Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

doi: 10.3791/56911 Published: February 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

Abstract

זה הפך ליותר ויותר ברורה כי פעילות מעגל עצבי בחיות מתנהגות שונה באופן מהותי מן לראות בבעלי חיים מרדימים או קיבוע. כתבים פלורסנט רגישה מאוד, מקודדים גנטית של Ca2 + מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית שימוש בגישות אופטי לא פולשנית בבעלי חיים להתנהג. בשילוב עם גנטי, טכניקות optogenetic, את המנגנונים המולקולריים זה לווסת את פעילות התא ואת מעגל במהלך הברית ניתן לזהות התנהגות שונה.

כאן נתאר שיטות רציומטרי Ca2 + הדמיה של נוירונים יחיד ב להתנהג בחופשיות Caenorhabditis elegans תולעים. נדגים שיטה הרכבה פשוטה בעדינות שכבות-על תולעים גוברת על אגר רגיל של מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM) לחסום עם coverslip זכוכית, יאפשר לבעלי אפשרות להקליט ברזולוציה גבוהה במהלך תנועה בלתי מוגבלת והתנהגות. בטכניקה זו, אנו משתמשים רגיש Ca2 + לכתב GCaMP5 להקליט את שינויים תאיים Ca2 + בנוירונים תכולה דו-מיניים ספציפיים (HSNs) בה הם נוהגים ההתנהגות להטלת ביצים. בהבעת שיתוף mCherry, Ca2 +-חלבון פלואורסצנטי חסר רגישות, נוכל לאתר את המיקום של HSN בתוך ~ 1 מיקרומטר ונכונה עבור תנודות פלורסצנטיות נגרם על ידי שינויים במוקד או תנועה. הדמיה brightfield בו זמנית, אינפרא אדום מאפשר התנהגות הקלטה ומעקב בבעלי חיים באמצעות שלב ממונע. על ידי שילוב של זרמי נתונים וטכניקות מיקרוסקופית אלו, אפשר להקליט Ca2 + פעילות במעגל להטלת ביצים C. elegans תוך כדי התקדמות בין מצבי התנהגות לא פעיל ופעיל מעל עשרות דקות.

Introduction

מטרה מרכזית של מדעי המוח היא להבין איך נוירונים לתקשר מעגלים להתנהגות בעלי חיים נסיעה. המעגלים העצביים לשלב מגוון רמזים חושית מגוונת כדי לשנות פעילות מעגל, ובכך נהיגה שינויים התנהגותיים הכרחי עבור בעלי חיים להשיב את הסביבות שלהם. תולעים נימיות, C. elegans, יש מערכת עצבים פשוטה עם נוירונים 302 קשרים סינפטיים אשר היה ממופה לחלוטין1. בנוסף, גנים אשר קידוד חלבונים המעורבים עצבית גבוהה נשמרים בין C. elegans , יונקים2. למרות הפשטות האנטומי של מערכת העצבים שלו, הוא מציג רפרטואר מורכב מאופני שנשמרת מתן פלטפורמה פורה להבין איך נוירונים לווסת את ההתנהגות3.

C. elegans הוא נוטה היישום של מגוון רחב של גישות כמו מניפולציה גנטית, אבלציה לייזר תא, שיטות אלקטרופיזיולוגיות, וכן אין ויוו אופטי הדמיה4,5. מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו מפות מפורטות של נוירוטרנסמיטר מרכזי איתות מערכות C. elegans כולל שימוש של רשתות עצביים GABAergic. מחקרים אלה, יחד עם לימודי מתמשך כדי למפות את הביטוי של כל עצביים G-חלבון בשילוב קולטנים למקם את מודל זה במיקום ייחודי כדי למנף את מבנה מאוד מפורט ומפות קישוריות עצביים תפקודית כדי להבין באופן מלא כיצד אלה אותות עצביים שונים דרך רצפטורים שונים, צירי זמן נסיעה בהיבטים שונים של התנהגות בעלי חיים.

ללימוד דפוסי הפעילות העצבית דינמי בכל מערכת, תנאי חיוני הוא לפתח מתודולוגיות חזקים כדי להקליט את פעילות נוירונים בודדים או מעגלים כולו במהלך התנהגויות. חשוב במיוחד amenability גישות כאלה אופטי להמחיש פעילות presynaptic שמניע שלפוחית סינפטית פיוז'ן. כתבים פלורסנט רגישה מאוד ומהירה של תאיים Ca2 +, יחד עם הזמינות הגוברת של רסיברים צילום רגיש, מהפכה את ההקלטה של התא, בפעילות הסינפטית בבעלי חיים ערה, חיה במהלך התנהגות. כי תוצאה העיקריים של הפעילות החשמלית סינפטית היא להסדיר Ca2 + ערוצים, שינויים ב- Ca תאיים2 + נחשבים בנאמנות השינויים הרלוונטיים בהתנהגותו ח בפעילות התא.

במחקר זה, אנו מציגים גישה לביצוע רציומטרי Ca2 + הדמיה בתכולה HSN מוטורי לגלוקוז לקדם התנהגות להטלת ביצים ב- C. elegans6,7. גישה זו מתבסס על הניסיונות להציג באופן חזותי Ca2 + פעילות C . elegans, המעגל להטלת ביצים במהלך התנהגות5,8,9,10,11 . השיטה מאפשרת לתאם בו זמנית את שינויי בפעילות התא/מעגל עם אירועים להטלת ביצים, וכן שינויים במצב גינקולוגיות בעלי חיים. למרות אנו משתמשים בגישה זו ללמוד פעילות תולעים בוגרות, עבודה שלא פורסמה מן המעבדה שלנו מציג שגישה זו ניתן להאריך לבעלי ילדותי הרביעית (L4) הזחל גם כן. סביר כי הפעילות של נוירונים אחרים- C. elegans לתפקד בתוך מעגלים נפרדים והתנהגויות צריך להיות נגיש באופן דומה עם טכניקה זו. השני פותח לאחרונה מהיר Ca2 + מחוונים עם שאינם חופפים ספקטרום הפליטה12,13,14,15,16, כלים optogenetic17 , ואת גנטית מקודד אופטי סממנים של מתח הממברנה18, אמור לאפשר לנו לבצע חקירות 'כל-אופטיים' חודר איך שינויים בפעילות מעגל עצבי נוהג הברית התנהגות ברורים.

Protocol

1. זנים, תרבות בתקשורת, ואני הולכת וגוברת של בעלי חיים

  1. לגדול בתולעים המוטנטיות ב 20 מעלות צלזיוס על תקן 60 מ מ בינוני צמיחה תולעים נימיות (NGM) אגר צלחות עם מזון חיידקי e. coli . OP5019.
  2. להתכונן פלסמידים 2 כל יזם תא ספציפי של עניין: אחד, נהיגה הביטוי של GCaMP5 כדי להקליט תאיים Ca2 +, ואת השני, נהיגה הביטוי של mCherry כדי לאפשר רציומטרי כימות של שינויים זריחה GCaMP5 ו לפשט את מציאת האובייקט ומדידה.
    הערה: מתקן הדמיה רציומטרי GCaMP5:mCherry על תנודות GCaMP5 זריחה הנובעים מביצוע שינויים בתנועה המוקד של בעלי חיים, שינויים לא בפועל ב Ca תאיים2 +.
  3. מזריקים GCaMP5 - ו mCherry-ביטוי פלסמידים יחד עם פלסמיד סמן הצלה גלויה pL15EK לתוך הגונדות של LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X חיות מוטציה ולשחזר חיות lin-15(+) הלא-Muv לבטא GCaMP5 ו mCherry מ- high-עותק transgene20,21,22. השתמש ברקע מוטציה לייט-1 אור כחול הימנעות התנהגות23,24.
  4. שלב transgenes כדי כרומוזומים כדי להפחית פסיפס ולפשט את הדור של זנים מוטציה מתחם25.
    הערה: המתח LX2004 המתוארים כאן נושא transgene גבוהה-העתק של משולב, המבטאת GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 (ראה טבלה של חומרים)26,27, 28 , 29. האמרגן nlp-3 נמצא ביטוי חזק כונן HSNs של L4 מאוחר ובעלי למבוגרים ללא גרימת פגמים משמעותיים HSN פיתוח או התנהגות להטלת ביצים, בהשוואה היזמים האחרים שנבדקו (e.g.,tph-1. egl-6ו- unc-86). זן זה ואחרים לבטא GCaMP5 ו- mCherry הגחוני כבל (VC) מוטורי לגלוקוז, שרירי vulval, וכן תאים נוירואנדוקריניים uv1 הינם זמינים מן המרכז גנטיקה Caenorhabditis , הפרטים של הבנייה שלהם תוארו 27.
  5. החל OP50 חיידקי מזון מן צלחת אגר NGM הזריעה לתחתית של תולעת פלטינה לבחור, ולהשתמש בו כדי להעביר ~ 20 חיות L4 LX2004 מאוחר לבטא GCaMP5 ו- mCherry, HSNs של האמרגן nlp-3 . ודא כי הפות המתפתח מופיע ב- stereomicroscope כמו כתם כהות מוקף סהר לבן. דגירה חיות ב- 20 ° C עבור h 24-40.
  6. לאחר הדגירה, להחיל את OP50 על האיסוף והעברת ~ 3 של התולעים על צלחת NGM unseeded, להשאיר כמות קטנה של אוכל. מאחורי לתולעים להאכיל על במהלך דימות. להבטיח מספיק אוכל, מזון חיידקי מעט מדי תעודד את התולעים להתרחק ממרכז הצלחת בזמן יותר מדי אוכל להגדיל את רקע זריחה ולגרום היפוקסיה.
  7. להשתמש במרית שטוחה מעוגלים כדי לחתוך ~ 20 מ מ x 20 מ מ צ'אנק מהצלחת נושאת את התולעים ולהעביר את צ'אנק, פנים כלפי מטה במרכז coverslip נקי 24 מ"מ x 60 מ"מ #1.5 (איור 1). הפעל את היישום מצד אחד למנוע בועות להיות לכודה תחת coverslip ו מתערב עם הדמיה. החל coverslip של 22 מ"מ x 22 מ"מ #1 לחלק העליון של גוש כדי להפחית דבק ואת אידוי.

2. החומרה וההתקנה אינסטרומנטציה

  1. מקם את בשלבים, תולעים הטרנסגניים לבמה של מיקרוסקופ הפוך עם ≥ 0.7 מספרי הצמצם תוכנית-עדשה אפוכרומטית 20 x אובייקטיבי, ממונע XY הבמה לשליטה באמצעות ג'ויסטיק, מפצל תמונה ו קרינה פלואורסצנטית מסננים עבור GCaMP5 בו זמנית, mCherry עירור פליטה, מצלמות brightfield קרינה פלואורסצנטית ואינפרא הדמיה, מערכת תאורה דיודות פולטות אור (LED) triggerable (איור 2א).
    הערה: 80/20 קרן-ספליטר שולח 80% של האות תמונות עם המצלמה פלורסצנטיות ו-20% על המצלמה brightfield. ניתן להשתמש במיקרוסקופ זקוף, אך גוש NGM צריך להיות ממוקם בין זכוכית את coverslip גדול במקרה זה.
    1. השתמש עיניות המשקפת את לבחירת תולעת עבור הדמיה. כשבוחרים חיה, להחליק את מסנן האינפרא-אדום במקום מעל מעבה.
  2. טרנזיסטור-טרנזיסטור לוגיקה (TTL) מפעילים
    1. לחבר כבלים קואקסיאליים מכל שלושת TTL ההדק פלט הקווים על המצלמה זריחה. לחבר את הפלט הראשון לקלט BNC #3 של מערכת תאורה LED.
    2. התחבר הפלט השני למתאם 'בננה' BNC עם ירוק, חום חוטים מהמחבר GPIO 8 פינים רץ GPIO קלט #3 (pin 4) ואת הקרקע (pin 5) של מצלמה אינפרא-אדום, בהתאמה.
    3. הפלט השלישי מתאם BNC 'בננה' עם מגשר חוטים רץ לכניסה דיגיטלי #8 על הקרקע במכשיר רכישה דיגיטלית (איור 2B).
  3. המכשיר רכישת דיגיטלי (DAQ)
    1. חבר מועצת המנהלים של מיקרו-בקר DAQ (ראה טבלה של חומרים) למחשב באמצעות כבל USB. לעדכן את הקושחה עם תקן Firmata פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) ולהגדיר את יציאת ה-USB כדי לתקשר-57600 באוד.
  4. נוריות
    1. להפעיל את התוכנה LED בקר (ראה טבלה של חומרים). לעבור את מפעיל מצב של 'רציף ועד 'מגודרת' בחר גורם מפעיל ערוץ ' 3' עבור שניהם 470 ו 590 nm נוריות.
    2. הפעל והזן LED כוח עבור כל LED (למשל, סט 470 ננומטר LED 20%, ה-LED nm 590 ל-40%).
  5. הפעל את קובץ ה-script 'XY-שלב-גמר' בונסאי (ראה טבלה של חומרים) תקשורת טורית-שלב30. לחץ על הצומת 'CsvWriter' אפור ובחר תיקיה לשמור שנרשמו X ו- Y שלב מידע (איור 3). הקש על החץ הירוק בסרגל הכלים כדי לאתחל את DAQ.
    הערה: קובץ ה-script יתחיל להקליט את מיקום הבמה X ו- Y כאשר המצלמה פלורסצנטיות שולח אות TTL. קובץ script זה פלטי ארבע עמודות של נתונים: מסגרת מספר, X עמדה (מיקרומטר), מיקום Y (מיקרומטר) ו את מרווח הזמן בין מסגרות (s).
  6. מצלמה אינפרא אדום הקלטה תוכנה (ראה טבלה של חומרים) תחת "מצבי וידאו מותאם אישית," בחר "מצב 1" (2 x 2 binning; 1,024 x 1,024 פיקסלים), ואת "פיקסל בפורמט Raw 8". תחת ' המפעיל / Strobe', הגדר את ההדק קו הקלט (GPIO) 3, קוטביות 'גבוהה', 'מצב' "14". לעבור 'אפשר' תפסיק מסגרת רכישה עד קבלת אות ההדק TTL.
    1. עוזב את החלון פתוח, לחץ על הכפתור האדום "שיא" בסרגל הכלים תצוגת המצלמה הראשית. בחר את התיקיה עבור רצפי תמונות להינצל. בחר 'Buffered' הקלטה במצב ושמור 'תמונות' בתבנית JPEG. לחץ על "התחל הקלטה" לאתחל את הרכישה.
  7. מפצל מצלמה ותמונה קרינה פלואורסצנטית
    הערה: GCaMP5 וערוצי זריחה mCherry יש לאסוף בו זמנית כדי להבטיח תמונה נכונה ההרשמה רציומטרי כימות. הפיצול התמונה מאפשר רכישת שני ערוצים של זריחה GCaMP5 ו- mCherry על גבי חיישן אחד.
    1. בכרטיסיה 'ללכוד' של התוכנה רכישת התמונה (ראה טבלה של חומרים), זמן החשיפה set כדי 10 ms, binning 4 x ולאחר עומק תמונה 16 סיביות. בחר subarray של המצלמה ממורכז של 512 פיקסלים לרוחב על 256 פיקסלים גבוהה. לחצו על 'הצג פלט להפעיל אפשרויות' וקבעו כל המפעילים כדי 'חיובית'.
      הערה: DAQ יכול מדי פעם לפספס גורמים מפעילים TTL אם הם 10 ms או פחות.
    2. ודא 'המפעיל 1' ו- 'המפעיל 2' הם 'חשיפה' ואילו 'מפעיל 3' מוגדר כ- 'לתכנות' עם 'תקופה' של גב' 25 תחת הכרטיסייה 'רצף', בחר 'זמן לשגות' עם 'Delay1 שדה' של 50 מילישניות לאסוף תמונות ב- 20 הרץ. בחר באפשרות 'שמור למאגר זמני.'
  8. PMT לקבל, לייזר בעוצמה במהלך דימות קונאפוקלית ערוץ 3
    1. הגדר את רווח PMT כך הרקע הוא ברמה ממש מעל המינימום (רמת השחור). להגדיל את עוצמת הלייזר (ירוק) nm 561 עד פיקסל 12 סיביות או 16 סיביות רווי בודד נצפית התחנה הסופית presynaptic בערוץ mCherry.
    2. להתאים 488 ננומטר לייזר (כחול) עוצמת כך GCaMP5 הוא גלוי רק בקצהו presynaptic מעל הרקע. הגדרה נמוכה זו מונעת את הרוויה של הפיקסלים GCaMP5 כאשר קרינה פלואורסצנטית שמגביר בתגובה חזקה Ca2 + תופעות מעבר. פתח את חריר קונאפוקלית כל הדרך כדי למקסם ללכוד אור.

3. רציומטרי Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגות

  1. תחת לשונית 'רצף' בתוכנה רכישה פלורסצנטיות, לחץ על "התחל" כדי להתחיל את ההקלטה. מסלול התולעת עם הג ' ויסטיק, שומר את תא (ים) ואת הסינפסות עניין בפוקוס ועל במרכז שדה הראייה (FOV). לחץ על לחצן 'סטטיסטיקה' בחלון היסטוגרמה להראות פיקסל סטטיסטיקה של כל ערוץ.
  2. להתאים את הכוח LED כדי להבטיח פלורסצנטיות מרבי mCherry פיקסל בודד-התחנה הסופית presynaptic של ≥ 8,000 סעיפים (~ 4,000 photoelectrons), נתינה ~ 12 סיביות טווח דינמי מעל הרקע (~ 100 photoelectrons). אותות GCaMP5 התחנה הסופית presynaptic במהלך מנוחה Ca (נמוך)2 + צריך להיות סביב ~ נחשב 2,500 - רק בחציו רקע.
  3. להקליט עד למצב פעיל להטלת ביצים אחד; זה מתרחש בדרך כלל כל 20-30 דקות ב- פראי-סוג תולעת7. שמור ערכת משנה 10 דקות (מסגרות 12,001), מסגרות 6,000 לפני ואחרי להטלת ביצים האירוע הראשון (מסגרת 6,001). הקפד לשמור את המשנה זהה של brightfield תמונות של תולעת ההתנהגות ואת timepoints של XY הבמה עמדה, או הסינכרון מדויק של זרמי נתונים יאבדו.
  4. השתמש ImageJ את התוסף BioFormats (ראה טבלה של חומרים) כדי להמיר רצפי תמונות בפורמט תמונה Cytometry רגיל (.ics) כך זה ניתן לייבא לתוך התוכנה רציומטרי כימות.

4. התמונה פילוח וניתוח כמותי

  1. רצפי תמונות לייבא התוכנה כימות רציומטרי (ראה טבלה של חומרים). לחץ על 'ניגוד אוטומטי' בתפריט 'כלים', והתאם את החדות של כל אחד מערוצי להקים שחור המתאים (~ 1,800) ולבן רמות (10,000). בחר 'שינוי הצבעים...' בתפריט כלים כדי לוודא ש- mCherry ו GCaMP5 ערוץ הקצאות צבעים הם הנכונים (איור 4א - ג).
    1. לחץ לחיצה ימנית על סדרת הזמן בכרטיסיה 'רצף' ולהגדיר אותו 20 מסגרות/s ו- 1.25 מיקרומטר לפיקסל.
  2. בחר 'יחס' בתפריט 'כלים' ובחרו "GCaMP5" עבור "ערוץ A" ו- "mCherry" עבור 'ערוץ B'. לחץ על "חשב" ליד 'סף' כדי לחסר את הרקע של כל רצף תמונות. בחר "החל קשת LUT לערוץ יחס".
    הערה: לצורך הקלטה עם יחס אכזרי בסיסית של 0.3 (נמוך Ca2 +), יחס מקסימום של 2-3 (גבוהה Ca2 +), טבלת בדיקת מידע מתאים יהיה בין 0 (כחול) 1 (אדום).
  3. ליצור ערוץ עוצמת מאופנן יחס באמצעות תעלת mCherry (איור 4D). ערוץ עוצמת מאופנן יחס היא תמונה מיליונים-של-צבעים שבו הצבע יחס ממופה על הבהירות של הערוץ mCherry.
  4. תחת לשונית 'המידות', ליצור פרוטוקול למציאת אובייקט על-ידי גרירת הכלי 'למצוא אובייקטים באמצעות עוצמת' לחלונית 'פרוטוקול'. לחץ על 'קוג' כדי להגדיר החלון של mCherry ערכי העוצמה ולמצוא את האובייקטים.
    1. בחר בעוצמה ערכים ≥ 2 סטיות תקן (SD) מעל הרקע (למשל, הגבול התחתון של ~ 2,500, הגבול העליון של 65,535). ודא הסופית presynaptic מזוהה זה 'באופן אוטומטי עדכון משוב' נבחרה בתפריט מדידות.
      הערה: התוכנה יכולה גם לזהות עצמים לפי סטיית תקן שלהם רקע באמצעות פרוטוקול קשורים 'עוצמת SD.' עם זאת, אם אובייקט בהיר במיוחד נכנסת של FOV, זה יכול באופן דרמטי עוצמת רשע במהלך שינוי timepoints האלה, המשפיעים על המכנסונים עוצמת נהגה למצוא את HSN. ההשתנות לא יתרחש אם ערכי העוצמה raw משמשים כדי למצוא חפצים.
  5. להוסיף מסננים נוספים מיקוד רק בערוץ mCherry (גודל, עוצמה מקס, וכו ') במידת הצורך לא לכלול אובייקטים לא רצויים כמו ראש, זנב, בטן זריחה. בחרו 'לבצע מדידה פריט' מתפריט מדידות ובחרו 'Timepoints כל.'
    הערה: זה תתבצע הפרוטוקול, לכתוב כל המדידות קובץ ערך מופרד באמצעות פסיק (. csv) לייצא באמצעות הפקודה 'ייצוא' מתפריט ' קובץ '.
  6. פתח קובץ exported.csv והעתק Timepoint, אזור (2מיקרומטר), אומר (יחס ערוץ), Centroid X (מיקרומטר) ונתונים Centroid Y (מיקרומטר) לתוך גיליון חדש. ייצוא קובץ a.csv ללא כותרות עמודה. התוכנה רציומטרי כימות עשוי לסווג תא עניין בתור אובייקט אחד או יותר לכל timepoint.
    1. כדי נגרם אובייקטים אלה, השתמש סקריפט מותאם אישית 'AnalzyeGCaMP_2017.m'.
      הערה: קובץ ה-script גם מזהה Ca2 + (יחס) פסגות בנתונים, ושומר a.csv קובץ של timepoints שלהם, amplitudes שיא שיא רוחבי. זה גם מייצר קובצי postscript עקבות יחס raw, המבואר. בעזרת מידע זה, Ca2 + ארעי משרעת ומרווח בין-ארעי צריך להיקבע.
  7. הוסף פלט X וערכי Y centroid מכל אובייקט זריחה על הערכים X ו- Y הוקלט על ידי סקריפט XY-שלב של בונסאי. השתמש המיקום XY נטו כדי ליצור עקבות ומכניקה תולעת לחשב הזחה תא והמהירות המלוות התנהגות שונה הברית31.
  8. לייבא את התמונות מוקלט brightfield ImageJ כמו ערימה וירטואלי. הוספת ביאורים אירועים להטלת ביצים, התנהגויות אחרות. להשוות את התזמון של אירועים אלה Ca2 + פסגות מהעקבות יחס.

Representative Results

הטכניקה פשוטה הרכבה המתוארים כאן (איור 1) גורם שינויים מינימאליים לסביבה תרבות של L4 ו למבוגרים C. elegans תוך מתן אפשרות ברזולוציה גבוהה הקלטה מתנהג חיות דרך coverslip זכוכית (איור 4). סינכרון של מקורות אור LED, בקרי הבמה חשיפות המצלמה מאפשר עבור רכישת נתונים של מספר זרמים-מסגרות לשנייה 20 עד כדי 1 ח' ביניים ההגדלה (20 x) עם מטרות מפתח נומרי גבוהה (0.7-0.8) מספק טוב רזולוציה מרחבית של האזור סינפטית המעגל ההתנהגות להטלת ביצים, אפילו עם 4 x 4 פיקסל binning (מיקרומטר 1.25 לפיקסל). רכישת סימולטני של אותות זריחה GCaMP5 ו- mCherry (איור 4A, B) משמש להפקת ערוץ יחס על ידי פיקסל פיקסל שמפצה על שינויים בבעלי חיים תנועה ונוחות (איור 4D). התחנה הסופית presynaptic של HSN הוא כל כך גדולים כמו גופים תאים עצביים רבים C. elegans, ושינויים HSN Ca presynaptic2 + ניתן בבירור לאבחן. FOV גדול של המצלמה brightfield אינפרא-אדום מאפשר את התולעת לבצע אחריהם מעקב באופן ידני במהלך ההקלטה (איור 4E). עבור כל בעל חיים, שינויים ב- Ca תאיים2 + ישויך עם התנהגויות ניכר הדמיה brightfield כולל שחרור הביצית ושינויים גפיים (איור 4E).

כימות של HSN Ca2 + ומהירות מאשר כי תולעים שינוי ומכניקה שלהם במעבר להתנהגות להטלת ביצים... ישנם הבדלים משמעותיים במהירות תולעת לפני, במהלך, ואחרי המצב הפעיל להטלת ביצים (איור 5א). זה לא נגרם עקב רעש הגלום ההדמיה או מערכת המעקב. התקרבות לתוך האירוע להטלת ביצים, נתבונן חזק בשינוי GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית (ΔF/F) לפני האירוע להטלת ביצים, בעוד mCherry הוא יחסית ללא שינוי (איור 5B). שינויים נמדד ביחס GCaMP5:mCherry (ΔR/R) מראים בבירור של HSN Ca2 + ארעי ~ 4 s לפני שחרור הביצית (איור 5B). חופפת התכווצות שרירים vulval, מאט נקי תולעת ומכניקה של מתרחשת כי מסתיים עם ביצה לשחרר. תוצאות קודמות הראו כי שימוש VC הנוירונים מנוע, אשר הם innervated על ידי HSNs, להראות פעילות שיא במהלך התכווצות שרירים חזקים vulval ובמהלך ביצה שחרור 8,10,27. אנחנו גם הראו כי optogenetic ההפעלה של הנוירונים VC כוננים של האטה מיידית של גפיים, רומז כי הנוירונים VC עשוי להיות מופעל על ידי התכווצות שרירים vulval, ובכך מאט גפיים עד קבלת משוב של שחרור הביצית27 .

ההדמיה, תיאר מערכת המעקב מאפשר הדמיה של הארגון המרחבי של ההתנהגות להטלת ביצים (איור 5C). כאמור מוצג, תולעים הזן ריצות מתמשכת של גפיים קדימה רק לפני למצב פעיל32. תולעים מבלים את רוב זמנם שיחור מזון על חיידקים במרכז גוש אגר. לפני הכניסה למצב פעיל, תולעים להרחיק המזון, אשר חופפת המראה של HSN Ca נדירים2 + תופעות מעבר. פעילות HSN המעברים ואז ירי פרץ, עם מספר צפופים HSN Ca2 + תופעות מעבר זה לקיים אירועים להטלת ביצים לתוך. התולעים אז לעיתים קרובות תסתובב לחדש ומכניקה קדימה, מטילים את ביציהם על הדרך חזרה לכיוון נקודת ההתחלה שלהם ליד החיידק OP50. אנחנו יכולים להניח כי שינויים O מקומית2 ו/או ריכוז CO2 עשויה להיות השפעה על איפה התולעים להחליט להטיל ביצים33,34.

Figure 1
איור 1. C. elegans הרכבה טכניקת דימות ברזולוציה של מעגל פעילות והתנהגות בעלי להטלת ביצים. העליון, ההר האחרון מן הצד. התחתון, ההר הסופי כפי שהוצג דרך קרקעית coverslip גדול. חיצים מציינים OP50 חיידקי מזון, בתולעים המוטנטיות וביצים, דחוקה בין גוש אגר NGM את coverslip גדול 24 מ"מ x 60 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . Widefield רציומטרי Ca2 + הדמיה והתנהגות הקלטה במיקרוסקופ epifluorescence הפוך. (א) תולעת עמדה והתנהגות לכידת brightfield ויה 20 x (0.8 NA) מטרת התוכנית-עדשה אפוכרומטית באמצעות אור אינפרא-אדום (750-790 ננומטר) (חצים סגולים) הנפלטים מנורת הלוגן דרך גוש NGM. ג'ויסטיק והבמה ממונע בקר משמש כדי לשמור על התולעת בתוך שדה הראייה במהלך ההקלטה. מיקום הבמה (Δx, Δy) נשלחת למחשב על-ידי היציאה הטורית. חלבונים GCaMP5 ו- mCherry לידי ביטוי התולעת מתרגשים באמצעות 470 nm (חיצים כחולים) ו 590 nm (חיצים צהובים) דיודות פולטות אור (LED). הנפלטים GCaMP5 (ירוק חצים) mCherry (חיצים כתומים) זריחה יחד עם אור אינפרא-אדום עובר דרך מראה ודיקרואיק זוהר הלהקה רב (ראה טבלה של חומרים). קרן-הפיצול 80/20 שולח 20% של האור דרך demagnifer 0.63 x עבור לכידה על מצלמת CMOS אינפרא אדום רגיש (חץ סגול). ה-80% הנותרים של האור נשלחת דרך היציאה-הצד של המיקרוסקופ מפצל תמונה שמפריד את GCaMP5, mCherry זריחה על נפרדות חצאים של מצלמת sCMOS בעת הסרת אור אינפרא-אדום brightfield. הנתונים של שתי המצלמות מועברים למחשב באמצעות כבלים, USB3. היציאות ההדק מן המצלמה sCMOS קרינה פלואורסצנטית (כחול) משמשים לשליחת + 5V TTL מפעיל מערכת תאורה LED, המצלמה CMOS אינפרא-אדום brightfield של המכשיר רכישה דיגיטלית (DAQ). טריגר (B) 3 פלט TTL אותות שזיהה את DAQ-pin דיגיטלי #8 ושלח למחשב באמצעות חיבור USB. אלה כניסות דיגיטליות לעורר ' איפה XY' הפקודה טורי של קובץ script תוכנה הבונסאי (XY-שלב-גמר) אשר קורא X ו- Y שלב מיקום עבור כל תמונה זריחה/אינפרא-אדום GCaMP5/mCherry בשבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : פריסה של התסריט תקשורת טורית-שלב בונסאי XY-שלב-גמר- העליון צומת DigitalInput (ורוד) קורא מפעילים TTL מגיע לתוך ה-pin #8 של DAQ. עבור כל חיובי TTL מתח (ירוק), DAQ גורם חותמת זמן (כחול) וכותב מחרוזת 'איפה XY?' (ורוד) הבקר השלב דרך היציאה הטורית (אפור). הצומת SerialStringRead (ורוד) קורא ש-x ו- Y לתאם התגובה של הבקר הבמה. מחרוזת זו הוא מומר מיקרון ואז הפרדתו X ו- Y שלב קואורדינטות. לבסוף נחלים ארבע אלה משולבים באמצעות הצומת zip (כחול), קובץ column.csv 4 כתוב: ספירת מסגרת TTL האותות המתקבלים (צומת טווח, ורוד) את הקואורדינטות X ו- Y, את המרווח בין timepoints עוקבות (בדרך כלל ~ 50 מילישניות כאשר הקלטה ב 20 הרץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : Micrographs הנציגה של HSN פלורסצנטיות, brightfield כל חיה במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. (AD) הדמיה רציומטרי בו זמנית של זריחה GCaMP5 ו- mCherry, HSNs רק לפני שחרור הביצית. טרמיני presynaptic HSN מסומנים עם ראשי חץ. קרינה פלואורסצנטית מיזוג של GCaMP5 ו- mCherry (ג). (ד) GCaMP5:mCherry מאופנן בעוצמה יחס; יחס גבוה (אדום) ציון גבוה תאיים Ca2 + התחנה הסופית presynaptic. (E) Brightfield תמונה של התולעת כולו רק אחרי הביצים שכבתי. ראשי חץ מציינים את החצאים anterior ואת אחורי של הפות שממנו הביצים מוטלות. סולם בר לכל התמונות הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : הקלטה של מהירות2 + וגפיים HSN Ca במהלך ההתנהגות להטלת ביצים. רשמים (A) מהשינויים יחס GCaMP5:mCherry בתגובה תאיים Ca2 + תופעות מעבר (ΔR/R; אדום) יחד עם מהירות תולעת מיידי (מיקרומטר/s; כחול). אירועי כנס מסומנים באמצעות ראשי חץ. (B) עקבות של קרינה פלואורסצנטית HSN GCaMP5 (green; ΔF/F), זריחה mCherry (אדום; ΔF/F), יחס זריחה GCaMP5:mCherry (שחור; ΔR/R) ותולעת מהירות (כחול) סביב ברגע של שחרור הביצית. (ג) הארגון המרחבי של כנס והתנהגויות ומכניקה במהלך ההקלטה כל 10 דקות. המסלול תולעת הושג מן המידע הבמה XY אשר נוספה למיקום centroid HSN המתקבל ההקלטה זריחה mCherry. העיתוי של HSN שנחשולי (עיגולים אדומים), אירועים להטלת ביצים (חץ שחור), ולא את ההתחלה והסוף של ההקלטה (יהלומים ירוק וכחול) מסומנים. סולם בר הוא 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Transgenes:

משום mCherry ביטוי שופרה דרך הכניסה codon-אופטימיזציה ואינטרון (ויש עיתונאים GCaMP הזמינה ביותר לא), להזריק ~ 4 x כמות פלסמיד מביע GCaMP5 כדי להבטיח רמות דומות של זריחה GCaMP5 במהלך Ca חזק 2 + תופעות מעבר. חילוץ של המוטציה lin-15(n765ts) מאפשר התאוששות נתיישב של חיות הטרנסגניים עם תופעות מינימליות להטלת ביצים ואת שאר התנהגויות35. Transgenes צריך להיות משולב כדי להבטיח תנאים בין בעלי חיים שונים25ביטוי אחיד והדמיה. סמני לבחירה כולל עמידות לאנטיביוטיקה36,37 והצלה של lethals הרגיש38 צריך גם לעבוד, אלא, משום שאינם הטרנסגניים בעלי חיים מתים, אישור של אינטגרציה transgene ו homozygosity קשה יותר בהשוואה סמני שמציגים של פנוטיפ גלוי25. סמנים דומיננטי לשבש ומכניקה נורמלי ולא להקטין כושר, כגון rol-6(dm), צריך להיות נמנעה39. הדמיה לייט-1 רקע מוטציה חיוני כדי להפחית את הבריחה אור כחול תגובות במהלך23,הדמיה40,41. מוטציה נוספת של גור-3, הפועל במקביל ל- lite-1, אפשר להוסיף ולצמצם את התנהגות שיורית ושינויים פיזיולוגיים הנגרמת על ידי אור כחול42. בנוחות, גור-3 lite-1, לין-15 כולם ממוקמים על החצי נכון של כרומוזום X, אשר צריך לפשט הבנייה של זנים חדשים עבור Ca2 + הדמיה וניסויים optogenetic.

מכיוון פעמים חשיפה קצרה תמונות נאספים ב 20 הרץ, GCaMP5, mCherry אותות חייב להיות בהיר. ההסבר הסביר ביותר עבור Ca רועש2 + הקלטות הוא עמום פלורסצנטיות הנגרמת על ידי ביטוי עיתונאי חלש. היזמים צריכים להיות גם סביר ספציפי עבור האזור להיות עם תמונה. בגלל HSN תא ובגוף הסינפסות על השרירים vulval במרכז הגוף, ביטוי נוסף מ האמרגן nlp-3 בראש וזנב בדרך כלל בחוץ שדה הראיה, יכול ייכללו שימוש במסננים נוספים ב- תוכנה רציומטרי כימות. כדי להבטיח כי נצפו שינויים GCaMP5 קרינה פלואורסצנטית כתוצאה משינויים בפועל Ca תאיים2 +, transgenes שליטה לבטא GFP במקום GCaMP5 כדאי להיערך באופן עצמאי וניתח26. Ca2 + כתבים חדשים עם שונה Ca2 + רגישויות, קינטיקה וצבעים הרחיבו את הבחירה של הדמיה כלים זמינים, אך כל הכתב החדש לאמת באמצעות Ca2 +-variant פלורסנט רגישות14 ,16.

מדיה:

NGM לוחות עבור הדמיה צריך להיות מוכן עם אגר באיכות גבוהה. אגר באיכות נמוכה לא יימס לחלוטין על autoclaving, עוזב את פיזור האור במהלך דימות, והגברת רקע זריחה חלקיקים קטנים. ביולוגיה מולקולרית כיתה agarose יכול לשמש במקום, אבל צריך להיות מופחת הסכום הוסיף כדי לשמור על צלחת המקביל מוצקות.

השוואות לשיטות אחרות הרכבה:

גישות הקודם תמונת פעילות המעגל ההתנהגות להטלת ביצים השתמשו תולעים עם הדבק אל רכיב pad agarose. מרותק למיטה. תחת תנאים אלה, פעילות מעגל ההתנהגות להטלת ביצים אינה המועדף ללא ירידה תרבות המדיה osmolarity8,10,44,45. ממצאים אחרונים מעידים כי מספר התנהגויות תולעת הם מווסת על ידי המדינה גפיים, העלאת שאלות על מערכת היחסים של פעילות התאים שנצפה בחיות קיבוע כי ראיתי בחיות מתנהגות באופן חופשי. אנחנו הראו לאחרונה כי פעילות מעגל להטלת ביצים באופן בלתי צפוי בהדרגה עם גפיים26,27. באופן דומה, ממודר Ca2 + איתות ב interneuron ריאה משלבת פעילות נוירונים סנסוריים, ראש מוטורי לגלוקוז במהלך שיחור מזון בתנועות46. התנהגות מפיסורה מלווה גם שינוי מדויק, סטריאוטיפית ומכניקה המאפשר לבעלי תעבור מקומם הרעיה לפני סילוק פסולת47. יחד, תוצאות אלה מראים כי הקלטות קצרה של מעגל הפעילות מחיות קיבוע עשוי להיות שונה בתכלית מכל אלה בשנת בחיות מתנהגות באופן חופשי.

למרות היותו ישירות מתחת coverslip, ההתנהגות של התולעת דומה אליו לראות את לוחות NGM סטנדרטי. ביצים הניח תמשיך לבקוע, ומאפשר כמות קטנה של אוכל להפקיד את הזחלים L1 לגדול לתוך מבוגרים (נתונים לא מוצג). גודל גוש גדול אגר מאפשר חילוף הגזים סבירה, המתנגד התייבשות, למרות יותר מדי אוכל יגדל רקע זריחה. אמנם שיטה זו פועלת הטוב ביותר עבור מבוגרים, הטכניקה גם ניתן לבעלי L4 התמונה. עם זאת, עובי השכבה המימית בין גוש של coverslip הוא כזה זחלים קטנים יותר יש קושי זוחל, יכול לעיתים קרובות להילכד בעקבות של מבוגר נע.

מגבלה של טכניקה זו הרכבה הוא כימי מכניים או גירוי ישיר לאזורים מדויקים של הגוף הוא קשה. התפתחויות בטכניקות תאורה בדוגמת מאפשרים את עירור נפרד של הראש או הביע את הזנב opsins חיידקים עם תאורה נפרדים וזיהוי של GCaMP/mCherry זריחה ב- the midbody48,49. כתוצאה מכך, ייתכן שתהיה אפשרות להתגבר על בעיה זו באמצעות גישות optogenetic.

השוואות ל Ca אחרים 2 + הדמיה גישות:

שיטה זו עובדת היטב עבור הקלטה שינויים cytoplasmic Ca2 + של יחיד, נפתרה תאים ואזורים הסינפטית שלהם. הדמיה בזמן אמת, נפח של נוירונים בראש לאחרונה הושגה באמצעות המיקום של גרעין התא עבור זיהוי תא, quantitate לשינויים סידן nucleoplasmic50,51,52. היחסים בין גרעינית, סינפטית Ca2 + עדיין לא ברור. הנתונים שלנו להציע שהשינויים הבולטים HSN תאיים Ca2 + מתרחשים טרמיני presynaptic הרחק סומה תא (איור 4D). טרמיני presynaptic של HSN, הנוירונים VC מוטבעות postsynaptic שרירי vulval26. לא ברור אם יהיו מספיק רזולוציה בממד Z אפילו עם ספינינג דיסק או טכניקות אור גיליון לייחס presynaptic Ca2 + אותות תאים ספציפיים מבלי להסתמך בצורה כלשהי על סידן סומאטית לזיהוי תא . תוך שימוש בטכניקות המתוארות כאן, כל 10 דקות, שני ערוצים הקלטה עם 12,001 256 x 256 פיקסלים 16 סיביות TIFF תמונות ~ 4 ג'יגה-בתים. היחס מאופנן יחס ועוצמה ערוצי כפול גודל הקובץ כדי ~ 8 ג'יגה-בתים. ניסוי טיפוסי הקלטה 10 חיות מכל שני אחרים (פראי-סוג, ניסיוני) יוצר כמעט 150 ג'יגה-בתים של נתונים עיקריים ודורשת 20 h לאסוף ולנתח. ניתוחים volumetric עם 10 פרוסות Z לכל timepoint ידרוש בסדר גודל יותר נתונים וזמן אנליטית, שמסביר למה כל כך מעט מחקרים כאלה הושלמו.

חומרה:

אנחנו לתעד ולנתח רצפי תמונות בתחנות מעבד כפול עם ביצועים גבוהים וכרטיסים גרפיים (למשל, המשחקים), 64 ג'יגה-בתים של זיכרון RAM, וכונני solid-state ביצועים גבוהים (ראה טבלה של חומרים). הנתונים צריכים להיות המאוחסנים ברשת מערך יתיר של דיסקים עצמאיים (RAID), גיבוי לענן-מרכז נתונים מחוץ לאתר.

אנו ממליצים על שימוש ובעוצמת ממוקדת נוריות עבור עירור קרינה פלואורסצנטית פעמו halide ממתכת או מבוסס כספית מקורות אור. מספר מערכות LED צבע רב זמינים מסחרית זמינים. בעוד כמה מהמערכות הללו LED יש עלות גבוהה יותר מראש, הם חיים ארוך (> 20,000 h), יכולים בו זמנית לרגש ארבעה או יותר fluorophores שונים, ולהציע שליטה טמפורלית מדויקת באמצעות סדרתי ו/או TTL ממשק עם השהיה נמוכה (10-300 µs לעבור זמן). מפעילה מבטיחה כי המדגם מואר רק כאשר נתונים למעשה הנאספות. אנו משתמשים בדרך כלל חשיפה של 10 ms כל 50 מילישניות (20% שיעור חובה). זה מפחית phototoxicity, טשטוש תנועה במהלך לכידת תמונה, כפי שדווחה בעבר43.

אנו משתמשים sCMOS מצלמות מהירות, מערך גדול של פיקסלים קטנים, רגיש. מצלמה EM-CCD הוא חלופה יותר יקר, אבל אפקטים 'לפרוח' יכול לגרום photoelectrons שנתפסו לשפוך לתוך פיקסלים סמוכים. מצלמות sCMOS בחזרה מואר חדשות יש רגישות דומה של EM-CCDs במחיר מוזל משמעותית. בלי קשר חיישן אשר משמש, הערוצים GCaMP5 ו- mCherry יש להשיג בו זמנית. לכידת רציפים במעבר תולעים תוביל לתמונות לקוי רשום מתאים רציומטרי כימות. ערוץ כפול הדמיה יכול להתבצע לתוך מצלמה אחת לאחר פיצול של ערוצים באמצעות הפיצול של התמונה (איור 2) או באמצעות שתי מצלמות זהים. הטווח הדינמי של 16 סיביות תמונות מומלץ על רקע תמונות של 8 סיביות עבור כימות מדויק רציומטרי. לתמונות brightfield של אופן פעולה של תולעת, תופסים בעזרת מצלמה USB3 in 1. 4.1-סגול MP כדי ללכוד גדולים 2 x 2 רצפי תמונות 8 סיביות 1,024 x 1,024 נשברתי לאחר דחיסת JPEG. FOV גדול יותר זמין על הדגמים המיקרוסקופ מאפשר של התולעת הבוגרת ניתן לאבחן ב- 20 x לאחר 0.63 x demagnification עם רק קלה פינות כהות (איור 4E).

אנו ממליצים להשתמש אותות מתח אורך חיים רגיל כדי לסנכרן תאורה ו לכידת מסגרת. בגלל השהיות פוטנציאליים בתוכנות שונות, מומלץ למשתמשים להגדיר המצלמה פלורסצנטיות עם ההדק פלטי כמאסטר עם תפוקות TTL נהיגה כל ההתקנים האחרים. בדרך זו, brightfield ומידע מיקום הבמה ייאספו למדידה כל2 + Ca.

שסע - או תהודה לסריקת נקודת קונאפוקלית מיקרוסקופים נמצאו בדרך כלל מתקנים קונאפוקלית משותפים גם לתת ביצועים מצוינים במהלך רציומטרי Ca2 + הדמיה. כלי כזה יכול לשמש כדי ללכוד שניים או יותר קרינה פלואורסצנטית ערוצים יחד עם brightfield24. במקרה זה, חריר קונאפוקלית אמור להיפתח כדי הקוטר המרבי שלה, גלאי ספקטרלי אמור לשמש כדי להפריד בין GCaMP5 mCherry, אותות אינפרא-אדום brightfield. זה הגדלת אוסף אור מ עבה (~ 20 מיקרומטר) פרוסה תוך מתן אפשרות דחייה של out-of-להתמקד זריחה. אחת החיסרון הוא של FOV קטנים יותר, מגבלות נוספות עבור התאמה אישית חומרה ותוכנה.

תוכנה:

רוב היצרנים הספינה ולהתקין מצלמות ומיקרוסקופים שלהם בתוכנה קניינית, כולל תצורת מפעילה כניסות ויציאות. התכונות והביצועים של תוכנה זו במהלך ההקלטה יכול להשתנות. כי עובר מהר תולעים עשויה להיות מאתגרת כדי לעקוב אחר, תמונה תצוגה במהלך ההקלטה צריך להיות חלקה ויציבה ב 20 הרץ. כדי לשפר את הביצועים, רצפי תמונות ניתן באופן זמני לשמור בזיכרון RAM עם קבוצות משנה בהתנהגותו הרלוונטיים הצילה בסוף הניסוי. קבצים אלה רצף תמונות בשני ערוצים ניתן להמיר לתבנית תמונה Cytometry הסטנדרטית פתוחה (.ics) עבור ייבוא לתוך התוכנה רציומטרי כימות. הביתה-TIFF הוא פורמט פתוח תמונה עדכנית יותר, למרות התקנות שונות עשויים להיות מסוגל להציל את רצפי תמונות TIFF גדול מ- 4 ג'יגה-בתים.

תכונה מרכזית של הצינור כימות הוא הדור של הערוץ יחס ולאחר מכן שגרת פילוח מוטים התמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית mCherry כדי למצוא תאים עניין. מכל אובייקט מצאה, את גודל אובייקט העמדה centroid XY, המינימום, כלומר, מחושבים ערכי העוצמה פלורסצנטיות המרבי לכל ערוץ (כולל את הערוץ יחס). יחד, ערכים אלה משמשים quantitate שינויים תאיים Ca2 + על כל timepoint בהקלטה. מידות האובייקט עבור כל timepoint ואז מיוצא כקובץ a.csv עבור ניתוחים שלאחר מכן.

מגבלה משמעותית של הפרוטוקול המתואר כאן הוא התלות העברת הנתונים בצורות שונות באמצעות טלאים של מוצרי תוכנה. גירוי נוסף הוא חלק של התוכנה הוא פתוח, חינם בזמן שאחרות סגורות, יקרה ומתעדכן לצר. שיפור משמעותי יהיה להשתמש או לפתח חתיכה אחת של התוכנה (אידיאלי פתוח) המספק רמות דומות של ביצועים, נוחות השימוש משלב הרכישה לניתוח. כפי שצוין לעיל, ניתוח רציומטרי מכפילה את גודל הקובץ ואת משך הזמן הנדרש להשלמת ניסוי. דור של מנהלי התקנים המצלמה בה ניתן לשלב להתאמה אישית משתמש במסגרות כמו בונסאי יאפשר אחרים זרמי נתונים שנאספו, ניתח ותמונות בתפוקה בזמן אמת, שיפור משמעותי.

לעתיד להתרחש:

בזמן שאנחנו בדרך כלל לעקוב אחר תנועות תולעת באופן ידני, מעקב אחר centroid התולעת זוהתה בהקלטות אינפרא-אדום בהיר או כהה-שדה אמור לאפשר לעיבוד צמתים מספקים לולאה סגורה ההתאמה של מיקום הבמה, אוטומטית תמונה נוספת מעקב (איור 3 ונתונים לא מוצג). רוב ההקלטות פלורסצנטיות שהושג עם שיטה זו היא האפל ונטול ביולוגית מעניין נתונים. טכניקות חיתוך רצפי תמונות לאובייקטים הרלוונטיים עיבוד תמונה שלאחר הרכישה על-חיישן או בזמן אמת לאפשר רזולוציה מרחבית מוגברת, לזרז את הצינור ניתוח נתונים, במיוחד אם Z-פרוסות נוספים נאספים עבור כל אחד timepoint להמחיש פעילות בתוך כל התאים מראש ולא postsynaptic במעגל.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי מענק מ NINDS KMC (R01 NS086932). LMN נתמך על ידי מענק של התוכנית NIGMS IMSD (R25 GM076419). זנים השתמשו במחקר זה C. elegans מרכז הגנטיקה, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים ג'יימס בייקר, מייסון קליין על דיונים מועילים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).
סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג <em>Caenorhabditis Elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter