Vi præsenterer en protokol for at undersøge krydstale mellem X-stråle-bestrålet Caco-2 og perifert blod mononukleære celler (PBMC). Protokollen starter med Caco-2 bestråling og opsætning af fælles kultur med PBMC; efterfølgende måles trans-epitelial elektriske modstand jævnligt over 48 h og vestlige skamplet udført i både Caco-2 og PBMC.
Protokollen vedtaget i dette arbejde sigter optrevling hvordan røntgenstråler forurolige funktion af den intestinale barriere, med fokus på samspillet mellem kolorektal tumorceller og immunsystemet. Colorectal karcinom er blandt de mest almindelige form for kræft, typisk behandles med kirurgi, kemoterapi og strålebehandling. Fordele ved strålebehandling i rettet mod svulsten er velkendt. Dog er endnu begrænset eksponeringer af sunde væv til stor bekymring, navnlig med hensyn til virkningerne på den intestinale barriere og immunsystemet. Den vedtagne konfiguration giver mulighed for at studere samspillet mellem to cellepopulationer i en betingelse mere ligner den fysiologiske, sammenlignet med normale cellekulturer. Til dette formål, vi ty til forskellige teknikker og vi brugte en in vitro- co kultur model baseret på Caco-2 celler opdelte som éncellelag og PBMC, deler det samme næringssubstratet. Denne protokol er blevet udviklet til at fokusere på både makroskopisk effekter, dvs cellernes levedygtighed og Trans-epitelial elektrisk modstand (TEER), og gennem vestlige skamplet, molekylære ændringer, dvs. aktivering af inflammatoriske pathway i immunceller og tight junction protein udtryk i Caco-2 celler. Indledende vurdering af stråling virkninger på Caco-2 cellernes levedygtighed blev vurderet via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) og Trypan blå assays, mens TEER blev målt til faste tidsintervaller gennem et ohmmeter specialdesignet til fælles kultur systemer. På denne måde, kan virkninger på grund af stråling, tilstedeværelse af perifert blod mononukleære celler (PBMC), og i sidste ende deres synergistisk effekt påvises. Gennem disse supplerende teknikker observeret vi en høj radio-resistens af Caco-2 inden for 2-10 Gy af x-stråler og en øget Caco-2 éncellelag permeabilitet når PBMC blev tilføjet. Især blev PBMC tilstedeværelse fundet for at være forbundet med variation i tight junction stillads proteiner udtryk.
Den metode, der blev vedtaget i dette arbejde var designet til at undersøge samspillet mellem kolorektal kræftcellerne og immunsystem, at udnytte en set-up tættere til den fysiologiske tilstand i forhold til normale 2-dimensionelle cellekulturer.
Colorectal karcinom (CRC) betragtes som den tredje mest hyppige form for kræft, med mere end en million tilfælde på verdensplan (Global Cancer Observatory, internationale agentur for forskning i kræft, World Health Organization, http://gco.iarc.fr). Forvaltning af CRC er rutinemæssigt udføres gennem enten kirurgi, kemoterapi eller strålebehandling1. Sammenlignet med invasive teknikker som kirurgi eller kemoterapi, undgår strålebehandling stort set de typiske skader Systemiske reaktioner fra disse kliniske metoder, takket være den lokaliserede levering af stråledosis. Dog kan der opstå bivirkninger i de omkringliggende raske væv, udløser inflammation med direkte skade på sunde celler og skader medieret af ikke-øremærket virkninger2,3,4. Med fokus på de negative virkninger som følge af bestråling under behandling af kolorektal cancer, skal to aspekter undersøges. Først, de mekanismer, der er ansvarlige for intestinal uigennemtrængelighed kunne ændres af stråling levering forårsager, til gengæld muligheden for bivirkninger på grund af en ændret indeslutning af bakteriel befolkning og paracellular passage af molekyler og opløste stoffer. Andet, tilstedeværelsen af gut-associerede lymfatiske væv (GALT) fungerer som en forpost for immunsystemet, med funktionen for at kontrollere bakteriel vækst og mægle generelle immunrespons5,6,7. For at opfylde disse funktioner, holdes tarm uigennemtrængelighed på grund af funktionen af junctional komplekser mellem celler membraner. Af disse grunde, blev de inducerede negative konsekvenser på grund af forskellige doser af x-stråler undersøgt i Caco-2 celler alene og i samarbejde kulturer med PBMC.
Selv om undersøgelser på cellekulturer er den første setline af undersøgelsen i biomedicinsk forskning, kan manglende detaljeret kendskab til mekanismerne kørsel celle biologi og gensidige interaktioner mellem forskellige celletyper blive kritiske når nærmer studiet af fysiologi af organer, systemer og apparater, der nemt ikke kan genskabes i laboratoriet. Vi besluttede derfor, at vedtage en fælles kultur set-up, så både studiet af to cellepopulationer sammen og dissektion af aspekter relateret til intercellulære og ekstracellulære mekanismer.
Fælles kultur er en teknik, udnyttes når man studerer epitelial funktioner og samspillet mellem forskellige celletyper. Især, bliver brugen af en sådan teknik obligatorisk i vores tilfælde, fordi epitheler består af celler karakteriseret ved polaritet. I tilfælde af den intestinale barriere, enterocytes vise en veldefineret polarisering, med apikale og basolateral polakker adskilt normalt på grund af tilstedeværelsen af stram vejkryds-oprettelse af adhæsionsmolekyler. Denne opdeling er nødvendig for væv fysiologi, undgå paracellular handel og tillader passage af beslutsomme molekyler kun. Denne funktion er selvfølgelig umuligt at genskabe med en normal celle dyrkning set-up. Desuden gengiver vedtagelsen af fælles kultur set-up tilstedeværelsen af immunceller kun i basolateral overfladen, mens den apikale overflade (svarende til tarm lumen) ikke er direkte kontakt med andre celler.
For nylig, Caco-2 cellelinjer fået større betydning som en in vitro- model af intestinal barriere. Selvom stammer fra menneskelige kolon adenocarcinom, Caco-2 celler opretholde muligheden for differentiering og skabe en funktionel polariseret éncellelag8, som giver mulighed for undersøgelse af cellemembranen egenskaber når der dyrkes i en fælles kultur indsætte.
Da Caco-2 dyrkning på en porøse membran er en veletableret i vitro model af tarm éncellelag, blevet en forbedring Co kulturen mellem Caco-2 og andre celler. Dette set-up er blevet vedtaget ofte til foranstaltning krydstale mellem forskellige celle typer9 og kan bruges til at optrævle Caco-2 desorienterede svar på udefra kommende stimuli i fælles kultur, med hensyn til Caco-2 kulturperler alene.
Mange undersøgelser har behandlet Caco-2 opførsel når Co kulturperler med både ikke-sygdomsfremkaldende bakterier og perifert blod mononukleære celler, at belyse især krydstale med immunsystemet10. Pozo-Rubio et al. 11 studerede udtryk af adskillige cytokiner i en fælles kultur, Caco-2/PBMC med bifidobakterier stimulere Caco-2 celler. Deres arbejde fremhævet væsentlig ændring at cytokin udtryk profiler afhængig af bakteriel stimulation udført i tilstedeværelse eller mangler PBMC. Deres resultater fører til den konklusion, at tilstedeværelsen af PBMC sensitizes Caco-2 til bifidobakterier.
Forskellige svar af Caco-2 celler til ikke-patogene og patogene bakterier er blevet vurderet af forskellige forskerhold. Parlesak mfl. 12 demonstreret Caco-2 celler immunosuppressive påvirkning Escherichia coli-stimuleret PBMC. Derudover Haller mfl. 13 studerede svar af Caco-2 celler stimuleret med både LPS (LPS) fra enteropathogenic E. coli spp. eller ikke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., styrke den formodninger, Caco-2 cellernes reaktion strengt afhænger af tilstedeværelsen af leukocytter i co kultur set-up.
Udfører forskellige supplerende laboratorium assays (f.eks. vestlige skamplet, trans-epitelial elektrisk modstand, MTT, etc.), ud over analysen af forskellige celletyper vokset i fælles kultur, den hel metode lover resultater, der kan betragtes som mere repræsentativ for hvad der virkelig sker in vivo. Desuden, dette set-up giver mulighed for adskillelse af de forskellige fælles kultur rum, giver ikke kun undersøgelsen af de involverede celletyper, men også intercellulære signaling molekylerne udgivet i øverste vs lavere rum eller i tilstedeværelse vs manglende fælles kultur.
Kolorektal cancer, med dens høje forekomst i de udviklede lande, er en af de hyppigste årsager til sygelighed og dødelighed i befolkningen. Det er normalt styres af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling1. Inden for rammerne af strålebehandling behandlinger, der skal lægges særlig vægt til virkningerne af sunde væv eksponering4; Derudover er systematiske undersøgelser om forholdet mellem stråling og immunsystemet grundlæggende for udviklingen af strategier for radio-immunterapi3.
Den metode, som vi har vedtaget i dette arbejde har været skræddersyet til undersøgelse af Caco-2-celler og PBMC krydstale. Vi fokuserer på effekten af røntgenstråler eksponering af tumorceller, men samme protokol kan tilpasses til undersøgelser med farmakologiske midler. At være tættere på fysiologiske betingelser med hensyn til standard celle dyrkning, er stærk fordelen ved denne metode muligheden for en komplet dissektion af et komplekst system, får mulighed for at analysere både forskellige celletyper og frigivelse af signalmolekyler i de to rum af fælles kultur, selv. På denne måde kan rutinemæssigt anvendt biologiske metoder hjælpe forståelsen af cellulære samspil relaterede mekanismer.
Den første karakterisering af X-stråle-inducerede effekter på Caco-2-celler var baseret på to komplementære målinger, MTT kolorimetriske analysen og Trypan blå farvestof udstødelse test dvs . De tilsyneladende inkonsistente resultater kan forklares ved de forskellige fokus i disse to assays. MTT vurderer oxidoreductase enzymer aktivitet, mens de Trypan blå farvestof er baseret på en levende-celle udstødelse farvestof mekanisme.
Undersøgelsen af Caco-2-PBMC samspillet kræver oprettelsen af en epitel éncellelag stand til at føre til en fuldstændig adskillelse mellem de to rum af fælles kultur. Muligheden for såning Caco-2 celler i fælles kultur indsætte tillader bestråling af kun denne celle population. Da fælles kultur starter efter bestråling, er der ingen bias på grund af enhver utilsigtet bestråling af PBMC. Dette set-up skal håndteres omhyggeligt for at undgå skader (eller forurening) til de cellulære éncellelag under bevægelser af indsatsen fra en 6-godt plade til den anden. Når omhyggeligt udført, er TEER målinger en enkel og ikke-invasiv metode til at undersøge éncellelag permeabilitet. Denne analyse er strengt relateret til fælles kultur set-up, og det er ikke det eneste valg for undersøgelsen af éncellelag permeabilitet. Det giver mulighed for en god reproducerbarhed af foranstaltninger, når det er godt kalibreret med friske komplet medium. Fælles assays fokus på udbredelse af kemiske farvestoffer fra den øverste “apikale” rum til bunden “basolateral” en (fx fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran assay)16. Men da PBMC er til stede i basolateral rum i denne undersøgelse, besluttede vi at undgå indførelsen af kemiske reagenser i eksperimenter.
Blandt de forskellige teknikker i dette arbejde, er TEER måling den eneste, der kræver fælles kultur set-up17,18. Men andre fælles laboratoriemetoder give mere informative resultater, når de anvendes på celler i fælles kultur, som de giver mulighed for undersøgelse af en setup tættere på fysiologiske forhold og dataene, der har en stærkere biologiske betydning. På den anden side skal det bemærkes, at brugen af celler dyrkes på et porøst bærestof kunne føre til vanskeligheder i de operationer, der er nødvendige for at forberede prøverne, såsom celle lysis for forberedelse af cellulære ekstrakter skal analyseres gennem western blotting.
Systemet blev vedtaget i denne undersøgelse har potentiale til at blive yderligere forbedret, fx med anvendelsen af stoffer, der er stand til at genskabe den ekstracellulære matrix milieu. Dog, dette vil også resultere i en øget kompleksitet af systemet, og en komplet dissektion af set-up vil være vanskeligere at opnå.
Opsætninger for Co cellekultur udgør helt sikkert et kraftfuldt værktøj til udvikling af in vitro- forskning, og for forståelsen af komplekse systemer. Denne teknik har potentiale til at øge viden om grundlæggende mekanismer, giver nye inputs til grundlæggende forskningsundersøgelser på molekylære signalering og med mulige applikationer til modulering af aktiviteten af immunsystemet i forbindelse med onkologisk klinisk patienthåndtering.
The authors have nothing to disclose.
Italiensk Institut for kernefysik (INFN) finansieret delvist dette arbejde gennem INFN-MERIDIAN-projektet. Forfatterne anerkender Prof. Edoardo Milotti (fysik afdeling, Universitet i Trieste, Italien) til INFN-MERIDIAN projektkoordineringen; Dr. Roberto Chignola (bioteknologisk institut, universitetet i Verona, Italien) til at give Caco-2-celler, ohmmeter, og for hans værdifulde hjælp og uddannelse. Vi anerkender også Agnese Solari for teknisk bistand.
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |