Summary
Trombocytantal lager baserat på screening microparticle innehåll i trombocytantal koncentrat är ett nytt kvalitet förbättring initiativ i sjukhusblodbanker. Målet är att göra åtskillnad mellan aktiverade från icke-aktiverade trombocyter att optimera användningen av trombocyter. Att tillhandahålla icke-aktiverade trombocyter till hematologi-onkologiska patienter kan minska sin hög risk att bli eldfasta.
Abstract
Trombocytantal lager baserat på screening microparticle innehåll i trombocytantal koncentrat är ett nytt kvalitet förbättring initiativ för sjukhusblodbanker. Celler fragment av mikropartiklar (MP) när de är stressade. Blod och blodkomponenter kan innehålla cellulära fragment från en mängd celler, främst från aktiverade trombocyter. När du utför sina roller som innate immuna celler och stora aktörer i koagulation och hemostas, trombocyter ändra form och generera mikropartiklar. Med dynamisk ljusspridning (DLS)-baserat microparticle upptäckt, är det möjligt att skilja aktiverat (hög microparticle) från icke-aktiverade (låg microparticle) trombocyter i transfusioner och optimera användningen av denna knappa blodprodukt. Tidigare forskning tyder på att tillhandahålla icke-aktiverade trombocyter för profylaktisk användning i hematologi-onkologiska patienter kan minska sin risk att bli eldfasta och förbättra patientvården. Målet med denna metod är att rutinmässigt skilja aktiveras från icke-aktiverade trombocyter. Den metod som beskrivs här beskriver stegen utföras för rutinmässig trombocytantal lagerhantering i en sjukhusblodbank: att få ett prov från en trombocyttransfusion, fylla på provet i kapillären för DLS mätning, utför DLS test till identifiera mikropartiklar och använda rapporterade microparticle innehåll för att identifiera aktiverade trombocyter.
Introduction
Intresset för mikropartiklar har kretsade främst runt deras deltagande i cellen till-cell kommunikation och biologiska processer. 1 , 2 , 3 mer nyligen, mikropartiklar har också rönt intresse som potentiella tidiga diagnostiska markörer för autoimmuna och kardiovaskulära sjukdomar. 4 , 5 mikropartiklar, även känd som extracellulära blåsor eller exosomes, har undersökts allmänt av flödescytometri. Tyvärr trots ansträngningar att standardisera konventionella flöde flödescytometri protokoll finns det ingen konsensus om optimal protokollet till använda. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Även om konventionell flödescytometri kan karakterisera särskilda MP subpopulations, rapporterade11 det har flera begränsningar. 11 , 12 , 13 , 14 några av dessa begränsningar har åtgärdats genom att använda högre effekt lasrar och detektorer i en så kallad ”små partiklar alternativet”,15,16 , samt upptäcka på 15 – 25 ° framåt scatter vinkel och modifierade slida trycket . 17 , 18 trots detta en snabb och lätt-till-använda screeningmetod som kan kombineras med dessa sofistikerade metoder krävs fortfarande att utnyttja mikropartiklar som tidig diagnostiska markörer. Förhöjda nivåer av mikropartiklar kan påvisas i ungefär en tredjedel av normal blodgivare19 och tyda subklinisk villkor. Följaktligen, hög microparticle nivåer i donerade blodprodukter kan vara inkompatibla med sårbara mottagarna. 20
När de tillhandahåller trombocyttransfusioner, finns det en risk för icke-immun refraktäritet - ett tillstånd vari en patients kropp avvisar i följd transfusioner och tillåter inte en betydande del av trombocyter att cirkulera. 21 , 22 icke-immun behandlingsresistens kan resultera i bortkastad transfusioner, hälsa komplikationer för patienter och utökade sjukhus vistelser. 23 som innehåller kick numrerar av mikropartiklar av trombocyter kan vara en bidragande faktor för utveckling av icke-immun refraktäritet i utsatta hematologi-onkologiska patienter. 20 det är möjligt att hantera trombocytantal lagret enligt sammansättningen av trombocyttransfusioner genom screening för mikropartiklar vilket minskar risken för utsatta patienter. Men de flesta microparticle tester kräver isolering av mikropartiklar från trombocyter5,12 eller är annars mycket labor intensiv24,25 och kan därför inte genomföras rutinmässigt på sjukhus blodbanker.
Den teknik som beskrivs använder här dynamisk ljusspridning (DLS) - även känd som fotonen korrelation spektroskopi eller kvasi elastisk ljusspridning. Decennier, har dynamisk ljusspridning flitigt använts inom läkemedelsindustrin för att karakterisera liposomalt drog formuleringar eller emulsioner där partikelstorlek är i intervallet sub micron. 26 , 27 men verktyg som utvecklats för dessa program inte är optimerade att skärmen blodprodukter. Ett nytt DLS system utvecklades för att övervinna tekniska begränsningar och gör dynamiskt ljus spridning användbar för screening av trombocyttransfusioner. 28
Dynamiska ljusspridning mätningar utförs av lysande de suspenderade partiklarna med laserljus och analysera tid variationen av spridda ljusintensiteten som är en följd av partiklar i suspension. Ytterligare, denna metod använder det omvända förhållandet mellan partikel hastighet och storlek - små partiklar rör sig snabbt och stora partiklar rör sig långsamt - att ge information om storlek distributioner och relativa koncentrationer av provet komponenter. Använda DLS, den genomsnittliga microparticle kan innehåll och genomsnittlig radie av komponenten microparticle kvantifieras. Innehållet i mikropartiklar i blod produkten ges som % MP baserat på området i uppmätta histogrammet för partikel radier från 50-550 nm. Medan partiklar med radier under 50 nm upptäcks av DLS och rapporteras av DLS systemet, de inte ingår i % MP. Snarare än isolera mikropartiklar från trombocyter, bestäms heterogenitet trombocyttransfusioner utifrån relativa innehållet av mikropartiklar och trombocyter i ett prov. I själva verket kan förhållandet av trombocyter och microparticle topparna användas för att beräkna absoluta MP koncentrationen när antalet trombocyter är känd. 19
DLS systemet ger hälso-och sjukvårdspersonal med kvalitativ och kvantitativ information om mikropartiklar som finns i prover från mänskligt blod eller blodprodukter. Den största fördelen med den beskrivna DLS-tekniken över alternativa tekniker såsom flödescytometri, elektronmikroskopi,29 nanopartiklar spårning analys30 eller avstämbara resistiv puls avkänning31 är provpreparering: alikvoter av trombocyter koncentrat kan mätas direkt utan att behöva isolera MP från trombocyter, provspädning eller andra ändringar. 9 , 17 dessutom DLS är en absolut dimensionering metod och lider inte brist på kalibrering pärlor med lämpliga brytningsindex. 14 , 32
En korrelation mellan trombocytaktivering och MP innehåll har tidigare visats genom mikroskopi33,20 och kan härledas från ökningen av MP innehåll i sjukdomstillstånd15,34, 35 , 36 och på in vitro- villkor känd för att aktivera trombocyter. 19 , 37 , 38 men ytterligare studier behövs för att fullt förstå förhållandet mellan DLS-mätt microparticle innehåll och trombocytantal aktivering. Baserat på våra nuvarande kunskaper att aktiverade trombocyter innehåller kick numrerar av mikropartiklar, de är bäst används för terapeutisk behandling av aktivt blödning patienter39, medan hematologi-onkologi patienter nytta av icke-aktiverade blodplättar med inga eller låga nivåer av mikropartiklar20. Det har nyligen rapporterats att in vitro- lyhördhet av givare blodplättar betydligt inte påverkade återhämtning och överlevnad av dessa blodplättar i enda blodtransfusioner till stabil, mestadels icke-blödande hematologi-onkologiska patienter40 . Av detta konstaterande, kan slutsatsen dras att trombocytaktivering som identifierats av hög MP innehåll också spelar ingen betydande roll i profylaktisk behandling av patienter. Dock på grund av det smala urvalet av patienter, denna studie inte upp effekterna av givare faktorer för komplexa patienter som är febril (undantagna från studien), inte stabil och får många mer än bara en trombocyttransfusion. Frågan hur komplexiteten i dessa patientfall kan minskas - som håller löftet att minska refraktäritet - förblir obesvarad.
Mikropartiklar är tidiga markörer av inflammation41,42,43,44 och trombocytantal aktiveringen45 och upptäcks därför hos många friska donatorer. 19 därför aktiverade trombocyter och mikropartiklar finns i trombocyter donationer. Det är rimligt att hypotes att patienter med feber, dvs en fullt aktiverat medfödda immunsystemet, inte tål den extra utmaningen av en transfusion av aktiverade trombocyter. Studier behövs dock för att bevisa denna hypotes. Microparticle screening kan lindra den nuvarande osäkerheten om innehållet i trombocyttransfusioner och minska komplexiteten i patientens behandling.
Förhållandet mellan aktiverade till icke-aktiverade trombocyter i en sjukhusblodbank beror primärt på givaren befolkningen och i mycket mindre grad på transport, bestrålning, patogen agens och andra processer som skulle kunna öka trombocytaktivering i koncentrat. 19 data från stora sjukhusblodbanker i USA visade att den genomsnittliga sammansättningen av trombocyter lagret är 49% aktiveras och 51% icke-aktiverade (intervallet för aktiverade trombocyter: 38-62%, personlig kommunikation). Om blod produktleverantörer eller sjukhusblodbanker vill veta hur många aktiveras och icke-aktiverade trombocyter koncentrat de producerar eller ta emot, och vill hantera sin inventering baserat på trombocytaktivering som anges av microparticle innehåll, detta protokollet kan vara lämplig för dem.
Baserat på trombocytantal sammansättning en sjukhusblodbank kommer att kunna direkt icke-aktiverade, homogen trombocyter för profylaktiskt använda och aktiverad, heterogena trombocyter för terapeutiskt bruk. Trombocytantal screening gör det möjligt för sjukhusen att maximera användningen av tillgängligt lager som förbättrar patientvården och minskar kostnaderna. Detta protokoll är avsedd för laboratoriepersonal som är bekant med grundläggande hantering och manipulering av blodprodukter.
Presenteras här är en screeningmetod för mikropartiklar i trombocyttransfusioner som rutinmässigt kan användas för att hantera sjukhus Blodbanken lager där det är önskvärt att välja produkt baserad på microparticle innehåll. Syftet med detta protokoll är att beskriva genomförandet och utvärderingen av DLS för screening av donerat trombocyter. Protokollet beskrivs behandlar de gemensamma frågorna av icke-invasiva tillgång till prover, integration av testning i Blodbanken arbetsflöde och prestandaegenskaper.
Protocol
Följande protokoll har utförts i enlighet med alla kanadensiska Blood Services (CBS) riktlinjer. Frivilliga gav samtycke till att deras donationer kan vara används för att utföra dessa undersökningar. Trombocytantal koncentrat var beredda enligt CBS standardrutiner. Alla individprövning beskrivs här genomfördes vid centrum för blod forskning vid University of British Columbia, Vancouver, Kanada med institutionella forskning etik styrelsens godkännande.
1. kvalitetskontroll kontrollera
- Utföra en kvalitetskontroll kontroll minst en gång per test dag att kontrollera DLS systemet fungerar tillfredsställande. Mäta de medföljande kontroll pärlor (50 nm radie) efter tillverkarens anvisningar för användning.
- Hämta kontroll injektionsflaskan från kylförvaring och tillåta 15 min till rumstemperatur. Pärlorna måste temperera vid rumstemperatur före användning.
- Slå på DLS systemet före förbereda provet så 15 min lasern värma upp perioden är klar när det första provet är klar för testning.
- När konsolen har startat, följ instruktionerna på pekskärmen för att logga in och välj alternativet System Test för att mäta stickprovet.
- Vortex blanda injektionsflaskan för 10 s för att säkerställa att ett representativt urval.
- Fyll en kapillär med kontroll pärlor med hjälp av en 100 µL fast volym pipett, pipettspetsen och kapillär från testutrustning.
- Följ instruktionerna på skärmen på DLS systemet när testet är klart.
Obs: Kontroll pärla testresultaten jämförs automatiskt med information som lagras i streckkodsetiketten kontroll pärla och ett PASS eller misslyckas anmälan samt prov information visas på skärmen DLS systemet i slutet av testet.
2. att få ett prov från en trombocytkoncentrat
Obs: Dessa steg beskriver processen för icke-invasiv provtagning från trombocyttransfusion in den DLS testning kapillär för rutinmässig trombocytantal lagerhantering. En översikt visas i figur 1. Krävs tillbehör: rör sealer, manuell tube Strippa, sax och splash sköld.
- Ta bort trombocytkoncentrat från otestade lagret.
- Få ta prov av trombocyter produkten antingen från en oanvänd provtagning påse (och fortsätt till steg 2,3) eller en slang-segmentet (Fortsätt till steg 2,4 om tomma eller steg 2.5 om inte tom).
För att koppla bort påsen använder slangar eller rör segmentet en tube sealer. För att styra röret sealer, följ tillverkarens anvisningar. Kort, klämma slangen att beseglas i en exakt placering mellan två uppvärmda käkar. I en handdator, tryck den smält slangar tillsammans och cool under högt tryck och samtidigt trycka på spaken (varaktighet indikeras av grönt ljus) vilket resulterar i en permanent, läckagesäker tätning. -
Provtagning från en påse
- Blanda innehållet i trombocytantal påsen väl av mild horisontell rörelse för 5 s (tipping från början till slut fem gånger).
- Öppna klämman till påsen. Påsen är evakuerade och fyller själv. Det är inte nödvändigt att fylla påsen helt som bara 100 µL prov kommer att krävas för DLS testning.
- Koppla bort påsen från påsen av värme tätning anslutning slang med en tube sealer. Fortsätt med steg 3.
-
Provtagning från tomma slangar
- Kontrollera att antalet trombocyter väska slangar har lagrats Tom och slangar blocket är fortfarande på plats. Inspektera slangen för att kontrollera att det inte är en betydande mängd trombocytkoncentrat i slangen. Om slangen inte är tom fortsätter du med steg 2.5.
- Stäng tube strippan på slangen som nära blocket slangar som möjligt genom att komprimera handtagen för att klämma slangen mellan rullarna.
- Häng väskan vertikalt och hålla komprimera strippa handtagen.
- Medan att hålla strippan stängda, släppa blocket slangar.
- Dra långsamt strippan ner Tom slangen möjliggör slangen sakta fylla bakom strippan. Fortsätta tills avsnittet nedan strippan har fullt uppblåst eller strippan är inom 1 tum av slutet av slangen.
- När stoppställe nås med strippan, användning av tube GRUNDPOLISH för värme tätning slangen 1 tum ovanför strippan.
- Släppa handtagen på manuell tube strippan.
- Värme tätning igen 1 till 2 inches ovanför den tidigare tätningen för att skapa segmentet testning.
- Avskurna segmentet testning från trombocyter enheten. Detta segment kommer att användas för DLS testning.
-
Provtagning från slangar som inte är tom
- Häng väskan vertikalt och släppa slang blocket om på plats.
- Inspektera slangen för att avgöra om det finns någon betydande fasta klumpar. Om fasta klumpar existerar, täta över dem så att de inte kan demonteras i påsen.
- Stäng tube strippan på slangen som nära den slutna änden av slangen som möjligt.
- Tömma innehållet i slangen i påsen genom att komprimera handtagen för att klämma slangen mellan rullarna och bibehållen klämkraften, flytta röret strippan längs slangen mot påsen.
- Ta bort trombocytantal påsen från hängande krok och blanda försiktigt påsen för 5 s genom att tippa det från början till slut fem gånger samtidigt strippan stängd.
- Häng väskan vertikalt samtidigt strippan stängd.
- Dra långsamt den strippa ner Tom slangen, vilket möjliggör slangen sakta fylla bakom strippan. Fortsätta tills avsnittet nedan strippan har fullt uppblåst eller strippan är inom 1 tum av slutet av slangen.
- När stoppställe nås med strippan, användning av tube GRUNDPOLISH för värme tätning slangen 1 tum ovanför strippan.
- Släpp strippan.
- Värme tätning igen 1 till 2 inches ovanför den tidigare tätningen för att skapa segmentet testning.
- Skär av och kassera den sista delen av slangen.
- Avskurna segmentet testning från trombocyter enheten. Detta segment kommer att användas för DLS testning.
3. fyllning provet i den DLS testning kapillär
- Med ett stänk sköld och ren, torr sax, klippa ena änden av påsen slangar eller testa segmentet.
Obs: Kapillären används för DLS testning bör fyllas omedelbart. - Fyll kapillären med hjälp av provtagning (monterade 100 µL fast volym pipett, pipettspetsen och kapillär) för att dra in provet direkt från öppnade påsen eller slangar segment i kapillären.
- Försegla botten av fyllda kapillären genom att försiktigt trycka den fyllda kapillären i kapillärrör tätningsmedlet medan en lätt vridning och vissa tryck mot facket.
- Koppla bort den 100 µL fasta volymen pipett och tips från kapillären, säkerställa kapillären förblir väl förankrade i kapillärrör tätningsmedlet.
- Ta bort kapillären från kapillärrör tätningsmedel facket, torka med en isopropylalkohol pad och se till att inga luftbubblor är instängd av försiktigt snärta botten av kapillären.
- Placera kapillären i DLS systemet.
4. utför testet DLS
- Välj alternativet MP test att inleda ett nytt DLS-test för att mäta microparticle innehållet i ett trombocytantal prov.
- Ange provet information (Donation identifiering nummer (ISBT), samling/produktion utgångsdatum och produktkod) med streckkodsläsaren eller manuellt.
- Om ingen produktkoden är tillgänglig som DLS systemet kan extrahera den flytande medium informationen, Välj lämpligt flytande medium manuellt (för de flesta trombocytantal koncentrat Välj plasma men för prover som innehåller trombocyter tillsatsen lösning (PAS), ange den (andelen kvarstående plasma).
Obs: En liten avvikelse i PAS procentandelen från den nominella 65% kommer att orsaka ett litet fel i viskositet (beräknas automatiskt av systemet för DLS) som minimalt påverkar den beräknade MP radie men inte % MP. - Placera kapillären i DLS systemet när instruerade och starta testet.
- När testet är klart, ta bort provet från kapillär innehavaren och kassera förbrukningsvaror på lämpligt sätt enligt anläggning riktlinjer. Ta bort provet från kapillär innehavaren och kassera förbrukningsvaror på lämpligt sätt enligt anläggning riktlinjer.
- Tagga trombocytantal påsen med färg motsvarar resultatet, till exempel orange för icke-aktiverade (homogena) med % MP lika eller under 15% och rosa för aktiveras (heterogena) med % MP över 15%.
Figur 1 : Metoden översikt. Översikt över de steg som ska utföras för rutinmässig trombocytantal lagerhantering i en sjukhusblodbank: att få ett prov från ett trombocytantal koncentrat, fylla på provet i kapillären för DLS mätning, utför DLS test för att identifiera mikropartiklar och använder den rapporterade microparticle innehåll att identifiera aktiverade trombocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Genomsnittliga förberedelsetid
Antalet trombocyter screening process använder ett DLS sammanfattas i figur 1. Trombocyter är testade med DLS systemet vid tidpunkten för mottagandet av blod leverantören. Som anges i tabell 1 , är den genomsnittliga förberedelsetiden för utbildade användare 2 min 23 s medan saneringen och post-test arbetstider är 14 s och 46 s, respektive. Totalt, den genomsnittliga användaren tar 3 min och 23 s hands-on tid per test.
| Verksamhet | Aktiv tid | Promenad-away testtid | TOTALT |
| Förbereda DLS System | 14 s | ||
| Montera provtagning verktyg | 28 s | ||
| Erhålla segment | 52 s | ||
| Fyll kapillär och starta testet | 49 s | ||
| 5 min | |||
| Städa upp | 14 s | ||
| Tag och inventering trombocytantal väska | 46 s | ||
| Totala tidsåtgången per prov | 3 min 23 s | 5 min | 8 min 23 s |
Tabell 1: aktiv testning tid nedbrytningen. Är testet i sig är en promenad bort test med en genomsnittlig löptid på 5 min. Den genomsnittliga användaren tar 3 min 23 s att förbereda DLS systemet för ett test, få en prov efter detta protokoll och tagga trombocytantal påsen.
Precision
Precisionen i DLS systemet utvärderades på tre microparticle nivåer, 0-7%, 12-25% och 28-75%. Kliniskt relevanta är % MP 3-75%. Två operatörer testade låg, medium och hög kontrollprover för 16 operativa dagar på två DLS system parallellt. Prover testades i två exemplar, men i slumpmässig ordning på varje testing dag.
Tabell 2 sammanfattar inom enheten precision DLS mätningarna för procent mikropartiklar (% MP) i förhållande till trombocyter.
| Microparticle innehåll | |||
| Låg | Medium | Hög | |
| Menar % MP (%) | 4.4 | 19,5 | 53,8 |
| Standardavvikelse (%) | 1.8 | 2.6 | 5.8 |
| CV (%) | 40,4 | 13.2 | 10.6 |
Tabell 2: inom enheten precision av procent mikropartiklar (% MP). På mycket låga microparticle innehåll små trombocyter kan bidra till % ökad MP vilket resulterar i variabilitet för låg microparticle innehåll prover.
Tabell 3 visar inom-enheten precision DLS mätningarna för genomsnittliga microparticle radie mellan 50-550 nm.
| Microparticle innehåll | |||
| Låg | Medium | Hög | |
| Menar radie (nm) | 331 | 161 | 188 |
| Standardavvikelse (mm) | 133 | 41 | 25 |
| CV (%) | 40,1 | 25,2 | 13,5 |
Tabell 3: inom enheten precision för microparticle radius. På mycket låga microparticle innehåll små trombocyter kan bidra till procent mikropartiklar (% MP) vilket resulterar i ökad variabilitet för låg microparticle innehåll prover.
Tabell 4 visar reproducerbarheten för DLS mätningar för procent mikropartiklar (% MP).
| Microparticle innehåll | |||
| Låg | Medium | Hög | |
| Menar % MP (%) | 4.4 | 29,2 | 53,6 |
| Reproducerbarhet (%) | 1.5 | 2.3 | 5 |
| CV (%) | 35 | 11,8 | 9,4 |
Tabell 4: Reproducerbarhet av dynamisk ljus spridning (DLS) mätningar för procent mikropartiklar (% MP).
Linjäritet
Figur 2 visar att DLS resultat är linjär, dvspassar en rak linje med avseende på de tilldelade värdena av proverna. Sju prover var förberedda med olika microparticle innehåll. Prover med hög (MP7) och låg (MP1) microparticle innehåll och matchande trombocytantal koncentration var beredd och blandas på olika nyckeltal att skapa mellanliggande prover (MPx). Prover testades med flödescytometri som tidigare beskrivits19 och DLS och % MP resultat vid varje koncentration var ritade som indata och utdata. Determinationskoefficienten har befunnits vara 0.985. Exempel på DLS histogram för låga och höga microparticle innehåll visas i figur 3A. DLS resultaten bekräftades av flödescytometri (figur 3B).
Figur 2 : Jämförelse av flödescytometri och DLS resultat. Linjärt samband mellan % MP bestäms av Flow flödescytometri (ingång) och DLS (produktionen), ursprungliga DLS data från de två prover som präglas av den öppna symbol ○ visas i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Microparticle innehåll att skilja mellan aktiverad och icke-aktiverade trombocyter. (A) DLS resultaten av MP innehåll i aktiverade trombocyter (streckad linje) var 57% jämfört med 4% i icke-aktiverade trombocyter (heldragen linje). Tester utfördes vid en mätning temperatur av 37 ° C, plasma viskositet inställningen av 1,06 x10-3 Pa·s och totala intensitet inställningar mellan 200-600 kHz. (B) Flow flödescytometri resultaten (som tidigare beskrivits19) samma prover som visas i (A). i framåt scatter histogrammen representerar P1 och P2 MP och trombocyter grindarna, respektive; för aktiverade trombocyter föll (vänster) 76% av händelser i MP grinden jämfört med 6% för icke-aktiverade trombocyter (höger). En linjär regressionslinje föreslår en konstant relativa bidrag bakgrundsljud till % MP av flödescytometri som leder till de genomgående högre resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Specificitet/störningar
International Organization for Standardization (ISO) definierar analytisk specificitet som förmågan hos en mätmetod för att identifiera eller mäta endast mätstorheten medan det finns andra kvantiteter som finns i provet. Microparticle screening analytisk specificitet kan påverkas av röda blodkroppar (RBC). DLS åtgärder MP innehåll i förhållande till trombocyter innehåll. RBC interferens eftersom scattering bidrag RBC ingår i scattering bidrag av blodplättar, vilket minskar det relativa bidraget av MP. Reglerande gränser för tillåtna RBC innehållet i blodprodukter finns; en konservativ konvertering av tröskeln rekommenderas av AABB för tillåtna RBC koncentration i trombocytantal koncentrat-2 mL packade RBC i en enhet av trombocyter-resulterade i 8.0 x1010 celler/L (antaganden: RBC volym är 8,5 x10-14L, hematokrit av packade RBC är 68%, trombocyter enhet är 200 mL). De rapporterade kvarstående RBC koncentrationerna i olika produkter är långt under detta tröskelvärde46.
Tre olika givare donerade trombocyter och röda blodkroppar (RBC) på två olika dagar, som berättigade till tre oberoende experiment. RBC innehåll i det trombocytantal koncentrat (referensprov) var 0,05 - 0,15 x109 celler/L bestämd med en hemocytometer. Fem ytterligare prover skapades av tillsatta-i kända mängder RBC i alikvoter av trombocytkoncentrat; målnivåerna RBC i dessa prover var 1.0, 5.0, 10, 40 och 80 x109 celler/L.
Tröskeln för störningar av röda blodkroppar var cirka 1,0 x1010 celler/L (figur 4), som också korrelerade med den nivå där förekomst av röda blodkroppar var visuellt tydligt (figur 5). Över denna nivå underskattades % MP vilket innebär att i visuellt röda prover-som innehåller RBC i stället för hemoglobin-den rapporterade microparticle innehåll blir för låg.
Figur 4 : Linjärt samband mellan % MP (DLS) och RBC koncentration (celler/L). Ökande RBC koncentrationer av 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010och 8,0 x1010 celler/L (från vänster till höger) från 3 oberoende experiment (○ experiment 1, ● experiment 2, □ experiment 3, linjär regression rader visas för varje experiment). Ovanför 1.0 x1010 RBC/L leder till underskattning av % MP. Utseendet på RBC innehållande prover visas i figur 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Utseendet på RBC prover som innehåller. Rodnad av trombocyter prover som innehåller RBC koncentrationer av 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010och 8,0 x1010 celler/L från vänster till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Noggrannhet
Noggrannhet definieras som skillnaden mellan en enda mätresultatet och en sann kvantitet värde som tilldelas till provet. Detta mätfel innehåller en systematisk beräknad av mätfel och en slumpmässiga komponenten beräknad av en standardavvikelse. Riktigheten av en mätresultatet är således en kombination av riktighet och precision.
En pärla som standard användes för att bestämma riktigheten av de DLS-testet. Noggrannhet utvärderades vid två koncentrationer inom intervallet kliniskt relevant för analysen av 3-75% MP. Referens pärla blandningar användes att förbereda prover av kända koncentrationer eftersom referens pärlor har en känd storlek och koncentration. Följaktligen kan hänvisningen pärlor blandas för att erhålla prover med önskad partikelstorlek och koncentrationer.
Vanlig polystyren pärlor med en 125 nm radie användes för att representera mikropartiklar och pärlor med 1,5 µm radie användes för att representera trombocyter. Noggrannheten av microparticle analysen bedömdes med pärla blandningar av ungefärligt 20% och 50% MP innehåll. Riktigheten av uppmätta partikel radierna jämfördes med partikel radierna dokumenteras på en certifikat av analys för referens pärlorna som visas i tabell 5.
| 125 nm pärlor | 1,5 µm pärlor | |||||
| Analyscertifikat | Analyscertifikat | |||||
| 20% MP | 50% MP | 20% MP | 50% MP | |||
| Menar radie | 122.0 | 113.8 | 124,4 | 1.5 | 1.6 | 1,60 |
| STDAV | 4.5 | 2,83 | 3.6 | 0,035 | 0,06 | 0,07 |
| CV | 3,60% | 2.48% | 2,89% | 2,20% | 3,74% | 4,05% |
| Noggrannhet | 6,70% | 2,00% | 6,50% | 6,30% | ||
Tabell 5: mätnoggrannheten dynamisk ljus spridning (DLS). Storleksjämförelse för DLS resultat mot analyscertifikat för pärlor med 125 nm radie och 1,5 µm radie i blandningar.
Discussion
Det här protokollet beskriver en dynamisk ljusspridande metod för microparticle screening optimerad för de höga partikel koncentrationer finns i biologiska prover såsom trombocyter koncentrerar. Metoden för DLS är till sin natur standardiserade för att noggrant mäta storlek. Den relativa koncentrationen av mikropartiklar kan omvandlas till en absolut koncentration om trombocytantalet koncentrationen är känt och trombocytantal toppens används som referens peak19. Som trombocyter koncentrationer erhålls vanligen med hematologi analysatorer eller flöde cytometers dessa metoder kan anses följeslagare teknik till DLS.
Funktionaliteten i DLS systemet är försäkrad genom att köra kontroll pärlor regelbundet. Destillerat vatten kan mätas för att kontrollera att bakgrundsljud är minimal. Kommersiellt tillgängliga trombocytantal standarder kan analyseras som MP-negativa kontroller och, efter tillägg av 125 nm radie pärlor, som MP-positiva kontroller. Inom de biologiska utbud av MP koncentrationerna av intresse är förfarandena praktiskt och snabbt att utföra som en del av rutinen Blodbanken.
I motsats till flödescytometri, är denna metod inte baserad på att jämföra stödnivåerna som spridning av partiklar men snarare hastigheten på deras Brownsk rörelse. Således exosomes kan också upptäckas trots sin litenhet och rapporteras separat från MP.
Utformad som en screeningmetod, är begränsningarna med denna metod relaterade till dess oförmåga att skilja mellan olika typer av mikropartiklar. Det finns potentiella utrymme för förbättring om ytterligare isolering steg används; prov kan testas innan och efter specifika avlägsnande av mikropartiklar genom antikropp tillsammans magnetiska pärla capture. Dessutom kan antas det inte att alla upptäckta mikropartiklar är cellen eftersom kylomikroner bildas i hyperlipidemi47,48 och små bakterier eller virus6 kommer också att redovisas i intervallet microparticle. Andra skyddsåtgärder finns dock inom blodtillförseln till undvika mycket lipemiska eller förorenade trombocyter att ange sjukhus Blodbanken lagret.
Val av antikoagulans i provet påverkar omfattningen av trombocytaktivering och därför de MP innehåll49. Denna faktor måste beaktas för jämförelser av olika produkter. Dessutom utbyte av plasma med MP gratis suspension media såsom PAS kommer att påverka halten MP och tröskeln för fastställande av heterogenitet-om bara ungefär en tredjedel av den ursprungliga MP-innehållet är kvar inom den kvarvarande plasman i koncentratet en med detta anger lägre MP innehåll tröskelvärde samma nivå av trombocytaktivering som i 100% plasma. Procent MP är det MP innehållet i förhållande till trombocyter. Tidigare rapporterades det att den genomsnittliga trombocyttal på PAS produkt var lägre så att den genomsnittliga % MP fortfarande var 9,5%19. Tröskelvärdet % MP för PAS trombocyter licens i USA är inställd till 10%.
Medan den primära källan för MP i trombocytantal koncentrat är givaren, processer som orsakar stress till trombocyter kommer att öka MP beroende på känslighet av trombocyter att betona-om trombocyter aktiveras redan mycket, mindre stressfaktorer som utökad hållbarhetstid, patogen agens, tvättmaskin, kan bestrålning eller långväga transporter leda till betydande ökning av MP innehåll. Ingen av dessa stressorer har visat sig påverka homogen, icke-aktiverade trombocyter19. Dessutom skall uppmärksamhet ägnas risken för förändringar i provets sammansättning inom kapillären om inte testas omedelbart efter beredning (slutförandet av steg 3 i detta protokoll).
Fokus i detta protokoll är att fastställa sammansättningen av partiklar i trombocyttransfusioner och att använda mikropartiklar som biomarkörer för trombocytaktivering. Trombocyttransfusioner är taggade som antingen icke-aktiverade (orange) eller aktiveras (rosa) baserat på en microparticle procentuella tröskelvärdet på 15%. Tröskelvärdet på 15% MP för trombocyter i 100% plasma fastställdes empiriskt genomsnitt 66: e percentilen från flera platser.
Syftet med trombocytantal lager baserat på rutinmässiga microparticle screening med DLS är att förbättra patientens vård och bilresa kostnadseffektivitet genom att förhindra icke-immun trombocytantal refraktäritet. Genomförandet av DLS systemet för screening av trombocyter väskor kommer aktivera användaren direkt icke-aktiverade trombocyter att patientpopulationer mest risk att utveckla trombocytantal refraktäritet.
Disclosures
EMS är grundare av LightIntegra Technology Inc., ett medicintekniskt företag att utveckla ThromboLUX systemet för microparticle och trombocytantal kvalitetstester. Alla andra författare är anställda av LightIntegra teknik. Produktion och gratis tillgång till den här artikeln är sponsrad av LightIntegra Technology Inc.
Acknowledgments
Vi tackar blodgivarna och Personalen på kanadensiska blodcentral tjänster nätverk för tillämpad utveckling för insamling och produktion av trombocyter enheter används i denna studie. Vi erkänner Kanada Stiftelsen för Innovation och stiftelsen Michael Smith för hälsoforskning för finansiering av infrastruktur i UBC centrum för blod forskning. Finansiering för publikationen lämnades av LightIntegra Technology Inc., tillverkare av ThromboLUX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThromboLUX-M | LightIntegra Technology Inc. | LPN120 | DLS System |
| ThromboSight Software | LightIntegra Technology Inc. | LPN124 | DLS analysis software |
| Capillaries | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) | LPN065 | Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated |
| MiniPet | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) | LPN082 | 100 µL fixed volume pipette for sampling |
| MicroFlex 1-200 µL Pipette tips | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) | LPN080 | Pipette tips for sampling |
| Critoseal | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) | LPN075 | Capillary Tube Sealant |
| Dukal Alcohol Pad or equivalent | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) | LPN085 | Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol) |
| Control beads, 50 nm radius | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) | LPN128 | Control beads |
| Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm | PolySciences Inc. | 64060 | Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
| Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm | PolySciences Inc. | 64014-15 | Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
| Genesis BPS RapidSeal II or equivalent | Genesis BPS | 428-SE640 | Tube sealer |
| Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent | Fresenius Kabi | 6R4452 | Manual tube stripper |
| Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent | CardinalHealth | S1389-75 | Splash Shield |
| Corning LSE Vortex Mixer or equivalent | Corning Incorporated | 6775 | Vortex mixer |
| FACSCanto II Flow cytometer with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent | BD Biosciences | 338960 | Flow cytometer |
References
- Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
- Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
- Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
- Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 36-45 (2013).
- Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
- Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812 (2015).
- Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
- Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
- Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
- Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
- Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
- Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
- Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
- Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
- Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
- Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
- Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
- Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
- Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
- Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
- Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
- Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
- Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293 (2016).
- Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
- Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, Suppl 1 54-61 (2014).
- Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
- Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
- Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
- Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67 (2011).
- Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
- Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
- Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
- Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779 (2017).
- Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).
