我们提出了一个协议来研究 X 射线辐照 Caco-2 和外周血单个核细胞 (PBMC) 之间的串扰。该协议始于 Caco-2 辐照和与 PBMC 共文化的建立;随后, 反式上皮电阻是定期测量超过48小时和西方印迹执行在 Caco-2 和 PBMC。
这项工作所采用的议定书旨在解开 X 射线如何扰乱肠屏障的功能, 重点是大肠肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用。大肠癌是最常见的癌症之一, 通常通过手术、化疗和放疗来治疗。放疗在肿瘤靶向中的优势是众所周知的。然而, 即使是有限的健康组织暴露是非常令人关注的, 特别是关于肠道屏障和免疫系统的影响。所采用的设置允许研究两个细胞之间的相互作用在一个更类似于生理的条件, 当与正常细胞培养。为此, 我们采用了不同的技术, 我们使用了一个体外共培养模型, 基于 Caco-2 细胞分化为单层和 PBMC, 共享相同的培养基。本议定书的发展重点是宏观效应,即细胞活力和跨上皮电阻 (TEER), 并通过西方印迹, 分子改变,即炎症通路的活化免疫细胞和 Caco-2 细胞的紧密连接蛋白表达。通过 3-(45-dimethylthiazol-2-基)-25-diphenyltetrazolium 溴化铵 (MTT) 和台盼蓝测定对 Caco-2 细胞活力的辐射效应进行了初步评估, 而 TEER 是通过欧姆计在固定时间间隔测量的。专门为合作文化系统设计的。这样, 辐射的影响, 外周血单个核细胞 (PBMC) 的存在, 并最终它们的协同作用, 可以证明。通过这些互补的技术, 我们观察到 Caco-2 在 2-10 X 射线的范围内的高射电电阻和增加的 Caco-2 单层通透性, 当 PBMCs 增加。特别是, PBMC 存在被发现与变化紧密连接支架蛋白表达。
这项工作所采用的方法是为了研究大肠癌细胞与免疫系统之间的相互作用, 在与正常的2维细胞培养相比, 利用一个更接近生理状态的装置。
大肠癌 (CRC) 被认为是第三种最常见的癌症, 全世界有超过100万的病例 (全球癌症观察站, 国际癌症研究机构, 世界卫生组织, http://gco.iarc.fr)。CRC 的管理通常通过手术、化疗或放疗进行,1。与手术或化疗等侵入性技术相比, 放疗在很大程度上避免了从这些临床方法中产生的典型的有害系统反应, 这得益于局部放射剂量的传递。然而, 副作用可能出现在周围的健康组织, 触发炎症与直接损害健康细胞和损害介导的非靶向效应2,3,4。针对大肠癌放疗中的不良反应, 需要研究两个方面。首先, 负责肠道抗渗性的机制可以通过辐射传递来改变, 反过来, 由于细菌数量的改变和分子和溶质的细胞通道的影响, 导致了副作用的可能性。其次, 肠道相关淋巴组织的存在, 作为免疫系统的前哨, 具有控制细菌生长的功能, 并调解一般免疫应答5,6,7。为了实现这些功能, 肠道的抗渗性是由于细胞膜间连接配合物的作用而保持的。由于这些原因, 在 Caco-2 细胞单独和与 PBMC 的 co 培养中, 对不同剂量的 X 射线所引起的有害后果进行了研究。
尽管对细胞培养进行研究是生物医学研究的第一 setline, 但缺乏对细胞生物学和不同细胞类型相互作用的机制的详细了解, 可能成为关键研究在实验室中不易重现的器官、系统和器械的生理学。因此, 我们决定采用一种联合培养的方式, 允许两个细胞共同研究, 并解剖有关的方面与细胞和细胞外的机制。
共培养是研究上皮功能和不同细胞类型间相互作用的一种技术。特别是, 在我们的情况下, 这种技术的使用成为强制性的, 因为上皮细胞是由具有极性特征的单元组成的。在肠道屏障的情况下, 细胞显示一个明确的极化, 顶端和侧极点通常分离, 由于存在紧密连接-创造黏附分子。这种条块分割是需要的组织生理学, 避免细胞贩运和允许通过的坚定分子只。这一功能当然是不可能的重建与正常细胞培养设置。此外, 联合培养的采用, 在侧表面只复制免疫细胞的存在, 而顶端表面 (对应于肠腔) 不直接与其他细胞接触。
近年来, Caco-2 细胞株作为一种肠道屏障的体外模型变得越来越重要。虽然从人类结肠腺癌中获得, Caco-2 细胞保持分化能力, 并创建一个功能极化单层8, 这使得研究的细胞膜特性时, 成长在一个共同文化插入。
由于 Caco-2 在多孔膜上的培养是一种成熟的肠单层结构的体外模型, 改善了 Caco-2 与其他细胞的共培养。这种设置已经被频繁地用来测量不同单元类型之间的串扰9 , 可以用来解开 Caco-2 扰动反应的外来刺激时, 在共同文化, 就 Caco-2 单独培养。
许多研究都解决了 Caco-2 行为时, 与非病原菌和外周血单个核细胞共同培养, 以阐明特别是与免疫系统10的串扰。Pozo-卢比奥et al.11研究了双歧杆菌刺激 Caco-2 细胞 Caco-2/PBMC 共培养中几种细胞因子的表达。他们的工作强调了对细胞因子表达谱的实质性修改, 这取决于在 PBMC 的存在/缺席下进行的细菌刺激。结果表明, PBMC 使 Caco-2 对双歧杆菌存在。
不同的研究组对 Caco-2 细胞对非致病和致病细菌的不同反应进行了评价。Parlesak et al。12显示了 Caco-2 细胞对大肠杆菌刺激 PBMC 的免疫抑制作用。此外, Haller et al。13研究了致病大肠杆菌或非致病细菌的 Caco-2 细胞 (LPS) 对 i.e.E. 大肠杆菌、乳酸杆菌的反应, 加强推测 Caco-2 细胞的反应严格依赖于在共同培养中的白细胞的存在。
通过执行不同的辅助实验室化验 (例如西方印迹, 反式上皮电阻, MTT,等), 除了分析在共同培养的不同细胞类型, 整个方法论承诺结果, 可以被认为是真正发生在体内的更具代表性。此外, 这一设置允许分离不同的共培养舱室, 不仅允许研究所涉及的细胞类型, 而且还可以在上vs.下部舱内或在存在中释放的胞间信号分子, vs.缺少合作文化。
在发达国家, 大肠癌是发病率和死亡率最常见的原因之一。它通常由外科手术, 化疗和放疗1。在放疗治疗的框架内, 必须特别注意健康组织暴露的影响4;此外, 系统地研究辐射暴露与免疫系统的关系, 是发展无线电免疫治疗方法的基础3。
我们在这项工作中采用的方法是针对 Caco-2 细胞和 PBMC 串扰的研究而量身定做的。我们关注的是 X 射线照射肿瘤细胞的效果, 但同样的协议可以适应与药理学的研究。与标准细胞培养更接近的生理条件, 这种方法的优势是有可能全面解剖复杂的系统, 考虑到分析两种不同的细胞类型和释放信号分子到联合文化的二个隔间里本身。通过这种方法, 常规应用生物方法有助于了解细胞相互作用的相关机制。
X 射线诱导的 Caco-2 细胞的初步表征是基于两个互补的测量,即MTT 比色法和台盼蓝染料排斥试验。这些明显不一致的结果可以用这两种分析的不同焦点来解释。MTT 法评价氧化酶活性, 而台盼蓝染料是基于活细胞排斥染料的机制。
对 Caco-2-PBMC 相互作用的研究需要建立一个上皮单层能够导致在两个共文化的隔间完全分离。在共培养的插入 Caco-2 细胞的可能性允许仅辐射这个细胞人口。由于共培养开始后, 辐射, 没有任何偏见, 由于任何意外暴露的 PBMC。这一设置需要小心处理, 以避免损坏 (或污染) 的蜂窝单层在移动的插入从一个6井板到另一个。当仔细地执行时, TEER 测量是一个简单和非侵入的方法研究单层渗透性。这种测定方法与共培养方法密切相关, 它不是单层渗透性研究的唯一选择。它可以很好地重现的措施, 一旦它是良好的校准与新鲜完整的介质。常见的化验重点是化学染料从上部的“顶端”隔间扩散到底部 “侧”一 (荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-葡聚糖检测)16。然而, 由于 PBMC 在本研究的侧室, 我们决定避免在实验中引入化学试剂。
在这项工作中采用的不同技术中, TEER 测量是唯一需要共用区域性设置17,18的方法。然而, 其他常见的实验室技术提供了更多的信息的结果时, 应用于细胞的共同培养, 因为他们允许调查的设置更接近生理条件和数据具有更强的生物学意义。另一方面, 必须指出的是, 在多孔支架上生长的细胞的使用可能会在准备样品所需的操作中遇到一些困难, 如细胞裂解制备细胞提取物, 以便通过印迹来分析。
本研究采用的系统具有进一步改进的潜力,例如应用能够重现细胞外基质环境的物质。然而, 这也将导致系统的复杂性增加, 而对设置的完整剖析将更难实现。
细胞共培养的设置, 当然代表了一个强大的工具, 促进体外的研究, 以及对复杂系统的理解。这项技术有可能增加基本机制的知识, 为分子信号的基础研究提供新的投入, 并且可能的应用在免疫系统的活动的调节在框架肿瘤临床病人管理。
The authors have nothing to disclose.
意大利核物理研究所 (INFN) 通过 INFN-子午线项目部分资助了这项工作。作者承认 Prof. 伯父 Milotti (意大利的里雅斯特大学物理系) 为 INFN-子午线项目协调;Dr. 罗伯特 Chignola (生物技术系, 意大利维罗纳大学) 提供 Caco-2 细胞, 欧姆计, 并为他的宝贵的帮助和培训。我们还感谢 Agnese 索拉里的技术援助。
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
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