédestal optiquement actif. L’absorbance est alors mesurée, et le système détermine automatiquement la concentration de l’acide nucléique. Parce que les protéines et autres sources peuvent interférer avec les mesures, pureté de l’échantillon est déterminée en analysant les 260 à 280 nm et ratios absorbance de 260 à 230 nm. Acides nucléiques purs donnent généralement ratios d’environ 1,8 et environ 2,0 pour ADN et d’ARN, respectivement.
Détermination photométrique de protéine peut également servir dans la production de matériaux biomimétiques, qui s’inspirent de la nature pour provoquer des réponses cellulaires spécifiques. Adhésines recombinantes sont tenus de billes de polystyrène pour simuler l’attachement des bactéries aux cellules hôtes. L’analyse de Bradford est utilisée pour déterminer l’efficacité du couplage de l’adhérence recombinant aux billes dans la production des matériaux biomimétiques.
Dosages de protéines photométrique alternative peuvent être utilisés dans la détection et la caractérisation d’antimicrobiens de protéine. Remazol brillant R des bleu covalente aux bactéries tuées par la chaleur. La protéine antimicrobienne est incubée dans la solution teinte. Puis, l’échantillon est centrifugée et l’absorption du liquide surnageant à 595 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre microplaques. Absorbance accrue, de colorant soluble libéré dans le surnageant de la bactérie étiquetée, est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur détermination photométrique de protéine. Cette vidéo décrit les principes qui sous-tendent la détermination photométrique, passe des procédures générales pour certains tests communs et couverts de quelques nouveaux progrès dans les techniques. Merci de regarder !
Procedure
Disclosures
Transcript
Determining the concentration of a protein in samples is a fundamental step in many biochemical assays. Photometric determination can be done with small sample sizes. The more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. This provides a quantitative measurement of the absorbing substances. These concepts are so fundamental to science that the articles that introduced two of the techniques are in the three most cited papers of all time. This video will show the concepts behind some of the most common photometric protein determination techniques, how they are performed, and how the gathered data is analyzed.
Photometric protein determination is based on the relationship between concentration and light absorbency. This is known as the Beer-Lambert Law, which states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance.
This principle underlies all photometric protein determination methods.
For direct absorption analysis, the absorbance values of unaltered protein samples are measured. Because of their aromatic side chains, tryptophan and tyrosine residues give the highest absorbance readings at a wavelength of 280 nm.
However, these amino acids-which are two of the least frequently found in proteins-are present in different amounts in every protein, so each determination is unique. To overcome this limitation, more complex assays-that are not dependent on these amino acids-were developed.
One example is the Bradford Assay, where colored dye is added to the sample. The dye, known as Coomassie Blue, responds proportionally-the more protein present, the more binding events with the dye.
Then, protein concentration is determined by measuring the absorbance of the bound Coomassie Blue dye, which absorbs light at 594 nm. However, the Bradford assay is linear over a short range of concentrations, so dilutions are often required before analysis.
The Lowry Method combines the Biuret reagent, an alkaline solution of copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Ciocâlteu reagent, which oxidizes aromatic protein residues. The resulting color change of the sample is proportional to the protein concentration.
The absorbance of the reduced Folin reagent can be determined at 750 nm. Like direct absorption, each protein has a unique response, and must be calibrated for the protein of interest. Now that we’ve reviewed the basic principles behind some of the most common assays, let’s look at how direct absorption and the Bradford assay are performed.
To begin a direct absorption analysis, the spectrophotometer is calibrated with a blank to determine zero absorbance. Standard solutions are prepared for use in creating the calibration curve. Then, an aliquot of the first standard is added to a cuvette, and placed into the spectrophotometer.
The absorbance value at 280 nm is then recorded. This process is repeated for each standard, using a clean cuvette for each run. Once complete, a calibration curve is created by plotting the absorbance versus concentration. The slope of this line is the molar attenuation coefficient, which relates absorbance to concentration.
Next, the unknown sample is added to a cuvette, and the absorbance value is recorded. As the data analysis for the different photometric determination methods is similar, we will cover that after we look at the Bradford assay.
Here, the Bradford protein assay is performed with a BSA standard on a 96-well plate. To begin, BSA stock solutions are prepared.
The unknown solutions are diluted with deionized water to ensure that the concentrations are within the assay’s range. Depending on the kit, the Coomassie dye may also require dilution. Then, the calibration curve is set up by adding the BSA standards to the 96-well plate.
Deionized water is added to reach the needed concentration to generate a standard curve. The unknown sample should be added to the plate in triplicates to ensure an accurate measurement is taken. Coomassie dye is next added to each well, mixing with the pipette.
Deionized water is added to an empty well as a blank, to measure the absorbance. After waiting 5 min for the dye to bind, the absorbance is measured in a plate-reader at 590 nm.
Now that we’ve performed a few assays, let’s look at how to analyze the data. Each photometric protein determination method is based on the Beer-Lambert Law.
The measured absorbance of the standards is used to create a calibration curve, which is then used to determine the concentration of unknown samples. This curve can be manually plotted, though newer spectrophotometric tools will create the calibration curve once all standards have been measured. These systems will also calculate protein concentration as unknown samples are analyzed.
Now that we’ve reviewed how to analyze photometric protein determination data, let’s look at some of the ways these procedures are utilized.
The principles of photometric protein determination can also be used to directly measure nucleic acid concentration. The nanodrop spectrophotometer accepts samples of very small volume onto an optically active pedestal. The absorbance is then measured, and the system automatically determines the nucleic acid concentration. Because proteins and other sources can interfere with measurements, sample purity is determined by analyzing the 260 to 280 nm and 260 to 230 nm absorbance ratios. Pure nucleic acids typically yield ratios of approximately 1.8 and approximately 2.0 for DNA and RNA, respectively.
Photometric protein determination can also be used in the production of biomimetic materials, which are inspired from nature to elicit specific cellular responses. Recombinant adhesins are bound to polystyrene beads to simulate bacterial attachment to host cells. The Bradford assay is used to determine the coupling efficiency of the recombinant adhesion to the beads in the production of the biomimetic material.
Alternative photometric protein assays can be used in the detection and characterization of protein antimicrobials. Remazol brilliant blue R dye is covalently bonded to heat-killed bacteria. The protein antimicrobial is incubated in the dyed solution. Then, the sample is centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 595 nm is measured using a microplate spectrophotometer. Increased absorbance, by the soluble dye released into the supernatant from the labeled bacteria, is a quantitative measurement of enzymatic activity.
You’ve just watched JoVE’s video on photometric protein determination. This video described the underlying principles of photometric determination, went over general procedures for some common assays, and covered some new advances in techniques. Thanks for watching!
