हम एक्स-रे-विकिरणित कएको-2 और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMC) के बीच crosstalk की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । प्रोटोकॉल कएको-2 विकिरण और PBMC के साथ सह-संस्कृति के सेट अप के साथ शुरू होता है; इसके बाद, ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध नियमित रूप से मापा जाता है पर ४८ एच और पश्चिमी दोनों कएको में प्रदर्शन दाग-2 और PBMC.
इस काम में अपनाया प्रोटोकॉल को सुलझाना करना है कैसे एक्स-रे आंत्र बाधा के कामकाज perturb, कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक साथ खेलना पर ध्यान केंद्रित । कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कैंसर का सबसे आम प्रकार के बीच है, आमतौर पर सर्जरी, कीमोथेरेपी, और रेडियोथेरेपी द्वारा इलाज किया । रेडियोथेरेपी के ट्यूमर को लक्षित करने में लाभ अच्छी तरह से जाना जाता है । हालांकि, स्वस्थ ऊतकों की भी सीमित जोखिम बड़ी चिंता का विषय है, विशेष रूप से आंत्र बाधा और प्रतिरक्षा प्रणाली पर प्रभाव के बारे में । गोद लिया सेटअप के लिए एक और अधिक शारीरिक एक, जब सामांय कोशिका संस्कृतियों की तुलना में समान हालत में दो कोशिका आबादी के बीच एक नाटक का अध्ययन करने की अनुमति देता है । इस प्रयोजन के लिए, हम विभिंन तकनीकों का सहारा है और हम एक इन विट्रो सह संस्कृति मॉडल, कएको-2 एक monolayer और PBMC के रूप में अंतर कोशिकाओं पर आधारित है, एक ही संस्कृति माध्यम बांटने का इस्तेमाल किया । इस प्रोटोकॉल दोनों macroscopic प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करने के लिए विकसित किया गया है, यानी सेल व्यवहार्यता और ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध (तीळ), और, पश्चिमी दाग के माध्यम से, आणविक परिवर्तन, यानी भड़काऊ रास्ते के सक्रियकरण प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कएको-2 कोशिकाओं में तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति. कएको-2 सेल व्यवहार्यता पर विकिरण प्रभाव का प्रारंभिक मूल्यांकन 3 के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) और Trypan ब्लू परख, जबकि तीळ एक ohmmeter के माध्यम से तय समय अंतराल पर मापा गया था विशेष रूप से सह संस्कृति प्रणालियों के लिए बनाया गया है । इस तरह, विकिरण के कारण प्रभाव, परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं की उपस्थिति (PBMC), और अंततः उनके synergistic प्रभाव, प्रदर्शन किया जा सकता है । इन पूरक तकनीक के माध्यम से, हम कएको के एक उच्च रेडियो प्रतिरोध-2 की 2-10 Gy की सीमा के भीतर मनाया एक्स-रे और एक वृद्धि हुई कएको-2 monolayer पारगम्यता जब PBMCs जोड़ा गया. विशेष रूप से, PBMC उपस्थिति के लिए तंग जंक्शन पाड़ प्रोटीन अभिव्यक्ति में भिंनता के साथ जुड़ा हुआ पाया गया ।
इस कार्य में अपनाया पद्धति कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक साथ खेलने की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक सेट अप का दोहन शारीरिक हालत के करीब जब सामांय 2-आयामी सेल संस्कृतियों की तुलना में ।
कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी) कैंसर का तीसरा सबसे लगातार प्रकार माना जाता है, अधिक से अधिक १,०००,००० के मामलों के साथ दुनिया भर में (वैश्विक कैंसर वेधशाला, अंतर्राष्ट्रीय कैंसर पर अनुसंधान के लिए एजेंसी, विश्व स्वास्थ्य संगठन, http://gco.iarc.fr) । सीआरसी के प्रबंधन नियमित रूप से या तो सर्जरी, कीमोथेरेपी या रेडियोथेरेपी1के माध्यम से किया जाता है । जब सर्जरी या कीमोथेरेपी की तरह इनवेसिव तकनीक की तुलना में, रेडियोथेरेपी काफी हद तक विशिष्ट हानिकारक प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं इन नैदानिक दृष्टिकोण से प्राप्त करने से परहेज, विकिरण खुराक के स्थानीयकृत वितरण के लिए धंयवाद । हालांकि, दुष्प्रभाव आसपास के स्वस्थ ऊतकों में पैदा कर सकते हैं, स्वस्थ कोशिकाओं को प्रत्यक्ष क्षति के साथ सूजन को ट्रिगर और गैर द्वारा मध्यस्थता क्षति-लक्षित प्रभाव2,3,4. कोलोरेक्टल कैंसर के इलाज के दौरान विकिरण के कारण प्रतिकूल प्रभाव पर ध्यान केंद्रित, दो पहलुओं की जांच करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, आंत्र पारगम्यता के जिंमेदार तंत्र विकिरण प्रसव के कारण, बदले में, बैक्टीरियल आबादी की एक बदल रोकथाम और अणुओं और solutes के paracellular पारित होने के कारण दुष्प्रभाव की संभावना को बदल दिया जा सकता है । दूसरा, आंत की उपस्थिति-जुड़े लसीका ऊतक (GALT) प्रतिरक्षा प्रणाली की एक चौकी के रूप में कार्य करता है, बैक्टीरियल विकास को नियंत्रित करने और सामांय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5मध्यस्थता के कार्य के साथ,6,7। इन कार्यों को पूरा करने के लिए, आंत्र पारगम्यता कोशिकाओं ‘ झिल्ली के बीच जंक्शन परिसरों के समारोह के कारण रखा जाता है । इन कारणों के लिए, एक्स-रे की अलग खुराक के कारण प्रेरित हानिकारक परिणाम कएको-2 कोशिकाओं में अकेले और PBMC के साथ सह संस्कृतियों में जांच की गई ।
हालांकि सेल संस्कृतियों पर अध्ययन का आयोजन जैव चिकित्सा अनुसंधान में जांच का पहला setline है, कोशिका जीवविज्ञान ड्राइविंग तंत्र और विभिंन प्रकार के सेल के बीच पारस्परिक संबंधों की विस्तृत जानकारी की कमी महत्वपूर्ण हो सकता है जब अंगों, प्रणालियों, और उपकरण है कि आसानी से प्रयोगशाला में निर्मित नहीं किया जा सकता है फिजियोलॉजी के अध्ययन आ । इसलिए, हम एक सह संस्कृति को अपनाने का फैसला किया, दोनों दो सेल आबादी के अध्ययन एक साथ और सेलुलर और extracellular तंत्र से संबंधित पहलुओं के विच्छेदन की अनुमति ।
सह संस्कृति एक तकनीक का दोहन जब उपकला कार्यों का अध्ययन और विभिंन प्रकार के सेल के बीच में खेलना है । विशेष रूप से, इस तरह के एक तकनीक का उपयोग हमारे मामले में अनिवार्य हो जाता है, क्योंकि epithelia ध्रुवीयता की विशेषता कोशिकाओं से बना रहे हैं । आंत्र बाधा के मामले में, एन्तेरोच्य्तेस एक अच्छी तरह से परिभाषित ध्रुवीकरण, शिखर और basolateral डंडे के साथ आम तौर पर तंग जंक्शन की उपस्थिति-आसंजन बनाने के अणुओं की वजह से अलग दिखा । इस compartmentalization ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक है, paracellular तस्करी से परहेज और निर्धारित अणुओं के पारित होने की अनुमति ही । यह सुविधा निश्चित रूप से एक सामांय सेल संवर्धन सेट अप के साथ बहलाना असंभव है । इसके अलावा, सह संस्कृति की गोद में स्थापित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति केवल basolateral सतह में reproduces, जबकि शिखर सतह (आंतों लुमेन के लिए इसी) सीधे अन्य कोशिकाओं के साथ संपर्क में नहीं है.
हाल ही में, कएको-2 सेल लाइनों आंतों बैरियर के एक इन विट्रो मॉडल के रूप में अधिक महत्व प्राप्त की । हालांकि मानव बृहदांत्र ग्रंथिकर्कटता से व्युत्पंन, कएको-2 कोशिकाओं के अंतर की क्षमता बनाए रखने और एक कार्यात्मक ध्रुवीकरण monolayer8है, जो कोशिका झिल्ली जब एक सह संस्कृति डालने में उगाया संपत्तियों की जांच की अनुमति देता है बनाएं ।
एक छिद्रित झिल्ली पर कएको-2 संवर्धन के बाद से एक अच्छी तरह से स्थापित है आंत्र monolayer के इन विट्रो मॉडल, एक सुधार सह है कएको-2 और अंय कोशिकाओं के बीच संस्कृति । इस सेट अप अक्सर अलग सेल प्रकार9 के बीच crosstalk को मापने के लिए अपनाया गया है और जब सह संस्कृति में exogenous उत्तेजनाओं को कएको-2 परेशान प्रतिक्रिया जानने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कएको के संबंध में-2 अकेले संस्कृति ।
कई अध्ययनों से संबोधित किया है कएको-2 व्यवहार जब सह दोनों गैर के साथ संस्कृति रोगजनक बैक्टीरिया और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं, विशेष रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ crosstalk में स्पष्ट करने के लिए10. Pozo-रूबियो एट अल. 11 bifidobacteria उत्तेजक कएको-2 कोशिकाओं के साथ एक कएको-2/PBMC सह संस्कृति में कई साइटोकिंस की अभिव्यक्ति का अध्ययन किया । उनके काम cytokine अभिव्यक्ति की उपस्थिति में प्रदर्शन बैक्टीरियल उत्तेजना के आधार पर प्रोफाइल को पर्याप्त संशोधन पर प्रकाश डाला/PBMC के अभाव । उनके परिणाम इस निष्कर्ष पर ले जाते हैं कि PBMC की उपस्थिति कएको-२ को bifidobacteria.
गैर रोगजनक और रोगजनक बैक्टीरिया के लिए कएको-2 कोशिकाओं के विभिंन प्रतिक्रियाओं के विभिंन अनुसंधान टीमों द्वारा मूल्यांकन किया गया है । Parlesak एट अल. 12 ई कोलाई-उत्तेजित PBMC पर कएको-2 कोशिकाओं के गुर्दे प्रभाव का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, हॉलर एट अल। 13 कएको-2 कोशिकाओं के उत्तर का अध्ययन किया enteropathogenic ई. कोलाई एसपीपी. या गैर enteropathogenic बैक्टीरिया से दोनों lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ उत्तेजित i.e.E. कोलाई एसपीपी., लैक्टोबैसिलस एसपीपी., को मजबूत बनाने अनुमान है कि कएको-2 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कड़ाई से सह संस्कृति सेट अप में ल्यूकोसाइट्स की उपस्थिति पर निर्भर करता है ।
विभिन्न पूरक प्रयोगशाला परख प्रदर्शन करके (उदा पश्चिमी दाग, ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध, MTT, आदि), सह-संस्कृति में उगाई विभिन्न कोशिका प्रकारों के विश्लेषण के अलावा, पूरी कार्यप्रणाली का वादा किया परिणाम है कि क्या वास्तव में vivo मेंहोता है की अधिक प्रतिनिधि माना जा सकता है । इसके अलावा, इस सेट अप विभिंन सह संस्कृति डिब्बों की जुदाई सक्षम बनाता है, न केवल सेल शामिल प्रकार के अध्ययन की अनुमति है लेकिन यह भी सेलुलर संकेतन ऊपरी बनाम निचले डिब्बे या उपस्थिति में जारी अणुओं बनाम सह संस्कृति की अनुपस्थिति ।
कोलोरेक्टल कैंसर, विकसित देशों में अपने उच्च घटना के साथ, आबादी में रुग्णता और मृत्यु के सबसे लगातार कारणों में से एक है । यह आमतौर पर सर्जरी, कीमोथेरेपी द्वारा प्रबंधित किया जाता है, और रेडियोथेरेपी1। रेडियोथेरेपी उपचार के ढांचे में, विशेष रूप से ध्यान स्वस्थ ऊतक जोखिम के प्रभाव के लिए दिया जाना चाहिए4; इसके अलावा, विकिरण जोखिम और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संबंधों पर व्यवस्थित अध्ययन रेडियो के दृष्टिकोण विकसित करने के लिए मौलिक हैं-immunotherapy3।
इस कार्य में हमने जो पद्धति अपनायी है, कएको-2 के कक्षों और PBMC crosstalk की जांच के अनुरूप बनाई गई है । हम एक्स के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित, ट्यूमर कोशिकाओं के रे जोखिम, लेकिन एक ही प्रोटोकॉल औषधीय एजेंटों के साथ अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । मानक सेल संवर्धन के संबंध में शारीरिक स्थितियों के करीब होने के नाते, इस विधि का मजबूत लाभ एक जटिल प्रणाली की एक पूरी विच्छेदन की संभावना है, दोनों अलग प्रकार के सेल का विश्लेषण करने की संभावना दी और की रिहाई सह के दो डिब्बों में अणु संकेत-संस्कृति ही । इस तरह, नियमित रूप से लागू जैविक तरीकों सेलुलर खेल से संबंधित तंत्र की समझ में मदद कर सकते हैं ।
कएको-2 कोशिकाओं पर एक्स-रे-प्रेरित प्रभाव के प्रारंभिक लक्षण वर्णन दो पूरक माप पर आधारित था, यानी MTT वर्णमिति परख और Trypan ब्लू डाई अपवर्जन परीक्षण. जाहिरा तौर पर असंगत परिणाम इन दो परख के अलग ध्यान से समझाया जा सकता है । MTT oxidoreductase एंजाइमों गतिविधि का आकलन है, जबकि Trypan नीले रंग एक जीवित कोशिका अपवर्जन डाई तंत्र पर आधारित है ।
कएको-2-PBMC की जांच के लिए एक उपकला monolayer के निर्माण के लिए सह संस्कृति के दो डिब्बों के बीच एक पूरी जुदाई का नेतृत्व करने में सक्षम की आवश्यकता है । सह-संस्कृति में कएको-2 कोशिकाओं बोने की संभावना केवल इस सेल जनसंख्या के विकिरण की अनुमति देता है । के बाद से सह संस्कृति विकिरण के बाद शुरू होता है, वहां कोई PBMC के किसी भी आकस्मिक जोखिम के कारण पूर्वाग्रह है । इस सेट को ध्यान से एक 6 से डालने के आंदोलनों के दौरान सेलुलर monolayer को नुकसान (या संदूषण) से बचने के लिए संभाला जाना चाहिए दूसरे के लिए अच्छी तरह से थाली । जब ध्यान से प्रदर्शन किया, तीळ माप एक सरल और गैर इनवेसिव विधि monolayer पारगम्यता की जांच करने के लिए कर रहे हैं । यह परख कड़ाई से सह संस्कृति सेट अप करने के लिए संबंधित है, और यह monolayer पारगम्यता की जांच के लिए एकमात्र विकल्प नहीं है । यह एक अच्छा reproducibility उपायों की अनुमति देता है एक बार यह अच्छी तरह से ताजा पूरा माध्यम से तुले है । आम परख ऊपरी “शिखर” डिब्बे से नीचे “basolateral” एक (जैसे fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran परख)16से रासायनिक रंगों के प्रसार पर ध्यान केंद्रित । हालांकि, चूंकि PBMC इस अध्ययन में basolateral डिब्बे में मौजूद हैं, इसलिए हमने प्रयोगों में केमिकल रिएजेंट की शुरूआत से बचने का फैसला किया ।
इस कार्य में अपनाए गए विभिन्न तकनीकों में, तीळ माप केवल एक ही है कि सह-संस्कृति सेट अप17,18की आवश्यकता है । हालांकि, अंय सामांय प्रयोगशाला तकनीक और अधिक जानकारीपूर्ण जब सह संस्कृति में कोशिकाओं को लागू परिणाम प्रदान करते हैं, के रूप में वे एक सेटअप की जांच की अनुमति के करीब शारीरिक स्थितियों और डेटा एक मजबूत जैविक महत्व है । दूसरी ओर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक असुरक्षित समर्थन पर हो कोशिकाओं के उपयोग के लिए नमूनों को तैयार करने के लिए आवश्यक कार्रवाई में कुछ कठिनाइयों का कारण बन सकता है, जैसे सेलुलर अर्क की तैयारी के लिए सेल lysis पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से विश्लेषण किया जाना है ।
इस अध्ययन में अपनाया प्रणाली को और अधिक सुधार करने की क्षमता है, extracellular मैट्रिक्स वातावरण विश्राम करने में सक्षम पदार्थों के आवेदन के साथ उदा . हालांकि, यह भी सिस्टम की एक बढ़ी हुई जटिलता में परिणाम होगा, और सेट अप की एक पूरी विच्छेदन प्राप्त किया जा करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा ।
सेल सह संस्कृति के लिए setups निश्चित रूप से इन विट्रो अनुसंधान में की उंनति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, और जटिल प्रणालियों की समझ के लिए । इस तकनीक की क्षमता मौलिक तंत्र पर ज्ञान बढ़ाने के लिए, आणविक संकेतन पर बुनियादी अनुसंधान अध्ययन करने के लिए नए आदानों प्रदान करने, और के ढांचे में प्रतिरक्षा प्रणाली की गतिविधि का मॉडुलन करने के लिए संभव अनुप्रयोगों के साथ है आंकलोजिकल नैदानिक रोगी प्रबंधन ।
The authors have nothing to disclose.
इतालवी परमाणु भौतिकी संस्थान (INFN) आंशिक रूप से INFN-मध्याह्न परियोजना के माध्यम से इस काम को वित्त पोषित । लेखक INFN-मध्याह्न परियोजना समंवय के लिए प्रो Edoardo Milotti (भौतिकी विभाग, ट्राइस्टे, इटली के विश्वविद्यालय) स्वीकार करते हैं; Dr. रॉबर्टो Chignola (जैव प्रौद्योगिकी विभाग, वेरोना विश्वविद्यालय, इटली) कएको-2 कोशिकाओं, ohmmeter प्रदान करने के लिए, और उसके मूल्यवान मदद और प्रशिक्षण के लिए । हम भी तकनीकी सहायता के लिए एग्नेस Solari स्वीकार करते हैं ।
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |