Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/56911
Automatic Translation
*1, *1,2, *2, *2, 2, 1,2
1Neuroscience Program, University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology, University of Miami
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver användningen av genetiskt kodade Ca2 + reportrar att registrera ändringar i neural aktivitet i beter sig Caenorhabditis elegans maskar.

Abstract

Det har blivit allt tydligare att neural krets aktivitet i beter sig djur skiljer sig väsentligen från som hos sövda eller immobiliserade djur. Mycket känsliga, genetiskt kodade fluorescerande reportrar av Ca2 + har revolutionerat inspelning av cellen och synaptisk aktivitet med hjälp av icke-invasiva optiska metoder i beter sig djur. När de kombineras med genetiska och optogenetic tekniker, de molekylära mekanismerna som modulerar cell och krets verksamhet under olika beteende som staterna kan identifieras.

Här beskriver vi metoder för proportionerlig Ca2 + avbildning av enstaka nervceller i fritt bete Caenorhabditis elegans maskar. Vi visar en enkel montering teknik som försiktigt överlägg maskar som växer på en standard Nematoden Growth Media (NGM) agar blockera med ett täckglas, tillåter djur registreras på högupplösta under obegränsad rörlighet och beteende. Med denna teknik använder vi känslig Ca2 + reportern GCaMP5 för att registrera förändringar i intracellulära Ca2 + i serotonerga hermafrodit specifika nervceller (HSNs) som de kör äggläggningen beteende. Genom att samtidigt uttrycka mCherry, en Ca2 +-okänsliga fluorescerande protein, kan vi spåra positionen för HSN inom ~ 1 µm och rätt för fluktuationer i fluorescens orsakad av förändringar i fokus eller rörelse. Samtidig, IR brightfield imaging tillåter beteende inspelning och djur spårning med hjälp av en motoriserad scenen. Genom att integrera dessa mikroskopiska tekniker och dataströmmar, kan vi spela in Ca2 + aktivitet i C. elegans äggläggningen kretsen eftersom det fortskrider mellan inaktiva och aktiva beteende stater över tiotals minuter.

Introduction

Ett centralt mål för neurovetenskap är att förstå hur nervceller kommunicerar i kretsar för att driva djurs beteende. Neurala kretsar integrera en rad olika sensoriska signaler för att ändra krets verksamhet, därmed körning beteendemässiga förändringar nödvändiga för djur att bemöta sina miljöer. Nematoden, C. elegans, har en enkel nervsystemet med 302 nervceller vars synapsförbindelser har varit helt mappade1. Gener som kodar för proteiner som är involverade i neurotransmission bevaras dessutom mycket mellan C. elegans och däggdjur2. Trots dess nervsystemet anatomiska enkelhet visar det en komplex repertoar av bevarade beteenden ger en bördig plattform för att förstå hur nervceller reglerar beteende3.

C. elegans är mottagliga för tillämpningen av ett brett utbud av metoder såsom genmanipulation, laser cell ablation, elektrofysiologiska tekniker, samt i vivo optisk imaging4,5. Nyligen genomförda studier har producerat detaljerade kartor över den viktiga signalsubstansen signalering system i C. elegans inklusive de kolinerga och GABAergic neuronala nätverk. Dessa studier, tillsammans med pågående studier för att kartlägga uttryck för alla neuronala G-protein kopplade receptorer placera denna modell i en unik position att utnyttja mycket detaljerade strukturella och funktionella neuronala connectivity kartor för att fullt förstå hur dessa olika signalsubstanser signalen via olika receptorer och tidsskalor att driva olika aspekter av djurs beteende.

För att studera dynamiska neuronal aktivitetsmönster i alla system, är en nödvändig förutsättning att utveckla robusta metoder för att registrera aktivitet i enskilda nervceller eller hela kretsar under beteenden. Särskilt viktigt är föredragandens sådana optiska metoder för att visualisera presynaptiska aktivitet som driver synaptiskt vesikelprotein fusion. Snabb och mycket känsliga fluorescerande reportrar av intracellulära Ca2 +, tillsammans med den ökande tillgången till känsliga fotodetektorer, har revolutionerat inspelningen av cellen och synaptisk aktivitet i vaken, levande djur under beteende. Eftersom ett större resultat av synaptisk elektriska aktivitet är att reglera Ca2 + kanaler, är ändringar i intracellulära Ca2 + tänkt att troget rapport behaviorally relevanta förändringar i cellernas aktivitet.

I denna studie presenterar vi ett tillvägagångssätt för att utföra proportionerlig Ca2 + imaging i de serotonerga HSN motoriska nervceller som främjar äggläggningen beteende i C. elegans6,7. Denna strategi bygger på tidigare ansträngningar att visualisera Ca2 + aktivitet i C. elegans och äggläggningen krets under beteende5,8,9,10,11 . Metoden tillåter samtidigt korrelera de observerade förändringarna i cell/krets verksamhet med äggläggningen händelser, samt ändringar i djurens rörelseapparaten tillstånd. Även om vi använder denna metod för att studera aktivitet i vuxna maskar, visar opublicerade verk från vårt laboratorium detta tillvägagångssätt kan förlängas till unga djur på den fjärde (L4) larvstadium samt. Det är troligt att aktiviteten av andra C. elegans nervceller som fungera i olika kretsar och beteenden bör finnas på samma sätt med denna teknik. Andra nyligen utvecklat snabb Ca2 + indikatorer med icke-överlappande utsläpp spectra12,13,14,15,16, optogenetic verktyg17 , och genetiskt kodade optiska indikatorer membran spänning18, bör göra det möjligt för oss att utföra genomträngande 'all-optiska' utredningar om hur förändringar i neural krets aktivitet kör distinkta beteende stater.

Protocol

1. stammar, kultur Media och montering av djur

  1. Växa C. elegans maskar vid 20 ° C på standard 60 mm Nematoden tillväxt Medium (NGM) agarplattor seedade med OP50 E. coli bakterie mat19.
  2. Förbered två plasmider för varje cell-specifika promotorn sevärdheter: en, körning uttrycket av GCaMP5 till rekord intracellulära Ca2 +, och den andra, körning uttrycket av mCherry att möjliggöra proportionerlig kvantitering av GCaMP5 fluorescens förändringar och förenkla objekt att hitta och mätning.
    Obs: GCaMP5:mCherry proportionerlig imaging korrigerar för fluktuationer i GCaMP5 fluorescens som följd av förändringar i fokus och djur rörelse, inte faktiska förändringar i intracellulära Ca2 +.
  3. Injicera GCaMP5 - och mCherry-uttryckande plasmider tillsammans med pL15EK synliga rescue markör plasmiden i könskörtlarna av LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X muterade djur och återskapa icke-Muv lin-15(+) djur att uttrycka GCaMP5 och mCherry från en hög-kopia transgenens20,21,22. Använd lite-1 mutant bakgrunden för att minska blå-ljus undvikande beteende23,24.
  4. Integrera transgener till kromosomerna att minska mosaicism och förenkla generationen av sammansatta mutant stammar25.
    Obs: Den LX2004 stammen beskrivs här bär en integrerad high-kopia transgene som uttrycker GCaMP5 och mCherry i HSNs från Promotorn nlp-3 (se Tabell för material)26,27, 28 , 29. Promotorn nlp-3 befanns bilresa starkt uttryck i HSNs av sena L4 och vuxna djur utan orsakar betydande brister i HSN utveckling eller äggläggning beteende jämfört med andra initiativtagare testade (e.g.,tph-1, EGL-6och unc-86). Denna stam och andra att uttrycker GCaMP5 och mCherry i den ventrala sladd (VC) motoriska nervceller, vulvaabscess muskler och uv1 neuroendokrina celler finns från stadens Caenorhabditis genetik och Detaljer för deras konstruktion har beskrivits 27.
  5. Tillämpa OP50 bakteriell mat från en seedade NGM agarplatta längst ned på en platina mask plocka och använda den för att överföra ~ 20 sent L4 LX2004 djur som uttrycker GCaMP5 och mCherry i HSNs från Promotorn nlp-3 . Se till att utveckla vulva visas i ett stereomikroskop som en tydlig mörk fläck omgiven av en vit halvmåne. Inkubera djur vid 20 ° C för 24-40 h.
  6. Efter inkubering, gälla OP50 plockningen och överföring ~ 3 av maskar till ett unseeded NGM, lämnar en liten mängd mat bakom för maskar att mata vid under imaging. Säkerställa tillräcklig mat, som för lite bakteriell mat kommer att uppmuntra maskar att vandra bort från centrum av plattan medan för mycket mat kommer att öka bakgrunden fluorescens och orsaka hypoxi.
  7. Använd en platta rundade spatel för att skära en ~ 20 x 20 mm chunk från plattan bär maskar och överföra bit nedåt på mitten av ett rent 24 x 60 mm #1.5 täckglas (figur 1). Starta programmet från en sida att hålla bubblor från att vara instängda under täckglaset och störande med imaging. Lägg en 22 x 22 mm #1 täckglas till toppen av bit att minska stickning och avdunstning.

2. maskinvara och Instrumentation Setup

  1. Placera den iscensatta, transgena maskar på scenen av en inverterade Mikroskop med en ≥ 0,7 numerisk bländare Plan-Apochromat 20 x objektiv, motorized XY scenen kontrollerbar med en joystick, image splitter och fluorescens filter för samtidig GCaMP5 och mCherry magnetisering och utsläpp, kameror för fluorescens och infraröd brightfield imaging, och ett triggerable Light Emitting Diod (LED) belysning system (figur 2A).
    Obs: En 80/20-stråldelare skickar 80% av bilden signalen till fluorescens kameran och 20% till brightfield kameran. En upprätt Mikroskop kan också användas, men NGM bit bör placeras mellan en glasskiva och det stora täckglaset i detta fall.
    1. Använd de binokulära okular för att välja en mask för avbildning. När ett djur är markerad, Skjut IR filtret på plats ovanför kondensorn.
  2. Transistor-transistor logic (TTL) utlöser
    1. Fästa koaxiala kablar från varje rad tre TTL trigger utgång på fluorescens kameran. Anslut den första produktionen till BNC-ingången #3 LED belysning systemet.
    2. Anslut den andra utgången till en BNC 'banan' med gröna och bruna kablarna från den 8-GPIO stift kör till GPIO input #3 (stift 4) och mark (5 stift) av den infraröda kameran, respektive.
    3. Anslut tredje utgången till en BNC 'banan' med bygel sladdar till den #8 digitala ingången och marken i enhetens digital förvärv (figur 2B).
  3. Digitala förvärv enhet (DAQ)
    1. Anslut DAQ microcontroller styrelsen (se Tabell för material) till datorn via en USB-kabel. Uppdatera firmware med standarden Firmata protokoll (se Tabell av material) och konfigurera USB-porten att kommunicera på 57600 baud.
  4. Lysdioder
    1. Köra programvaran LED Controller (se Tabell för material). Växla till Trigger-läge från 'Kontinuerlig till 'Gated' och välj Trigger kanal ' 3' för båda 470 och 590 nm lysdioderna.
    2. Aktivera och ange LED power för varje LED (t.ex. set 470 nm LED 20% och 590 nm LED till 40%).
  5. Kör den följetong-steg kommunikation script 'XY-scen-final' i Bonsai (se Tabell för material)30. Klicka på den grå 'CsvWriter'-nod och välj en mapp att spara den inspelade X och Y skede information (figur 3). Tryck på den gröna pilspetsen i verktygsfältet för att initiera DAQ.
    Obs: Skriptet startar inspelning positionen X och Y scenen när fluorescens kameran skickar en TTL-signal. Detta scriptet ger fyra kolumner data: ram nummer, X position (µm), Y-position (µm) och intervallet mellan ramar (s).
  6. I den infraröda kameran skrivningsprogrammet (se Tabell för material) under 'Anpassad videolägen,' väljer du ”läge 1” (2 x 2 binning, 1 024 x 1 024 pixlar), och ”Pixel Format Raw 8”. Under ' Trigger / Strobe', ange utlösare inmatningsraden (GPIO) till ”3”, polariteten till ”hög”, ”läge” till ”14”. Växla 'Aktivera' stoppa ram förvärv tills en TTL utlösa signalen tas emot.
    1. Lämna fönstret öppet, klicka på den röda ”Record”-knappen på verktygsfältet Visa huvudkameran. Välj mappen för bildsekvenser som ska sparas. Välj 'Buffrad' inspelningsläge och Spara 'Bilder' i JPEG-format. Klicka på ”Starta inspelning” för att initiera förvärvet.
  7. Fluorescens kamera och bild splitter
    Obs: GCaMP5 och mCherry fluorescens kanaler måste hämtas samtidigt för att säkerställa korrekt bildregistrering för proportionerlig kvantifieringsmetoden. En bild-splitter tillåter två-kanals förvärv av GCaMP5 och mCherry fluorescensen på en sensor.
    1. På fliken 'Capture' i förvärvet bildbehandlingsprogram (se Tabell för material), Ställ in exponeringstid till 10 ms, binning till 4 x, och bilddjup till 16-bitars. Välj en centrerad kamera subarray av 512 pixlar bred x 256 bildpunkter hög. Klicka på 'Visa utdata Trigger Options' och ange alla utlösare till 'Positiv'.
      Obs: DAQ kan ibland missa TTL utlösare om de är 10 ms eller mindre.
    2. Se till att 'Trigger 1' och 'Trigger 2' är inställda på ”exponering” medan 'Trigger 3' är inställd på 'Programmerbar' med en 'under' 25 ms. Under fliken 'Sequence', Välj 'Tid förfaller' med en 'fältet Delay1' 50 ms att samla bilder på 20 Hz. Välj 'Spara på tillfällig buffert.'
  8. PMT få och laser intensitet under tre kanals confocal imaging
    1. Ställa in förstärkning av PMT så bakgrunden fluorescensen är på en nivå strax ovanför lägsta (svart nivå). Öka 561 nm (grön) laser power tills en mättad 12- eller 16-bitars pixel observeras på den presynaptiska terminus i mCherry kanalen.
    2. Justera 488 nm (blå) laser intensitet så att GCaMP5 fluorescens syns bara på den presynaptiska terminus ovan bakgrund. Här låg inställningen förhindrar mättnaden i GCaMP5 pixlar när fluorescensen ökar som svar på stark Ca2 + transienter. Öppna confocal pinhole ända till maximera ljus capture.

3. proportionerlig Ca2 + Imaging och beteende inspelning

  1. Klicka på ”Start” för att börja inspelningen under fliken 'Sequence' i programvaran fluorescens förvärv. Spåra masken med joystick, att hålla cellerna och synapser av intresse i fokus och i mitten av synfältet (FOV). Klicka på knappen 'Statistik' i fönstret histogrammet att Visa pixel statistiken för varje kanal.
  2. Justera LED kraften att säkerställa en maximal en bildpunkt mCherry fluorescens vid den presynaptiska ändstationen av ≥ 8 000 räknas (~ 4.000 photoelectrons), ger en ~ 12-bitars dynamiska omfånget ovan bakgrund (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 signaler på presynaptiska terminus under vila (låg) Ca2 + bör runt ~ 2500 räknas - bara synlig ovanför bakgrund.
  3. Spela in tills en äggläggande aktiva tillståndet uppnås; Detta inträffar vanligtvis varje 20-30 min i en vildtyp mask7. Spara en 10-minuters delmängd (12,001 ramar), 6.000 bildrutor före och efter den första äggläggning händelsen (frame 6,001). Se till att hålla den samma undergrupp av brightfield bilder av masken beteende och tidpunkter av XY skede ställning, eller exakt synkronisering av dataströmmar förloras.
  4. Använda ImageJ och BioFormats plugin (se Tabell för material) för att konvertera bildsekvenser till bild flödescytometri (.ics) standardformat så att det kan importeras till programmet proportionerlig kvantifieringsmetoden.

4. bild segmentering och kvantitativ analys

  1. Importera bildsekvenser i proportionerlig kvantitering programvara (se Tabell för material). Klicka på 'Autokontrast' i menyn 'Verktyg' och Justera kontrasten för varje kanal för att fastställa lämpliga svart (~ 1800) och vit nivåer (10.000). Välj 'Ändra färger...' i menyn verktyg för att bekräfta att mCherry och GCaMP5 kanalinställningar färg är rätt (figur 4A - C).
    1. Högerklicka på på tidsserien i fliken 'Sequence' och sätta den till 20 bildrutor/s och 1,25 µm/pixel.
  2. Välj 'Baserat på' på 'Verktyg'-menyn och välj ”GCaMP5” för 'Kanal A' och ”mCherry” för 'Kanal B'. Klicka på ”beräkna” bredvid ”tröskel” att subtrahera bakgrunden från varje bildsekvens. Välj ”tillämpa en regnbåge LUT till baserat på kanalen”.
    Obs: För en inspelning med en genomsnittlig baslinje på 0,3 (låg Ca2 +) och en max-förhållandet av 2-3 (hög Ca2 +), en lämplig uppslagstabell skulle vara från 0 (blå) till 1 (röd).
  3. Generera en intensitet moduleras baserat kanal med hjälp av mCherry channel (figur 4D). Baserat på intensitet moduleras kanalen är en miljoner-av-färger bild där baserat på färgen är mappad på ljusstyrkan på kanalen mCherry.
  4. Under fliken 'Mått' skapa en objekt-finding protokoll genom att dra verktyget 'Hitta objekt med intensitet' till fönstret 'Protokoll'. Klicka på '' för att ställa fönstret på mCherry intensitetsvärden och hitta objekt.
    1. Välj intensitet värden ≥ 2 standardavvikelser (SD) över bakgrunden (t.ex. lägre gränsen för ~ 2500, övre gräns på 65 535). Kontrollera den presynaptiska terminus upptäcks och som 'automatiskt uppdatera feedback' väljs från menyn mätningar.
      Obs: Programvaran kan också identifiera objekt genom sin standardavvikelse från bakgrunden med ett relaterade protokoll 'SD intensitet.' Om ett särskilt ljus objekt träder FOV, kan det dock dramatiskt ändra genomsnittliga intensiteten under dessa tidpunkter, som påverkar de intensitet cutoffs används för att hitta HSN. Denna variation uppstår inte om raw intensitetsvärden används för att hitta objekt.
  5. Lägga till ytterligare filter inriktning endast mCherry kanalen (storlek, Max intensitet, etc.) om nödvändigt att utesluta oönskade objekt som huvud, svans och gut fluorescens. Välj 'Göra mätningen objekt' från menyn mätningar och välj 'Alla tidpunkter.'
    Obs: Detta kommer att utföra protokollet, skriva alla mätningar till en kommaavgränsade värden (.csv)-fil som ska exporteras med kommandot 'exportera' i menyn Arkiv.
  6. Öppna exported.csv filen och kopiera tidpunkt, område (µm2), medelvärde (baserat på kanal), centroiden X (µm) och centroiden Y (µm) data i ett nytt blad. A.csv exportfilen utan kolumnrubriker. Proportionerlig kvantitering programvaran kan klassificera en cell av intresse som ett eller flera objekt per tidpunkt.
    1. Om du vill kombinera dessa objekt, använda ett anpassat skript 'AnalzyeGCaMP_2017.m'.
      Obs: Skriptet också identifierar Ca2 + (ratio) toppar i data och sparar a.csv i deras tidpunkter, peak amplituder och peak bredder. Det genererar också PostScript-filer för rå och kommenterad baserat på spåren. Med denna information, bör Ca2 + övergående amplitud mellan övergående intervall fastställas.
  7. Lägg till utsignalen X och Y centroiden värdena från varje fluorescens objekt X och Y värdena registreras av XY-scenen skriptet från Bonsai. Använda XY nettoställning att generera en mask locomotion trace och beräkna cellen förskjutning och hastighet som åtföljer olika beteenden har31.
  8. Importera de inspelade brightfield bilderna till ImageJ som en virtuell stack. Kommentera äggläggningen händelser och andra beteenden. Jämföra tidpunkten för dessa händelser till Ca2 + toppar från baserat på tracen.

Representative Results

Den enkla montering teknik som beskrivs här (figur 1) orsakar minimala förändringar till kultur miljö L4 och vuxen C. elegans samtidigt som hög upplösning inspelning i beter sig djur genom ett täckglas (figur 4). Synkronisering av LED ljuskällor, scenen styrenheter och kameran exponeringar möjliggör för datainsamling från flera strömmar på 20 bildrutor/s upp till 1 h. mellanliggande förstoring (20 x) med hög numeriska bländaröppningen mål (0,7-0,8) ger bra rumslig upplösning av regionen synaptic i äggläggningen beteende kretsen, även med 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Samtidiga förvärv av GCaMP5 och mCherry fluorescens signaler (figur 4A, B) används för att generera en pixel-till-pixel baserat kanal som kompenserar för förändringar i djurförflyttningar och fokus (figur 4D). HSN presynaptiska slutstationen är så stort som många neuronala cell organ i C. elegansoch ändringar i presynaptiska HSN Ca2 + kan visualiseras tydligt. Stora FOV av infraröd brightfield kameran tillåter masken spåras manuellt under inspelning (figur 4E). För varje djur, kan ändringar i intracellulära Ca2 + korreleras med beteenden tydligt i brightfield imaging inklusive ägg release och förändringar i locomotion (figur 4E).

Kvantitering av HSN Ca2 + och hastighet bekräftar att maskar ändrar deras förflyttning eftersom de övergången till äggläggningen beteende. Det finns betydande skillnader i masken hastighet före, under och efter äggläggningen aktiva tillståndet (figur 5A). Detta orsakas inte av buller inneboende till bildtagning eller spårningssystem. Zooma in en äggläggande händelse, vi ser en stark förändring i GCaMP5 fluorescens (ΔF/F) före händelsen äggläggning medan mCherry fluorescens är relativt oförändrad (figur 5B). Uppmätta förändringar i förhållandet GCaMP5:mCherry (ΔR/R) visar tydligt en HSN Ca2 + övergående ~ 4 s före ägg release (figur 5B). Sammanfallande med vulval muskelkontraktion, en tydlig avmattning av masken locomotion uppstår att ändarna med ägg release. Tidigare resultat har visat att de kolinerga VC motoriska nervceller, som innerveras av HSNs, visar topp aktivitet under stark vulval muskelsammandragningar och ägg pressmeddelande 8,10,27. Vi har också visat att optogenetic aktivering av VC nervceller driver en omedelbar avmattning av förflyttning, vilket tyder på att VC nervceller kan aktiveras med vulval muskelkontraktion, därmed bromsa locomotion tills som får feedback av ägg release27 .

Bildtagning och spårande system beskrivs tillåter visualisering av den rumsliga organisationen av äggläggningen beteende (figur 5C). Som tidigare visat, maskar ange ihållande körningar av framåt locomotion strax före det aktiva tillstånd32. Maskar tillbringa merparten av sin tid födosök på bakterier i mitten av agar bit. Före inträde i det aktiva tillståndet flyttar maskar bort från maten, som sammanfaller med utseendet på sällan HSN Ca2 + transienter. HSN verksamhet övergår sedan till burst bränning, med flera tättliggande HSN Ca2 + transienter som upprätthåller äggläggningen händelser. Maskarna sedan ofta vända, fortsätter framåt locomotion och lägger ägg på vägen tillbaka mot sin startposition nära OP50 bakterierna. Vi förmodar att förändringar i lokala O2 och/eller CO2 -koncentration kan påverka där maskar beslutar att lägga ägg33,34.

Figure 1
Figur 1. C. elegans montering teknik för högupplöst avbildning av äggläggningen krets verksamhet och beteende. Toppen, det sista fästet från sida. Botten, det sista fästet som ses genom botten på det stora täckglaset. Pilarna anger OP50 bakteriell mat, C. elegans maskar och ägg, inklämt mellan NGM agar bit och det stora 24 x 60 mm täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Widefield proportionerlig Ca2 + imaging och beteende inspelning på en inverterad epifluorescensmikroskop. (A) Worm ställning och beteende fångas i brightfield via en 20 x (0.8 NA) Plan-Apochromat mål med infraröd (750-790 nm) ljus (lila pilarna) som avges från en halogenlampa genom NGM bit. En joystick och motoriserade scenen controller används för att hålla masken i synfältet under inspelning. Skede position (Δx, Δy) skickas till datorn genom den seriella porten. GCaMP5 och mCherry proteiner som uttrycks i masken exciteras med 470 nm (blå pilar) och 590 nm (gula pilar) Light Emitting dioder (LED). Utsända GCaMP5 (gröna pilar) och mCherry (orange pilar) fluorescens tillsammans med IR-ljuset passerar genom flera band dichroic spegel (se Tabell för material). En 80/20-stråldelare skickar 20% av ljuset genom en 0.63 x demagnifer för fånga på en IR-känslig CMOS kamera (lila pil). Resterande 80% av ljuset skickas via mikroskopet sida-port till en bild-splitter som separerar GCaMP5 och mCherry fluorescens på separata halvorna av en sCMOS kamera när du tar bort IR brightfield ljus. Data från båda kamerorna överförs till en dator via USB3 kablar. Trigger hamnarna från fluorescens sCMOS kameran (blå) används för att skicka + 5V TTL utlöser den LED belysning systemet, IR brightfield CMOS kameran och den digitala förvärv enhet (DAQ). (B) utlösa 3 utgång TTL-signaler är upptäcks av DAQ på digitala pin #8 och skickas till datorn via en USB-anslutning. Dessa digitala ingångar utlösa en ' där XY' seriella kommando från en Bonsai programvara skript (XY-scenen-slutlig) som läser X och Y stage position för varje GCaMP5/mCherry fluorescens/infraröda bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Layout av Bonsai följetong-steg kommunikation skriptet XY-scenen-final. Toppen DigitalInput nod (rosa) läser TTL utlösare kommer in pin #8 av DAQ. För varje positiv TTL spänning (grön), DAQ gör en tidsstämpel (blå) och skriver en 'Där XY?' sträng (rosa) till scenen handkontrollen via serieporten (grå). Noden SerialStringRead (rosa) läser X och Y samordna svar från scenen controller. Denna sträng sedan omvandlas till µm och separeras i X och Y scen koordinater. Slutligen, dessa fyra strömmar kombineras med en zip nod (blå) och en fyra column.csv fil skrivs: en ram räkning av de TTL-signaler tas emot (utbud nod, rosa), X och Y koordinater och intervallet mellan efterföljande tidpunkter (vanligtvis ~ 50 ms när inspelning på 20 Hz). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Representativa micrographs av HSN fluorescens och hela djur brightfield under äggläggningen beteende. (A–D) Samtidiga proportionerlig avbildning av GCaMP5 och mCherry fluorescens i HSNs precis innan ägget release. HSN presynaptiska termini indikeras med pilspetsar. (C) slå samman av GCaMP5 och mCherry fluorescens. (D) intensitet-modulerat GCaMP5:mCherry förhållande; en hög andel (röd) indikerar höga intracellulära Ca2 + på presynaptiska terminus. (E) Brightfield bild av hela masken bara efter äggen har lagts. Pilspetsar visar de främre och bakre halvorna av vulva som ägg. Skalstapeln för alla bilder är 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Inspelning av HSN Ca2 + och locomotion hastighet under äggläggningen beteende. (A) spår av GCaMP5:mCherry baserat på ändringar i svar på intracellulära Ca2 + transienter (ΔR/R; röd) tillsammans med momentan mask hastighet (µm/s; blå). Äggläggningen händelser indikeras av pilspetsar. (B) spår av HSN GCaMP5 fluorescens (green; ΔF/F), mCherry fluorescens (röd; ΔF/F), GCaMP5:mCherry fluorescens baserat (svart, ΔR/R) och mask hastighet (blå) runt tidpunkten för ägg release. (C) rumsliga organisationen äggläggningen och locomotion beteenden under hela 10-min inspelningen. Worm spåret erhölls från XY skede information som lades till den HSN erhålls från mCherry fluorescens inspelningen centroiden ställning. Tidpunkten för HSN transienter (röda cirklar), äggläggningen händelser (svart pilspetsar), och början och slutet av inspelningen (grön och blå diamanter) indikeras. Skalstapeln är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Transgener:

Eftersom mCherry uttryck har förbättrats genom kodon-optimering och intron insättning (och mest tillgängliga GCaMP reportrar har inte), injicera ~ 4 x mängden GCaMP5-uttryckande plasmiden att säkerställa jämförbara nivåer av GCaMP5 fluorescens under stark Ca 2 + transienter. Räddning av lin-15(n765ts) mutation tillåter för facile återvinning av transgena djur med minimala effekter på äggläggning och andra beteenden35. Transgener bör integreras för att säkerställa enhetliga uttryck och imaging villkor mellan olika djur25. Valbar markörer inklusive antibiotikaresistens36,37 och räddning av temperaturkänsliga lethals38 borde också fungera, men eftersom icke-transgena djur är döda, bekräftelse av transgenens integration och homozygosity är svårare jämfört med markörer som presenterar en synlig fenotyp25. Dominerande markörer som störa normal förflyttning och minska fitness, såsom rol-6(dm), bör undvikas39. Imaging i lite-1 är mutant bakgrunden viktigt att minska blå ljus escape Svaren under imaging23,40,41. Ytterligare mutation av gur-3, som agerar parallellt med lite-1, kan ytterligare minimera kvarvarande beteende och fysiologiska förändringar orsakade av blå ljus42. Bekvämt, gur-3, lite-1och lin-15 ligger alla på den högra halvan av kromosom X, vilket bör förenkla byggandet av nya stammar för Ca2 + imaging och optogenetic experiment.

Eftersom exponeringstider är kort och bilder samlas in vid 20 Hz, måste GCaMP5 och mCherry signaler vara ljusa. Den mest sannolika förklaringen för bullriga Ca2 + inspelningar är dim fluorescens orsakad av svag reporter uttryck. Projektansvariga bör rimligen specifika för regionen som avbildas. Eftersom HSN cellkroppen och synapser på vulval musklerna är i mitten av kroppen, ytterligare uttryck från nlp-3 arrangören i huvud och svans är oftast utanför synfältet och kan uteslutas med hjälp av ytterligare filter i den Proportionerlig kvantitering programvara. För att säkerställa att observerade förändringar i GCaMP5 fluorescens resultatet från faktiska förändringar i intracellulära Ca2 +, kontroll transgener uttrycker GFP istället för GCaMP5 bör förberedas självständigt och analyserat26. Nyare Ca2 + reportrar med olika Ca2 + känslighet, kinetik och färger har utökat valet av imaging verktyg tillgängliga, men varje ny reporter ska valideras med hjälp av Ca2 +-okänsliga fluorescerande variant14 ,16.

Media:

NGM plattor för imaging bör förberedas med hög kvalitet-agar. Lägre kvalitet agar kommer inte helt lös vid autoklavering, lämnar små partiklar som scatter ljus under imaging och öka bakgrunden fluorescens. Molekylär biologi grade agar kan användas i stället, men tillsatta mängden bör minskas för att upprätthålla likvärdig plattan fasthet.

Jämförelser med andra metoder för montering:

Tidigare metoder för bilden aktivitet i äggläggningen beteende kretsen har använt maskar orörlig med lim till en agaros pad. Under dessa förhållanden, krets aktivitet och äggläggningen beteende är inte gynnade utan en minskning av kultur media osmolaritet8,10,44,45. Nyligen tyder på att flera mask beteenden moduleras av locomotion staten, ifrågasätter om förhållandet av cellernas aktivitet observerats hos immobiliserade djur som hos fritt beter djur. Vi har nyligen visat att äggläggningen krets aktivitet oväntat fasas med locomotion26,27. Likaså integrerar konkurrensbetingat Ca2 + signalering i den RIA interneuron aktivitet från sensoriska nervceller och huvudet motoriska nervceller under födosök rörelser46. Defekation beteende åtföljs av en exakt och stereotypa rörelsemönster som gör att djuren att flytta bort från deras födosök plats innan utvisa avfall47. Sammantaget tyder dessa resultat på att korta inspelningar av krets aktivitet från immobiliserade djur kan vara fundamentalt annorlunda från dem som erhålls i fritt beter djur.

Trots att direkt under ett täckglas, liknar maskens beteende det sett på standard NGM tallrikar. Lagda ägg kommer för att kläckas, och den lilla mängden mat deponeras tillåter L1 larver att växa till vuxna (inga data anges). Den stora agar bit storleken möjliggör rimliga gasutbyte och motstår uttorkning, även om för mycket mat kommer att öka bakgrunden fluorescens. Denna metod fungerar bäst för vuxna, kan tekniken också användas till bild L4 djur. Tjockleken på vattenskiktet mellan bit och täckglaset är dock sådan att mindre larver har svårt att krypa, och kan ofta fastna i kölvattnet av en glidande vuxen.

En begränsning av denna montering teknik är att direkt mekanisk eller kemisk stimulering till exakt regioner av kroppen är svårt. Senaste utvecklingen i mönstrad belysning tekniker möjliggör separat excitation av huvud eller svans-uttryckta mikrobiella opsins med separat belysning och upptäckt av GCaMP/mCherry fluorescens mellankroppen48,49. Som ett resultat, kan det vara möjligt att övervinna problemet med hjälp av optogenetic metoder.

Jämförelser till andra certifikatutfärdare 2 + Imaging metoder:

Denna metod fungerar mycket bra för att registrera ändringar i cytoplasmiska Ca2 + från enkelrum, löst celler och deras synaptiska regioner. Realtid, volymetrisk avbildning av nervceller i huvudet har nyligen uppnåtts med placeringen av cellkärnor för cell identifiering och att kvantifiera förändringar i nucleoplasmic kalcium50,51,52. Förhållandet mellan kärnvapen och synaptic Ca2 + oklar. Våra data tyder mest iögonfallande förändringar i HSN intracellulära Ca2 + uppstå på presynaptiska termini från den cell soma (figur 4 d). De presynaptiska termini i HSN och VC nervceller är inbäddade i den postsynaptiska vulval muskler26. Det är inte klart om det skulle finnas tillräcklig upplösning i dimensionen Z även med spinning disk eller ljus plåt tekniker att tillskriva presynaptiska Ca2 + signaler till specifika celler utan förlitar sig på något sätt på somatiska kalcium för cell identifiering . Med metoder som beskrivs här, varje 10 min, två-kanals inspelning med 12,001 256 x 256 pixel 16-bitars TIFF-bilder är ~ 4 GB. Förhållandet förhållandet och intensitet modulerade kanaler dubbla filstorleken till ~ 8 GB. En typisk experiment inspelning 10 djur från var och en av två genotyper (vildtyp och experimentell) genererar nästan 150 GB av primärdata och kräver 20 h att samla in och analysera. Volymetriska analyser med 10 Z skivor per tidpunkt skulle kräva en storleksordning mer data och analytisk tid, förklarar varför så få sådana studier har avslutats.

Hårdvara:

Vi registrera och analysera bildsekvenser på dubbla processorer arbetsstationer med hög prestanda (t.ex. spel) grafikkort, 64 GB RAM, och högpresterande SSD-enheter (se Tabell för material). Data ska lagras på nätverksanslutna redundant array av oberoende diskar (RAID) och säkerhetskopieras till molnet i en off-site datacenter.

Vi rekommenderar att använda high-power parallell lysdioder för pulsade fluorescens excitation över metallhalogenlampor eller kvicksilverbaserade ljuskällor. Det finns flera kommersiellt tillgängliga flerfärgade LED system. Medan vissa av dessa LED system har en högre initial kostnad, kan de har en lång livslängd (> 20.000 h), samtidigt hetsas fyra eller fler olika fluorophores och erbjuda exakt temporal kontroll använder serial eller TTL gränssnitt med låg latens (10-300 µs växla tid). Utlöser säkerställer att provet tänds endast när data samlas in faktiskt. Vi använder vanligtvis en 10 ms exponering varje 50 ms (20% tullsats). Detta minskar fototoxicitet och rörelseoskärpa under Bildinsamling, som tidigare rapporterats43.

Vi använder sCMOS kameror för sin hastighet och stort utbud av små, känsliga pixlar. En EM-CCD-kamera är ett dyrare alternativ, men 'Blom' effekter kan resultera i tagna photoelectrons spilla i närliggande pixlar. Nya back-belysta sCMOS kameror har liknande ljuskänslighet av EM-CCD: er till en betydligt lägre kostnad. Oavsett måste vilken sensor används, GCaMP5 och mCherry kanaler erhållas samtidigt. Sekventiell fånga flytta maskar kommer att leda till dåligt registrerade bilder olämpliga för proportionerlig kvantifieringsmetoden. Dubbla kanaler imaging kan åstadkommas på en enda kamera efter uppdelning av kanaler med hjälp av en bild-splitter (figur 2) eller två identiska kameror. Det dynamiska omfånget av 16-bitars bilder rekommenderas över 8-bitars bilder för korrekt proportionerlig kvantifieringsmetoden. För brightfield bilder av masken beteende fånga vi använder en 1 tum 4.1 MP infrarött USB3 kamera för att fånga stora 2 x 2 binned 1 024 x 1 024 8-bitars bildsekvenser efter JPEG-komprimering. Större FOV finns på nyare Mikroskop modeller tillåter en vuxen mask till visualiseras på 20 x efter 0.63 x demagnification med endast liten vinjettering (figur 4E).

Vi rekommenderar att du använder standard TTL spänningssignaler för att synkronisera belysning och frame capture. På grund av potentiella latenser i olika program rekommenderar vi att användare konfigurera kamerans fluorescens med trigger-utgångar som master med TTL utgångar köra alla andra enheter. På detta sätt samlas brightfield och scenen positionsinformationen för varje Ca2 + mätning.

Slit- eller resonant punkt-scanning confocal Mikroskop normalt återfinns i delade confocal faciliteter också ge utmärkt prestanda under proportionerlig Ca2 + imaging. Sådana instrument kan användas för att fånga två eller fler fluorescens kanaler tillsammans med brightfield24. I det här fallet confocal pinhole bör öppnas till dess maximal diameter och en spektral detektor bör användas till separat GCaMP5, mCherry och IR brightfield signaler. Detta maximerar ljus samling från en tjock (~ 20 µm) skiva samtidigt tillåta förkastande av out-of-fokus fluorescens. En nackdel är mindre FOV och mer restriktioner för anpassning av maskinvara och programvara.

Programvara:

De flesta tillverkare levererar och installerar deras kameror och Mikroskop med egenutvecklade programvara, inklusive konfiguration av utlösande ingångar och utgångar. Funktioner och utförandet av denna programvara under inspelning kan variera. Eftersom snabbrörliga maskar kan vara svårt för att spåra, image display under inspelning måste vara smidig och stabil vid 20 Hz. För att förbättra prestanda, kan bildsekvenser tillfälligt sparas i RAM med behaviorally relevanta undergrupper Sparad i slutet av experimentet. Dessa två-kanals bild sekvens filer kan konverteras till öppen bild flödescytometri standardformat (.ics) för import till den proportionerlig kvantitering programvaran. OME-TIFF är en nyare öppen källkod image format, även om olika installationer går inte att spara TIFF bildsekvenser större än 4 GB.

En nyckelfunktion i rörledningen kvantitering är generation av baserat på kanalen och sedan en opartisk bild segmentering proceduren med mCherry fluorescens för att hitta celler av intresse. Från varje Funna objekt, objektstorlek, XY centroiden position och minimum, menar, och maximal fluorescens intensitetsvärden för varje kanal (inklusive kanalen baserat) beräknas. Tillsammans, används dessa värden för att kvantifiera förändringar i intracellulära Ca2 + vid varje tidpunkt i inspelningen. Objektet mätningar för varje tidpunkt exporteras sedan som a.csv fil för senare analyser.

En stor begränsning av protokollet som beskrivs här är beroendet på flytta data i olika former genom ett lapptäcke av programvaruprodukter. En ytterligare irritation är att några av programvaran är öppen källkod och gratis medan andra är stängda, dyra och ojämnt uppdaterad. En stor förbättring skulle vara att använda eller utveckla en bit av programvara (helst öppen källkod) som ger liknande nivåer av prestanda och välbefinnande-av-använda från förvärv till analys. Som nämnts ovan, fördubblar proportionerlig analys både filstorlek och tid som krävs för att slutföra ett experiment. Generering av kamera drivrutiner som kan integreras i användaranpassningsbara ramar som Bonsai skulle tillåta bilder och andra dataströmmar samlas in och analyseras i realtid, avsevärt förbättra genomströmning.

Framtidsutsikter:

Medan vi spårar normalt mask rörelser manuellt, bör spårning av den masken centroiden upptäcks i infrarött ljus - eller mörk-fältinspelningar möjliggöra ytterligare bildbehandling noder som ger slutna justering av scenen ställning och automatiserad spårning (figur 3 och data som inte visas). Majoriteten av fluorescens inspelningarna erhålls med denna metod är mörk och saknar biologiskt intressanta data. På-sensor eller i realtid efter förvärvet bildbehandling tekniker som Beskär bildsekvenser till relevanta objekt skulle möjliggöra ökad rumslig upplösning och påskynda data analys rörledningen, särskilt om ytterligare Z-slices samlas in för varje tidpunkt för att visualisera aktivitet inom alla pre- och postsynaptiska celler i kretsen.

Disclosures

Författarna förklarar att det finns inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades genom ett bidrag från NINDS till KMC (R01 NS086932). LMN stöddes av ett bidrag från programmet NIGMS IMSD (R25 GM076419). Stammar som används i denna studie C. elegans genetik Center, som är finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi tackar James Baker och Mason Klein för bra diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).

Tags

Neurovetenskap fråga 132 Caenorhabditis elegans kalcium beteende fluorescens imaging Ca2 + reportrar
Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig <em>Caenorhabditis Elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock… More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter