Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Rutine Screening metode for Microparticles i blodplater blodoverføringer

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56893
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3,4
1Research & Development, LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory, LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research, University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

Summary

Blodplater Lagerstyring basert på screening microparticle innhold i blodplater konsentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ i sykehuset blodbanker. Målet er å skille aktivert fra ingen-aktivert blodplater å optimalisere bruk av blodplater. Gir ingen-aktivert blodplater hematologi-onkologi pasienter kan redusere deres høy risiko for å bli ildfaste.

Abstract

Blodplater Lagerstyring basert på screening microparticle innhold i blodplater konsentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ for sykehuset blodbanker. Celler fragment av microparticles (MP) når de er stresset. Blod og blod komponenter kan inneholde mobilnettet fragmenter fra en rekke celler, særlig fra aktivert blodplater. Når du utfører sin rolle som medfødt immunceller og store aktørene i koagulering og hemostasen, blodplater sylinder og generere microparticles. Med dynamisk lysspredning (DLS)-basert microparticle deteksjon, er det mulig å skille aktivert (høy microparticle) fra ingen-aktivert (lav microparticle) blodplater i blodoverføringer, og optimalisere bruken av knappe blod produktet. Tidligere forskning tyder på at gir ingen-aktivert blodplater for forebyggende bruk i hematologi-onkologi pasienter kan redusere risikoen for å bli ildfaste og forbedre pasientbehandlingen. Målet med denne metoden screening er å rutinemessig skille aktiveres fra ingen-aktivert blodplater. Metoden beskrevet her beskriver trinnene utføres for rutinemessig Platederivert lagerstyring i et sykehus blod bank: få et utvalg fra en trobmocyttransfusjon, laste utvalget i kapillær for DLS måling, utfører DLS test identifisere microparticles og bruke rapporterte microparticle innholdet for å identifisere aktivert blodplater.

Introduction

Interessen for microparticles har handlet stort sett deres engasjement i celle til celle kommunikasjon og biologiske prosesser. 1 , 2 , 3 nyligere microparticles har også tiltrukket interesse som potensielle tidlig diagnose markører av autoimmune og hjerte sykdommer. 4 , 5 Microparticles, også kjent som ekstracellulære blemmer eller exosomes, har vært mye undersøkt av flowcytometri. Dessverre, til tross for forsøk på å standardisere konvensjonelle flyt cytometri protokoller det er ingen enighet optimal protokollen du bruker. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

Selv om konvensjonelle flowcytometri kan beskrive spesifikke MP subpopulasjoner, rapportert11 har flere begrensninger. 11 , 12 , 13 , 14 noen av disse begrensningene er rettet med høyere makt lasere og detektorer i en såkalt "små partikler alternativet",15,16 samt gjenkjenning på 15 ° - 25 ° forover splitte vinkel og endret skjede press . 17 , 18 likevel en rask og lett-å-bruke screening metode som kan kombineres med disse sofistikerte metoder er fortsatt behov å benytte microparticles som tidlig diagnostisering markører. Forhøyede nivåer av microparticles er i omtrent en tredjedel av normale blod givere19 og kan indikere subklinisk forhold. Følgelig kan høy microparticle nivåer i donert blod være inkompatibel med sårbare mottakere. 20

Når gir Platederivert blodoverføringer, er det en risiko for ikke-immune ildfasthet - en tilstand der en pasientens kropp avviser påfølgende blodoverføringer og tillater ikke at en betydelig del av blodplater å sirkulere. 21 , 22 ikke-immune ildfasthet kan føre til bortkastet blodoverføringer, sunnhet komplikasjoner for pasienter og utvidet sykehus opphold. 23 Platederivert blodoverføringer inneholder høye tall for microparticles kan være en medvirkende faktor for utvikling av ikke-immune ildfasthet i sårbare hematologi-onkologi pasienter. 20 det er mulig å styre Platederivert lageret i henhold til sammensetningen av blodplater transfusjoner av screening for microparticles og dermed redusere risikoen for sårbare pasientene. Men de fleste microparticle tester krever isolering av microparticles fra blodplater5,12 eller er ellers veldig arbeidskraft intensiv24,25 og derfor ikke kan gjennomføres rutinemessig i sykehus blodbanker.

Teknikken er beskrevet bruker her dynamiske lysspredning (DLS) - også kjent som Foton korrelasjon spektroskopi eller kvasi elastisk lysspredning. I flere tiår, er dynamisk lysspredning mye brukt i farmasøytisk industri som karakteriserer liposomal medikament formuleringer eller emulsjoner hvor partikkelstørrelser er i området sub-mikron. 26 , 27 men verktøy utviklet for disse programmene er ikke optimalisert til skjermen blodprodukter. En ny DLS-systemet ble utviklet for å overvinne tekniske begrensninger og gjøre dynamisk lys spredning nyttig for screening av blodplater blodoverføringer. 28

Dynamisk lysspredning mål utføres ved å belyse suspenderte partiklene med laserlys og analysere tid variasjonen av spredte lysintensiteten som en konsekvens av partikler i suspensjon. Videre, denne metoden bruker den inverse forholdet mellom partikkel hastighet og størrelse - små partikler flytte raskt og store partikler gå sakte - å gi informasjon om størrelse distribusjoner og relativ konsentrasjoner av prøven komponentene. Bruke DLS, mener microparticle kan innhold og mener radius av komponenten microparticle kvantifiseres. Innholdet i microparticles i at produktet er gitt som % MP basert på området i målt histogrammet for partikkel radier fra 50-550 nm. Mens partikler med radier under 50 nm oppdages av DLS og rapportert av DLS systemet, de ikke er inkludert i % MP. Snarere enn å isolere microparticles fra blodplater, bestemmes heterogenitet av blodplater blodoverføringer basert på relative innholdet av microparticles og blodplater i et utvalg. Faktisk kan forholdet mellom toppene blodplater og microparticle brukes til å beregne den absolutte MP konsentrasjonen når antall blodplater er kjent. 19

DLS systemet gir helsepersonell kvalitativ og kvantitativ informasjon om microparticles i prøver fra menneskelig blod eller blodprodukter. Den største fordelen med beskrevet DLS teknikken over alternative teknikker som flowcytometri, elektronmikroskop,29 hydrogenion sporing analyse30 eller tunable resistiv puls sensing31 er prøven utarbeidelse: dele Platederivert konsentrater kan måles direkte uten å isolere MP blodplater, prøve fortynning eller andre endringer. 9 , 17 i tillegg DLS er en absolutt størrelse metode og lider ikke av mangel på kalibrering perler med passende brytningsindeks. 14 , 32

En sammenheng mellom Platederivert aktivisering og MP innhold har tidligere vist av mikroskopi33,20 og kan konkluderes fra økningen i MP innhold i patologiske forhold15,34, 35 , 36 og vilkår i vitro kjent å aktivere blodplater. 19 , 37 , 38 men videre studier er nødvendig å forstå forholdet mellom DLS-målt microparticle innhold og blodplater aktivisering. Basert på vår nåværende kunnskap at aktivert blodplater inneholder høyt antall microparticles, de er best brukt for terapeutisk behandling av aktivt blødning pasienter39, mens hematologi-onkologi pasienter nytte av ingen-aktivert blodplater uten eller lave nivåer av microparticles20. Det har nylig blitt rapportert at i vitro respons av donor blodplater ikke betydelig innvirkning utvinning og overlevelse av disse blodplater i enkelt blodoverføringer stabil, hovedsakelig ikke-blødning hematologi-onkologi pasienter40 . Fra dette funnet, kan det konkluderes at Platederivert aktivisering identifisert av høye MP innhold spiller også noen betydelig rolle i den forebyggende behandlingen av pasienter. Men på grunn av det smale utvalget av pasienter, denne studien ikke opp effekten av donor faktorer for komplekse pasienter som er febril (unntatt fra studien), ikke stabil og motta mange mer enn bare en trobmocyttransfusjon. Spørsmålet hvordan kompleksiteten i disse pasienten tilfeller kan reduseres - som holder løftet om å redusere ildfasthet - forblir ubesvart.

Microparticles er tidlig markører betennelse41,42,43,44 og blodplater aktivisering45 og registreres derfor i mange vanlige givere. 19 derfor aktivert blodplater og microparticles er tilstede i blodplater donasjoner. Det er rimelig å hypothesize at pasienter med feber, dvs. en fullstendig aktivert medfødte immunsystemet, ikke kan tolerere flere utfordringen med en blodoverføring av aktivert blodplater. Men for studier å bevise denne hypotesen. Microparticle screening kan lindre gjeldende usikkerheten om innholdet av blodplater blodoverføringer og redusere kompleksiteten i pasientbehandling.

Forholdet mellom aktivert å ingen-aktivert blodplater i et sykehus blod bank avhenger hovedsakelig befolkningen donor og i mye mindre grad på transport, bestråling, patogen inaktivering og andre prosesser som kan øke Platederivert aktivering i konsentrerer. 19 data fra store sykehus blodbanker i USA viste at gjennomsnittlig sammensetningen av blodplater lageret er 49% aktivert og 51% ingen-aktivert (området for aktivert blodplater: 38-62%, personlig kommunikasjon). Hvis blodet produktet leverandører eller sykehus blodbanker vil vite hvor mange aktivert og ingen-aktivert blodplater konsentrerer de produserer eller motta, og vil behandle lagerbeholdningen basert på Platederivert aktivisering som indikert av microparticle innhold, dette protokollen kan være passende for dem.

Basert på Platederivert komposisjon en sykehus blodbank vil kunne ikke aktiveres, homogen blodplater for forebyggende bruk og aktivert, heterogene blodplater for terapeutisk bruk. Blodplater screening kan sykehus å maksimere bruken av tilgjengelig lager som forbedrer pasientbehandling og reduserer kostnadene. Denne protokollen er ment for laboratoriepersonell som er kjent med grunnleggende behandling og manipulering av blodprodukter.

Presenteres her er en screening metode for microparticles i blodplater blodoverføringer som rutinemessig kan brukes for å administrere sykehus blod bank lageret der det er ønskelig å velge produkt basert på microparticle innhold. Målet med denne protokollen er å skissere gjennomføring og vurdering av DLS for screening av donert blodplater. Beskrevet protokollen løser vanlige spørsmål om ikke-invasiv tilgang til prøvene, integrering av testing i blodbank arbeidsflyt og ytelse.

Protocol

Følgende protokollen er utført i samsvar med alle kanadiske blod tjenester (CBS) retningslinjer. Frivillige ga samtykke som donasjoner kunne brukes til å utføre disse studiene. Blodplater konsentrater ble utarbeidet etter CBS standard operasjonsprosedyrer. Alle ytelsestesting beskrevet her ble gjennomført i sentrum for Blood forskning ved University of British Columbia, Vancouver, Canada med institusjonelle forskning etikk styret godkjenning.

1. kvalitetskontroll av

  1. Utføre en kvalitetskontroll sjekk minst en gang per testing dag å verifisere riktig drift av DLS systemet. Måle gitt kontroll perler (50 nm radius) følg produsentens instruksjoner for bruk.
  2. Hente kontroll ampullen fra kald oppbevaring og la 15 minutter for å varme til romtemperatur. Perlene må equilibrate til romtemperatur før bruk.
  3. Aktivere DLS systemet før forberede prøven så 15 min laser varme opp periode er fullført når første smakebit er klar for testing.
  4. Når konsollen har startet, følg instruksjonene på berøringsskjermen til å logge deg på og velger systemtest å måle kontroll prøven.
  5. Vortex blande ampullen for 10 å sikre et representativt utvalg.
  6. Fyll en kapillær med kontroll perler med en 100 µL fast volum pipette, pipette tips og kapillær fra test kit.
  7. Når testen er ferdig Følg instruksjonene på skjermen til DLS systemet.
    Merk: Kontroll perle testresultatene er automatisk i forhold til informasjonen som er lagret i kontrollen perle strekkodeetikett og et PASS eller FAIL varsling samt eksempler vises på DLS skjermen på slutten av testen.

2. få laget et eksempel fra et Platederivert konsentrat

Merk: Disse trinnene beskriver prosessen for ikke-invasiv utvalg fra trobmocyttransfusjon i DLS testing kapillær for rutinemessig Platederivert Lagerstyring. Det vises en oversikt i figur 1. Nødvendig tilbehør: rør sealer, manuell tube stripper, saks og splash skjold.

  1. Fjerne Platederivert konsentrat av utestet lageret.
  2. Få prøven av blodplater produktet enten fra en ubrukt prøvetaking posen (videre til trinn 2.3) eller et rør segment (fortsette til trinn 2.4 om Tom trinn 2.5 hvis ikke tom).
    For å koble poseen bruker rør eller rør segmentet en tube sealer. For å operere tube sealer, følger du instruksjonene fra produsenten. Kort, klemme slangen til å bli beseglet på en nøyaktig posisjon mellom to oppvarmede jaws. En håndholdt enhet, trykk smeltet rør sammen og kjølig under høytrykk mens å trykke spaken (varigheten er angitt med grønt lys) resulterer i en permanent, tette forsegling.
  3. Prøvetaking fra en pose
    1. Bland innholdet av blodplater posen godt mild horisontal bevegelse for 5 s (tipping fra ende til ende fem ganger).
    2. Åpne klemmen til posen. Posen er evakuert og fyller selv. Det er ikke nødvendig å fylle posen helt som kun 100 µL prøven vil være nødvendig for DLS tester.
    3. Koble poseen fra posen ved varme tetting oppkobling rør med en tube sealer. Fortsett med trinn 3.
  4. Prøvetaking fra Tom rør
    1. Kontroller at Platederivert bag slangen er lagret tom og rør blokken er fortsatt på plass. Visuelt inspisere slangen for å kontrollere at det ikke er betydelig Platederivert konsentrere slangen. Hvis forbindelsesslangen ikke er tom fortsetter du med trinn 2.5.
    2. Lukk tube stripper på slangen som nær rør blokken som mulig ved å komprimere håndtakene for å presse slangen mellom valsene.
    3. Henge posen vertikalt og holde komprimere stripper håndtakene.
    4. Mens holde stripper lukkes, slipp rør blokken.
    5. Sakte dra stripper ned tom slangen slik at slangen sakte fylle bak stripper. Fortsett til avsnittet nedenfor stripper har fullt oppblåst eller stripper ligger 1 tomme på slutten av slangen.
    6. Når stoppe punktet er nådd med stripper, bruk tube sealer varme forsegle slangen 1 tomme over stripper.
    7. Slipp håndtakene på manuell tube stripper.
    8. Varme forsegle igjen 1 til 2 inches over tidligere segl opprette testing segmentet.
    9. Avskåret testing segmentet fra blodplater enheten. Dette segmentet skal brukes for DLS testing.
  5. Prøvetaking fra rør som ikke er tomt
    1. Henge posen vertikalt og slipp rør blokken i stedet.
    2. Visuelt inspisere slangen for å fastslå om det er noen betydelige solid klumper. Hvis solid klumper eksisterer, sel over dem slik at de ikke kan bli revet i posen.
    3. Lukk tube stripper på slangen som nær forseglet slutten av slangen som mulig.
    4. Fjerne innholdet i slangen i posen ved å komprimere håndtakene for å presse slangen mellom rullene, og samtidig opprettholde lukkekraft, flytte tube stripper langs slangen mot posen.
    5. Fjern Platederivert posen fra hengende kroken og bland forsiktig posen for 5 s av tipper den fra ende til ende fem ganger samtidig stripper lukket.
    6. Henge posen loddrett samtidig stripper lukket.
    7. Sakte dra stripper ned tom slangen, tillate slangen sakte fylle bak stripper. Fortsett til avsnittet nedenfor stripper har fullt oppblåst eller stripper ligger 1 tomme på slutten av slangen.
    8. Når stoppe punktet er nådd med stripper, bruk tube sealer varme forsegle slangen 1 tomme over stripper.
    9. Slipp stripper.
    10. Varme forsegle igjen 1 til 2 inches over tidligere segl opprette testing segmentet.
    11. Kuttet og kast den siste delen av slangen.
    12. Avskåret testing segmentet fra blodplater enheten. Dette segmentet skal brukes for DLS testing.

3. fylle prøven inn DLS testing kapillær

  1. Bruker en splash skjold og ren, tørr saks, kuttet en ende av posen rør eller testing segmentet.
    Merk: Av kapillær brukes for DLS testing skal fylles umiddelbart.
  2. Fyll av kapillær ved hjelp av verktøyet prøvetaking (samlet 100 µL fast volum pipette, pipette tips og kapillær) for å trekke utvalget direkte fra åpnet veske eller rør segmentet i av kapillær.
  3. Forsegle nederst av fylt kapillær ved å forsiktig skyve av fylt kapillær i kapillær tube tetningsmasse mens du bruker en mild vri og litt press mot skuffen.
  4. Koble den 100 µL volum pipette og tips fra kapillær, sikre av kapillær forblir fast forankret i kapillær tube tetningsmasse.
  5. Fjerne av kapillær fra kapillær tube fugemasse brett, tørke med en isopropylalkohol pad og sikre at ingen luftbobler ved å sveipe forsiktig nederst av kapillær.
  6. Plass av kapillær i DLS systemet.

4. utføre DLS test

  1. Velg alternativet MP test å starte en ny DLS-test for å måle microparticle innholdet i en blodplater-utvalg.
  2. Angi utvalg informasjon (donasjon Identification Number (ISBT), samling/produksjon utløpsdato og produktkode) bruke strekkodeleser eller manuelt.
  3. Hvis ingen produktkode tilgjengelig som DLS systemet kan trekke ut flytende medium informasjonen, velger det riktige flytende mediet manuelt (for de fleste Platederivert konsentrater Velg plasma men for prøver som inneholder Platederivert additiv løsning (PAS), kan du angi den prosent av gjenværende plasma).
    Merk: En liten avvik i PAS prosent fra nominell 65% vil føre en liten feil i viskositeten (beregnes automatisk av systemet DLS) som minimalt påvirker den beregnede MP radius men ikke % MP.
  4. Plasser av kapillær i DLS systemet når instruert og starte testen.
  5. Når testen er fullført, fjerner prøven fra kapillær holderen og kast rekvisita riktig i henhold til anlegget retningslinjer. Fjerne prøven fra kapillær holderen og kast rekvisita riktig i henhold til anlegget retningslinjer.
  6. Tag Platederivert posen med fargen tilsvarer resultatet, for eksempel oransje for ingen-aktivert (homogen) % MP lik eller 15% og rosa for aktivert (heterogene) med % MP over 15%.

Figure 1
Figur 1 : Metoden oversikt. Oversikt over trinnene utføres for rutinemessig Platederivert lagerstyring i et sykehus blod bank: få et utvalg fra en blodplater konsentrat, laste utvalget i kapillær for DLS måling, utfører DLS prøve for å identifisere microparticles og bruker den rapporterte microparticle innhold å identifisere aktivert blodplater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Gjennomsnittlig Tilberedningstid
Blodplater sortering ved å bruke en DLS summeres i figur 1. Blodplater er testet med DLS systemet ved mottak fra blod leverandør. Som beskrevet i tabell 1 , den gjennomsnittlige Tilberedningstid for erfarne brukere er 2 min 23 s mens opprydding og post-test ganger 14 s og 46 s, henholdsvis. Totalt gjennomsnittsbrukeren tar 3 minutter og 23 s hands-on tid per test.

Aktivitet Aktiv tid Gange unna testing tid TOTALT
Forberede DLS System 14 s
Montere utvalg verktøy 28 s
Få segmentet 52 s
Fylle kapillære og start testen 49 s
5 min
Opprydding 14 s
Koden og lager Platederivert bag 46 s
Total tid som trengs per prøve 3 min 23 s 5 min 8 min 23 s

Tabell 1: aktiv testing tid sammenbrudd. Testen selv er en spasertur unna test med en gjennomsnittlig varighet på 5 minutter. Den gjennomsnittlige brukeren tar 3 min 23 s forberede DLS systemet for en test, få og teste et utvalg etter denne protokollen og merke Platederivert posen.

Presisjon
Presisjonen for DLS systemet ble vurdert på tre microparticle nivåer, 0-7%, 12-25% og 28-75%. Klinisk relevante området % MP er 3-75%. To operatører testet lav, middels og høy kontroll prøver for 16 drift dager på to DLS systemer parallelt. Prøvene ble testet i duplikat, men i tilfeldig rekkefølge på hver testing dag.

Tabell 2 oppsummerer innen enheten beregningspresisjonen DLS målene for prosent Microparticles (% MP) i forhold til blodplater.

Microparticle innhold
Lav Middels Høy
Mener % MP (%) 4.4 19,5 53.8
Standardavvik (%) 1.8 2.6 5.8
CV (%) 40,4 13.2 10.6

Tabell 2: I enheten presisjon av prosent Microparticles (% MP). På svært lav microparticle innhold liten blodplater kan bidra til % økt MP som resulterer i variasjon for lav microparticle innhold prøver.

Tabell 3 viser innen enheten beregningspresisjonen DLS målene for gjennomsnittlig microparticle radius mellom 50-550 nm.

Microparticle innhold
Lav Middels Høy
Mener Radius (nm) 331 161 188
Standardavvik (mm) 133 41 25
CV (%) 40,1 25.2 13.5

Tabell 3: innen enheten presisjon av microparticle radius. På svært lav microparticle innhold liten blodplater kan bidra til prosent Microparticles (% MP) som resulterer i økt variasjon for lav microparticle innhold prøver.

Tabell 4 viser reproduserbarhet DLS måleenheter for prosent Microparticles (% MP).

Microparticle innhold
Lav Middels Høy
Mener % MP (%) 4.4 29,2 53.6
Reproduserbarhet (%) 1.5 2.3 5
CV (%) 35 11,8 9.4

Tabell 4: Reproduserbarhet av dynamiske lys spredning må mål for prosent Microparticles (% MP).

Linearitet
Figur 2 viser at DLS resultater er lineær, passer dvsen rett linje med hensyn til tilordnede verdier av prøvene. Syv prøver var forberedt med forskjellige microparticle innhold. Prøver med høye (MP7) og lav (MP1) microparticle innhold og matchende Platederivert konsentrasjon ble utarbeidet og blandet på ulike forhold til å opprette midlertidige prøver (MPx). Prøvene ble testet med flowcytometri som beskrevet tidligere19 og DLS og % MP resultater på hver konsentrasjon var plottet som inndata og utdata. Determinantens koeffisient ble funnet for å være 0.985. Eksempler på DLS histogrammer for lav og høy microparticle innhold vises i Figur 3A. DLS resultatene ble bekreftet av flowcytometri (Figur 3B).

Figure 2
Figur 2 : Sammenligning av flowcytometri og DLS resultater. Lineær sammenheng mellom % MP bestemmes av Flow cytometri (inngang) og DLS (utgang), den opprinnelige DLS data fra to prøvene preget av åpne symbolet ○ er vist i Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Microparticle innhold til å skille mellom aktivert og ingen-aktivert blodplater. (A) DLS resultatene av MP innhold i aktivert blodplater (stiplet linje) var 57% sammenlignet med 4% i ingen-aktivert blodplater (heltrukket linje). Testene ble utført ved måling temperatur 37 ° c, plasma viskositet innstillingen 1.06 x10-3 Pa·s og totalt intensitet innstillinger mellom 200-600 kHz. (B) Flow cytometri resultatene (som beskrevet tidligere19) av samme prøvene som vist i (A); fremover scatter histogrammer P1 og P2 representere MP og blodplater portene, henholdsvis; for aktivert blodplater falt (venstre) 76% av hendelsene i MP porten sammenlignet 6% for ikke-aktivert blodplater (høyre). Den lineære regresjonslinjen antyder en konstant relative bidrag bakgrunnsstøy % MP av flowcytometri fører til de gjennomgående høyere resultatene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Spesifisitet/forstyrrelser
Den internasjonale organisasjonen for standardisering (ISO) definerer analytisk spesifisitet som muligheten for en måling prosedyre å oppdage eller måle bare measurand mens det er andre mengder i utvalget. Analytiske spesifisiteten av microparticle screening kan bli påvirket av røde blodlegemer (RBC). DLS måler MP innhold i forhold til blodplater innhold. RBC kan påvirke fordi spredning bidrag av RBC er inkludert i spredning bidrag av blodplater, redusere relative bidrag MP. Regulatoriske begrensninger for tillatte RBC innholdet i blodprodukter eksisterer; en konservativ konvertering av terskelen anbefalt av AABB for tillatte RBC konsentrasjon i blodplater konsentrater-2 mL pakket RBC i én enhet av blodplater-resulterte i 8.0 x1010 celler/L (forutsetninger: RBC er 8,5 x10-14L, hematokrit av pakket RBC er 68%, volum av blodplater enhet er 200 mL). De rapporterte gjenværende RBC konsentrasjonene i ulike produkter er godt under denne terskelen46.

Tre ulike givere donerte blodplater og røde blodlegemer (RBC) på to ulike dager, som kvalifisert, for tre uavhengige eksperimenter. Første RBC innholdet i blodplater konsentratene (referanse utvalget) var 0,05 - 0,15 x109 celler/L som med en hemocytometer. Fem flere eksempler ble opprettet av skyter i kjente mengder RBC i dele Platederivert konsentrat; målet RBC nivåer i disse prøvene var 1.0, 5.0, 10, 40 og 80 x109 celler/L.

Forstyrrelser terskelen av røde blodlegemer var ca 1.0 x1010 celler/L (Figur 4), som også korrelert med nivået som tilstedeværelse av røde blodlegemer var visuelt tydelig (figur 5). Over dette nivået ble % MP undervurdert som betyr at i visuelt rød eksempler-som inneholder RBC stedet hemoglobin-den rapporterte microparticle innhold blir for lavt.

Figure 4
Figur 4 : Lineær sammenheng mellom MP (DLS) og RBC konsentrasjon (celler/L). Økende RBC konsentrasjoner av 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010og 8.0 x1010 celler/L (fra venstre til høyre) fra 3 uavhengige eksperimenter (○ eksperiment 1, ● eksperiment 2, □ eksperiment 3, lineær regresjon linjer vises for hvert eksperiment). Over 1.0 x1010 RBC finans fører til undervurdering av % MP. Utseendet til RBC inneholder eksempler er vist i figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Utseendet til RBC inneholder eksempler. Rødhet av blodplater prøver inneholder RBC konsentrasjoner av 0,1 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010og 8.0 x1010 celler/L fra venstre til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Nøyaktighet
Nøyaktigheten er definert som forskjellen mellom en enkelt måling resultatet og en sann antallverdien tilordnet prøven. Denne målingen feilen inneholder en systematisk komponent anslått av målingen partiskhet og en tilfeldig komponent anslått av standardavvik. Dermed er nøyaktigheten av en måling resultatet en kombinasjon av trueness og presisjon.

En perle standard ble brukt til å fastslå nøyaktigheten av DLS testen. Nøyaktigheten ble evaluert i to konsentrasjoner innen klinisk relevante analysen av 3-75% MP. Referanse perle blandinger ble brukt til å forberede prøver av kjente konsentrasjoner fordi referanse perler har en kjent størrelse og konsentrasjon. Følgelig kan referanse perler blandes for å få prøver med ønsket partikkelstørrelser og konsentrasjoner.

Standard polystyren perler med en 125 nm radius ble brukt til å representere microparticles og perler med 1,5 µm radius ble brukt til å representere blodplater. Nøyaktigheten av microparticle analysen ble vurdert med perle blandinger av ca 20% og 50% MP innhold. Nøyaktigheten av de målte particle radier ble sammenlignet particle radier dokumentert på sertifikater for analyse for referanse perler som vist i tabell 5.

125 nm perler 1,5 µm perler
Analysesertifikat Analysesertifikat
20% MP 50% MP 20% MP 50% MP
Mener Radius 122.0 113,8 124.4 1.5 1.6 1.60
STDAVVIK 4.5 2.83 3.6 0.035 0,06 0.07
CV 3,60% 2.48% 2.89% 2,20% 3,74% 4.05%
Nøyaktighet 6.70% 2.00% 6.50% 6,30%

Tabell 5: nøyaktighet av dynamiske lys spredning må målinger. Størrelse sammenligning for DLS fører mot analysesertifikat for perler med 125 nm radius og 1,5 µm radius blandinger.

Discussion

Denne protokollen beskriver en dynamisk lysspredning metode for microparticle screening optimalisert for de høye partikkel konsentrasjonene i biologiske prøver som Platederivert konsentrerer. Metoden DLS er iboende standardisert for å måle størrelsen. Relativ konsentrasjonen av microparticles kan konverteres til en absolutt konsentrasjon hvis blodplater konsentrasjonen er kjent og blodplater peak området brukes som referanse peak19. Som Platederivert konsentrasjoner oppnås vanligvis med hematologi analyserer eller flyt cytometers disse metodene kan betraktes følgesvenn teknologier DLS.

Funksjonaliteten til DLS systemet er forsikret av kjører kontrollen perler regelmessig. Destillert vann kan måles for å kontrollere at bakgrunnsstøy er minimal. Kommersielt tilgjengelige Platederivert standarder kan analyseres som MP-negativ kontroller og tillegg av 125 nm radius perler, MP-positive kontroller. Innenfor de biologiske utvalg av MP konsentrasjonene av interesse er prosedyrene praktiske og raske til å utføre som en del av blod bank rutinen.

I motsetning til flowcytometri, er denne metoden ikke basert på sammenligning spredning intensiteten av partikler, men heller hastigheten på deres Brownsk bevegelse. Dermed exosomes kan også påvises tross sin lille størrelse og rapporterer separat MP.

Utformet som en screening verktøyet, er begrensninger av denne metoden knyttet til sin manglende evne til å skille mellom ulike typer microparticles. Det er potensielle rom for forbedring hvis ytterligere isolasjon fremgangsmåte brukes; prøver kan bli testet før og etter bestemte fjerning av microparticles gjennom antistoff kombinert magnetiske perle fange. I tillegg kan det antas at alle oppdaget microparticles er cellen avledet fordi chylomicrons dannet i hyperlipidemi47,48 og små bakterier eller virus6 også rapporteres i microparticle området. Imidlertid finnes andre sikkerhetstiltak i blodtilførselen til unngå svært lipemic eller forurensede blodplater inn sykehus blod bank lageret.

Valg av antikoagulerende i utvalget påvirker omfanget av blodplater aktivisering og derfor MP innhold49. Denne faktoren må vurderes for sammenligninger av ulike produkter. Videre utveksling av plasma med MP gratis suspensjon medier som PAS påvirker MP innholdet og terskelen for å bestemme heterogenitet-hvis bare omtrent en tredjedel av den opprinnelige MP innholdet er igjen i den gjenværende plasma i konsentrat en tilsvarende angir lavere MP innholdet terskelverdi samme nivå av blodplater aktivisering som 100% plasma. Prosent MP er MP innholdet i forhold til blodplater. Tidligere ble det rapportert at gjennomsnittlig Platederivert antall PAS produktet var lavere slik at den gjennomsnittlige % MP var fortsatt 9.5%19. % MP terskelen for PAS blodplater lisensiert i USA er satt til 10%.

Hovedkilden til MP i blodplater konsentrater er donor, prosesser som forårsaker stress til blodplater vil øke MP nivået avhengig av mottakelighet av blodplater stress-hvis blodplater er allerede svært aktivert, mindre stressfaktorer som utvidet holdbarhet, patogen inaktivering, vaskemaskin, kan bestråling eller langdistanse transport føre til betydelig økning i MP innhold. Ingen av disse stressorer har blitt vist å påvirke homogen, ingen-aktivert blodplater19. I tillegg bør oppmerksomhet være betalt til potensialet for endringer i utvalg komposisjon i av kapillær hvis ikke testet umiddelbart etter forberedelse (fullført trinn 3 i denne protokollen).

Fokus for denne protokollen er på å bestemme sammensetningen av partikler tilstede i blodplater blodoverføringer og bruke microparticles som biomarkers Platederivert aktivisering. Blodplater blodoverføringer er merket som enten ingen-aktivert (oransje) eller aktivert (rosa) basert på en microparticle prosentsats på 15%. Terskelen på 15% MP for blodplater i 100% plasma identifiserte empirisk som gjennomsnitt 66th persentil fra flere steder.

Målet med Platederivert Lagerstyring basert på rutinemessige microparticle screening med Distribusjonslister er å forbedre pasienten omsorg og kjøre kostnadseffektiviteten ved å hindre ikke-immune Platederivert ildfasthet. Gjennomføringen av DLS systemet for screening av blodplater poser vil at brukeren skal kunne direkte ingen-aktivert blodplater til pasientgrupper mest utsatt for å utvikle Platederivert ildfasthet.

Disclosures

EMS er grunnleggeren av LightIntegra Technology Inc., et medisinsk utstyr selskap å utvikle ThromboLUX systemet for microparticle og blodplater kvalitet testing. Alle andre forfattere er ansatte i LightIntegra teknologi. Produksjon og gratis tilgang til denne artikkelen er sponset av LightIntegra Technology Inc.

Acknowledgments

Vi takker blodgivere og personell på Canadian blod tjenester nettverk Centre for brukt utvikling for samling og produksjon av blodplater enhetene som brukes i denne studien. Vi erkjenner Canada grunnlaget for innovasjon og Michael Smith Foundation for Health Research for infrastruktur finansiering midt UBC for Blood forskning. Finansiering for publikasjonen ble levert av LightIntegra Technology Inc., produsenten av ThromboLUX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ThromboLUX-M LightIntegra Technology Inc.  LPN120 DLS System
ThromboSight Software LightIntegra Technology Inc.  LPN124 DLS analysis software
Capillaries LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) LPN065 Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) LPN082 100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) LPN080 Pipette tips for sampling
Critoseal  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) LPN075 Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) LPN085 Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) LPN128 Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm PolySciences Inc. 64060 Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm PolySciences Inc. 64014-15 Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent Genesis BPS 428-SE640 Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent Fresenius Kabi 6R4452 Manual tube stripper
Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent CardinalHealth S1389-75 Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent Corning Incorporated 6775 Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent BD Biosciences 338960 Flow cytometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
  2. Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
  3. Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
  4. Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
  5. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
  6. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  7. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
  8. Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
  9. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  10. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  11. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 36-45 (2013).
  15. Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
  16. Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812 (2015).
  17. Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
  18. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  19. Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
  20. Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
  21. Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
  22. Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
  23. Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
  24. Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
  25. Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
  26. Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
  27. Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
  28. Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
  29. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  30. Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
  31. Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
  32. Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
  33. Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
  34. Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
  35. Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293 (2016).
  36. Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
  37. Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
  38. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
  39. Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, Suppl 1 54-61 (2014).
  40. Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
  41. Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
  42. Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
  43. Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
  44. Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67 (2011).
  45. Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
  46. Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
  47. Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
  48. Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779 (2017).
  49. Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).

Tags

Medisin problemet 131 Microparticles ekstracellulære blemmer microvesicles exosomes blodplater transfusjon ildfasthet screening blodplater konsentrater.
Rutine Screening metode for Microparticles i blodplater blodoverføringer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Millar, D., Murphy, L., Labrie, A.,… More

Millar, D., Murphy, L., Labrie, A., Maurer-Spurej, E. Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions. J. Vis. Exp. (131), e56893, doi:10.3791/56893 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter