Vi presenterer en protokoll for å undersøke crosstalk mellom X-ray-bestrålt Caco-2 og perifert blod mononukleære celler (PBMC). Protokollen starter med Caco-2 bestråling og oppsett av co kultur med PBMC; deretter måles trans-epitelial motstand jevnlig over 48 h og western blot i både Caco-2 og PBMC.
Protokollen vedtatt i dette arbeidet tar sikte på å rakne hvordan røntgenstråler forurolige funksjon av intestinal barriere, med fokus på samspillet mellom colorectal kreftceller og immunsystemet. Colorectal carcinoma er blant de fleste vanlig type av kreft, vanligvis behandles med kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling. Fordelene med strålebehandling i målretting svulsten er godt kjent. Men er begrenset eksponeringer av sunt vev til stor bekymring, spesielt om virkningene på intestinal barriere og immunsystemet. Vedtatt oppsettet tillater for å studere samspillet mellom to celle populasjoner i stand mer lik den fysiologiske, sammenlignet med normal cellekulturer. For dette formålet, vi ty til ulike teknikker og vi brukte en i vitro co kultur modell, basert på Caco-2 celler differensiert som monolayer og PBMC, deler den samme kultur mediet. Denne protokollen er utviklet til å fokusere på både makroskopisk effekter, dvs celle levedyktighet og Trans-epitelial elektrisk motstand (TEER), og gjennom western blot, molekylær endringer, dvs aktivering av inflammatoriske pathway i immunceller og tett krysset protein uttrykk i Caco-2 celler. Innledende vurdering av stråling effekter på Caco-2 celle levedyktighet ble vurdert via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) og Trypan blå analyser, mens TEER ble målt ved faste tidsintervaller gjennom en ohmmeter spesielt utformet for co kultur systemer. På denne måten kan effektene stråling, tilstedeværelse av perifert blod mononukleære celler (PBMC), og til slutt deres synergistisk effekt, påvises. Gjennom disse utfyllende teknikker observerte vi en høy radio-motstand av Caco-2 innen 2-10 Gy av røntgenbilder og en økt Caco-2 monolayer permeabilitet når PBMCs ble lagt til. Spesielt ble PBMC tilstedeværelse funnet for å være assosiert med variasjonen i tett krysset stillaset proteiner uttrykket.
Metodikken i dette arbeidet ble utformet å undersøke samspillet mellom tykktarmskreft celler og immunsystemet, utnytte et oppsett nærmere til fysiologiske tilstanden sammenlignet med normal 2-dimensjonal cellekulturer.
Colorectal karsinom (CRC) anses tredje hyppigste type kreft, med mer enn én million tilfeller globalt (Global kreft Observatory, International Agency for forskning på kreft, Verdens helseorganisasjon, http://gco.iarc.fr). Styring av CRC utføres rutinemessig enten kirurgi, kjemoterapi eller strålebehandling1. Sammenlignet med invasiv teknikker som kirurgi eller kjemoterapi, unngår strålebehandling i stor grad de typiske skadelig systemisk reaksjonene avledet fra disse kliniske tilnærminger, takket være lokalisert levering av stråledose. Imidlertid kan bivirkninger oppstå i omkringliggende sunt vev, utløser betennelse med direkte skade friske celler og skade mediert av ikke-målrettede effekter2,3,4. Fokusere på negative effekter på grunn av irradiation under kolorektal kreftbehandling, må to aspekter undersøkes. Først kunne mekanismene ansvarlig for intestinal varmeisolerende endres av stråling levering forårsaker, i sin tur muligheten for bivirkninger på grunn av en endret kontroll av bakteriell befolkningen og paracellular tidens molekyler og solutes. Andre fungerer tilstedeværelsen av gut-assosiert lymfatisk vev (GALT) som en utpost av immunsystemet, med funksjonen kontrollere bakterievekst og formidle den generelle immunforsvar5,6,7. For å oppfylle disse funksjonene, holdes intestinal varmeisolerende på grunn av funksjonen for junctional komplekser mellom cellene membraner. For disse grunner, ble de indusert ødeleggende konsekvensene forskjellige doser av røntgen undersøkt i Caco-2 celler alene og i co kulturer med PBMC.
Selv om gjennomføre studier på cellekulturer er den første setline av etterforskning i biomedisinsk forskning, kan mangel på detaljert kunnskap om mekanismer kjøring celle biologi og gjensidig interaksjon mellom ulike celletyper bli kritisk når nærmer studiet av fysiologi av organer og systemer apparatene som lett ikke kan gjenopprettes i laboratoriet. Derfor har vi besluttet å vedta en co kultur oppsett, slik at både studiet av to celle populasjoner sammen og Disseksjon av aspekter knyttet til intercellulære og ekstracellulære.
Co kultur er en teknikk utnyttes når studere epithelial funksjoner og samspillet mellom forskjellige celletyper. Spesielt blir bruk av slike en teknikk obligatorisk i vårt tilfelle, fordi epithelia er laget av celler preget av polaritet. I tilfelle av intestinal barriere, enterocytes viser en veldefinert polarisering, med apikale og basolateral polakkene atskilt normalt av tett krysset-opprette vedheft molekyler. Dette compartmentalization kreves for vev fysiologi, unngå paracellular handel og tillate passasje av bestemt molekyler bare. Denne funksjonen er umulig å gjenskape med en normal celle dyrking oppsett. Videre gjengir adopsjon av co kultur oppsettet tilstedeværelsen av immunceller i basolateral overflaten, mens den apikale overflaten (tilsvarende intestinal lumen) ikke er direkte i kontakt med andre celler.
Nylig fikk Caco-2 linjer mer betydning som en i vitro modell av intestinal barriere. Selv om avledet fra menneskelige kolon adenocarcinoma, Caco-2 celler opprettholde differensiering evne og opprette en funksjonell polarisert monolayer8, som gjør etterforskningen av cellemembranen egenskaper når dyrket i en co kultur setter.
Siden Caco-2 dyrking på en porøs membran er en godt etablert i vitro modell av intestinal monolayer, har en forbedring vært co kultur mellom Caco-2 og andre celler. Dette oppsettet er vedtatt ofte til mål crosstalk mellom ulike celle typer9 og kan brukes til å løse Caco-2 opprørt respons på ytre stimuli i co kultur, med hensyn til Caco-2 kultivert alene.
Mange studier har adressert Caco-2 når co kultivert med både ikke-patogene bakterier og perifere blod mononukleære celler, å belyse spesielt crosstalk med immunsystemet10. Pozo-Rubio et al. 11 studerte uttrykket av flere cytokiner i en co Caco-2/PBMC-kultur med bifidobacteria stimulere Caco-2 celler. Deres arbeid fremhevet betydelig endring cytokin uttrykket profiler avhengig av bakteriell stimulering i tilstedeværelse/fravær av PBMC. Resultatene føre til konklusjonen at tilstedeværelsen av PBMC sensitizes Caco-2 til bifidobacteria.
Forskjellige svar Caco-2 celler til ikke-patogene og patogene bakterier har vurdert av ulike forskergrupper. Parlesak et al. 12 vist suppressive effekten av Caco-2 celler på Escherichia coli-stimulert PBMC. Videre Haller et al. 13 studerte svaret av Caco-2 celler stimulert med både lipopolysakkarid (LPS) fra enteropathogenic E. coli spp. eller ikke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., styrke den gjetning at Caco-2 cellene svar strengt avhenger av tilstedeværelsen av leukocytter i co kultur oppsettet.
Ved å utføre forskjellige komplementære laboratorium analyser (f.eks western blot, trans-epitelial motstand, MTT, etc.), i tillegg til analysen av forskjellige celletyper vokst co kultur, hele metodikken lover resultater som kan betraktes som mer representativt for hva som virkelig skjer i vivo. Videre er muliggjør dette oppsettet separasjon av de forskjellige co kultur avdelinger, slik at ikke bare studere i celletyper involvert, men også intercellulære signalnettverk molekylene utgitt i øvre og nedre rommet eller i nærvær g. fravær av co kultur.
Tykktarmskreft, med høy forekomst i utviklede land, er en av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet i befolkningen. Det er vanligvis styrt av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling1. I rammen av strålebehandling behandlinger, må særlig oppmerksomhet gis til effekten av friskt vev eksponering4; Videre er systematiske studier på forholdet mellom stråling og immunsystemet grunnleggende for å utvikle tilnærminger av radio-immunterapi3.
Metodene vi vedtatt i dette arbeidet er tilpasset etterforskningen av Caco-2 celler og PBMC crosstalk. Vi fokuserer på effekten av røntgenstråler eksponering av kreftceller, men samme protokoll kan tilpasses til studier med farmakologiske agenter. Å være nærmere fysiologiske forhold med hensyn til standard celle dyrking, er sterk fordelen med denne metoden muligheten for et fullstendig Disseksjon av et komplekst system, gitt analysere både forskjellige celletyper og utgivelsen av signalet molekyler i de to avdelinger av co kulturen selv. På denne måten kan rutinemessig anvendt metoder hjelpe forståelse av mobilnettet samspill relaterte mekanismer.
Første karakterisering av X-ray-indusert effekter på Caco-2 celler var basert på to utfyllende målinger, MTT kolorimetrisk analysen og Trypan blå fargestoff utelukkelse test dvs . De tilsynelatende inkonsekvente resultatene kan forklares med forskjellig fokus for disse to analyser. MTT vurderer oxidoreductase enzym aktivitet, mens Trypan blå fargestoff er basert på en levende celle utelukkelse fargestoff mekanisme.
Etterforskningen av Caco-2-PBMC samspill krever etableringen av en epithelial monolayer kunne føre til en fullstendig skille mellom de to avdelinger av co kultur. Muligheten for såing Caco-2-celler i sette inn co kultur kan bestråling av bare celle befolkningen. Co kulturen starter etter bestråling, er det ingen skjevhet på grunn av noen utilsiktet eksponering av PBMC. Dette oppsettet må håndteres forsiktig for å unngå skade (eller forurensning) i cellular monolayer under bevegelser av sette fra en 6-vel plate til den andre. Når nøye utført, er TEER målinger en enkel og ikke-invasiv metode for å undersøke monolayer permeabilitet. Denne analysen er strengt knyttet til co kultur-oppsett, og det er ikke det eneste valget for undersøkelse av monolayer permeabilitet. Det gjør en god reproduserbarhet tiltak når det er godt kalibrert med fersk komplett medium. Felles analyser fokusere på spredningen av kjemiske fargestoffer fra øvre “apikale” rommet til bunnen “basolateral” en (f.eks fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran analysen)16. Men siden PBMC finnes i basolateral rommet i denne studien, besluttet vi å unngå innføring av kjemiske reagenser i forsøkene.
Blant de ulike teknikkene i dette arbeidet, er TEER måling det eneste som krever co kultur oppsett17,18. Men gi de andre vanlige laboratorium teknikkene mer informative resultater når brukt på celler i co kultur, som de tillater etterforskningen av en setup nærmere fysiologiske forhold og dataene har en sterkere biologisk betydning. På den annen side, må det bemerkes at bruken av celler dyrket på en porøs støtte kan føre til noen problemer i operasjoner måtte forberede utvalgene, for eksempel celle lysis for utarbeidelse av mobilnettet ekstrakter skal analyseres gjennom vestlige blotting.
Systemet innført i denne studien har potensial til å bli ytterligere forbedret, f.eks med anvendelse av stoffer kan gjenskape ekstracellulær matrix miljøet. Men dette vil også resultere i en økt kompleksitet av systemet, og en komplett Disseksjon av oppsettet blir vanskeligere å oppnå.
Oppsett for co cellekultur sikkert representerer et kraftig verktøy for fremme av i vitro forskning og forståelse av komplekse systemer. Denne teknikken har potensial til å øke kunnskap om grunnleggende mekanismer, gir nye innganger til grunnleggende forskningsstudier molekylær signalering og med mulig programmer modulering av aktiviteten av immunsystemet i rammen av oncological kliniske pasient ledelse.
The authors have nothing to disclose.
Italiensk Institutt for kjernefysikk (INFN) finansiert delvis dette arbeidet gjennom INFN-MERIDIAN prosjektet. Forfatterne bekrefter Prof Edoardo Milotti (fysikk avdeling, Universitetet i Trieste, Italia) for INFN-MERIDIAN prosjektkoordinering; Dr. Roberto Chignola (bioteknologi Institutt, Universitetet i Verona, Italia) for å gi Caco-2 celler, ohmmeter, og hans verdifulle hjelp og opplæring. Vi erkjenner også Agnese Solari for teknisk assistanse.
ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |