Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ratiometric kalsium avbilding av individuelle Neurons i oppfører seg Caenorhabditis Elegans

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/56911
Automatic Translation
*1, *1,2, *2, *2, 2, 1,2
1Neuroscience Program, University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology, University of Miami
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver bruk av genetisk kodet Ca2 + journalister til å registrere endringer i nevrale aktivitet i oppfører seg Caenorhabditis elegans ormer.

Abstract

Det har blitt stadig klarere at nevrale krets aktivitet i oppføre dyr er vesentlig forskjellig fra sett i bedøvet eller immobilisert dyr. Høyt sensitiv, genetisk kodet fluorescerende journalister av Ca2 + har revolusjonert opptak av cellen og synaptic aktivitet ved hjelp av ikke-invasiv optisk tilnærminger i oppfører dyr. Kombinert med genetisk og optogenetic teknikker, molekylære mekanismer som modulerer cellen og krets under ulik virkemåte stater kan identifiseres.

Her beskriver vi metoder for ratiometric Ca2 + bildebehandling av enkelt nerveceller i fritt oppfører seg Caenorhabditis elegans ormer. Vi viser en enkel montering teknikk som forsiktig overlegg ormer vokser på en standard Rundormer vekst medier (NGM) agar blokkere med et glass dekkglassvæske, tillater dyr skal registreres på høy oppløsning ubegrenset bevegelse og oppførsel. Med denne teknikken bruker vi følsom Ca2 + reporteren GCaMP5 for å registrere endringer i intracellulær Ca2 + i serotonergic Hermafroditt bestemt nervecellene (HSNs) som de kjører egg-legging atferd. Av co uttrykke mCherry, en Ca2 +-ufølsom fluorescerende protein, vi kan spore plasseringen av HSN innen ~ 1 µm og korrekt for svingninger i fluorescens skyldes endringer i fokus eller bevegelse. Samtidig, infrarøde brightfield imaging gir atferd opptak og dyr sporing ved hjelp av en motorisert scene. Ved å integrere disse mikroskopiske teknikker og datastrømmer, kan vi spille Ca2 + aktivitet i C. elegans egg-legging krets som det utvikler seg mellom inaktiv og aktiv over titalls minutter.

Introduction

Nevrovitenskap sentrale mål er å forstå hvordan neurons kommuniserer i kretser å kjøre dyr oppførsel. Nevrale kretser integrere en rekke ulike sensoriske stikkordene for å endre krets aktivitet, og dermed kjører atferdsendringer nødvendig for dyr å svare til sine omgivelser. Nematode, C. elegans, har en enkel nervesystemet med 302 neurons med synaptic tilkoblingen har vært helt tilordnet1. I tillegg er gener som kode for proteiner involvert i neurotransmission svært bevart mellom C. elegans og pattedyr2. Til tross for anatomiske enkelheten i sin nervesystemet vises et kompleks repertoar av bevarte gir en fruktbar plattform for å forstå hvordan neurons regulere atferd3.

C. elegans er mottakelig for anvendelsen av en rekke tilnærminger som genetisk manipulasjon, laser celle ablasjon, elektrofysiologiske teknikker, samt i vivo optisk tenkelig4,5. Nyere studier har produsert detaljerte kart over den store nevrotransmitteren signalering systemer i C. elegans inkludert den cholinergic og GABAergic nevrale nettverk. Disse studiene, sammen med pågående studier tilordne uttrykk for alle neuronal G-protein kombinert reseptorer plassere denne modellen i en unik posisjon til å utnytte svært detaljerte strukturelle og funksjonelle neuronal tilkobling kart å fullt ut forstå hvordan disse forskjellige nevrotransmittere signalet gjennom ulike reseptorer og tidsrammer kjøretur ulike aspekter av dyr oppførsel.

For å studere dynamisk neuronal aktivitet mønstre i ethvert system, er en viktig forutsetning å utvikle robust metoder for å registrere aktiviteten i individuelle neurons eller hele kretser under atferd. Spesielt viktig er amenability av disse optiske å visualisere presynaptic aktivitet som driver synaptic vesicle fusion. Rask og svært følsom fluorescerende journalister av intracellulær Ca2 +, sammen med den økende tilgjengeligheten av sensitive photodetectors, har revolusjonert innspillingen av cellen og synaptic aktivitet i våken, levende dyr under virkemåte. Fordi en stor utfallet av synaptic elektrisk aktivitet er å regulere Ca2 + kanaler, er endringer i intracellulær Ca2 + antatt å trofast rapporten behaviorally relevante endringer i celle aktivitet.

I denne studien presenterer vi en tilnærming for å utføre ratiometric Ca2 + bildebehandling i serotonergic HSN motor neurons som fremmer egg-legging atferd i C. elegans6,7. Dette bygger på tidligere innsats å visualisere Ca2 + aktivitet i C. elegans og egg-legging krets under virkemåte5,8,9,10,11 . Metoden kan samtidig relatere den observerte endringer i cellen/krets aktivitet med egg-legging hendelser, samt endringer i dyr locomotor tilstand. Selv om vi bruker denne tilnærmingen for å studere aktiviteten i voksen ormer, viser upublisert arbeid fra vårt laboratorium denne tilnærmingen kan utvides til juvenile dyr på fjerde (L4) larvestadiet også. Det er sannsynlig at aktiviteten til andre C. elegans neurons som fungerer i forskjellige kretser og atferd skal være tilsvarende tilgjengelig med denne teknikken. Andre nylig utviklet rask Ca2 + indikatorer med ikke-overlappende utslipp spectra12,13,14,15,16, optogenetic verktøy17 , og genetisk kodet optisk indikatorer membran spenning18, bør tillate oss å utføre gjennomtrengende 'alle-optiske' etterforskning hvordan endringer i nevrale krets aktivitet kjøre forskjellige atferd stater.

Protocol

1. stammer, kultur medier og montering av dyr

  1. Vokse C. elegans ormer ved 20 ° C på standard 60 mm Rundormer vekst Medium (NGM) agar plater seeded med OP50 E. coli bakteriell mat19.
  2. Forberede to plasmider hver celle-spesifikke formidler av interesse: en, kjører uttrykk for GCaMP5 til posten intracellulær Ca2 +, og den andre, kjører uttrykk for mCherry å tillate ratiometric kvantifisering av GCaMP5 fluorescens endringer og forenkle objekt finne og måling.
    Merk: GCaMP5:mCherry ratiometric imaging korrigerer for svingninger i GCaMP5 fluorescens som følge av endringer i fokus og dyr bevegelse, ikke faktiske endringer i intracellulær Ca2 +.
  3. Injisere GCaMP5 - og mCherry-uttrykker plasmider sammen med pL15EK synlige redning markør plasmider i gonader LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X mutant dyr og gjenopprette ikke-Muv lin-15(+) dyr uttrykke GCaMP5 og mCherry fra en høy-kopi transgene20,21,22. Bruk lite-1 mutant bakgrunnen blå lys unngåelse atferd23,24.
  4. Integrere effekter av transgener til kromosomene å redusere mosaicism og forenkle generering av sammensatte mutant stammer25.
    Merk: LX2004 belastningen beskrevet her bærer en integrert høy-kopi transgene som uttrykker GCaMP5 og mCherry i HSNs fra arrangøren av nlp-3 (se Tabell for materiale)26,27, 28 , 29. arrangøren av nlp-3 ble funnet å kjøre sterkt uttrykk i HSNs sent L4 og voksen dyr uten forårsaker betydelige mangler i HSN utvikling eller egg-legging atferd sammenlignet med andre arrangører testet (e.g.,tph-1, EGL-6, og unc-86). Denne belastningen og andre som uttrykker GCaMP5 og mCherry i ventrale ledningen (VC) motor neurons, vulval muskler og uv1 neuroendocrine celler er tilgjengelig fra Caenorhabditis genetikk Center og detaljer om sin konstruksjon har blitt beskrevet 27.
  5. Bruke OP50 bakteriell mat fra en seeded NGM agar plate til bunnen av en platina orm plukke og bruke den til å overføre ~ 20 sent L4 LX2004 dyr som uttrykker GCaMP5 og mCherry i HSNs fra nlp-3 Promotøren. Sikre at utviklingsland vulva vises i en stereomicroscope som en helt mørkt sted omgitt av en hvit halvmåne. Inkuber dyr ved 20 ° C i 24-40 h.
  6. Etter inkubasjon, gjelder OP50 hakke og overføre ~ 3 av ormer en unseeded NGM platen, slik at en liten mengde mat bak for ormer på overmodne under bildebehandling. Sikre tilstrekkelig mat, som for lite bakteriell mat vil oppmuntre ormer å vandre fra midten av platen selv for mye mat vil øke bakgrunnen fluorescens og føre hypoksi.
  7. Bruke en flat avrundet slikkepott til å kutte en ~ 20 x 20 mm blings fra platen med ormer og overføre delen ned på midten av en ren 24 x 60 mm #1.5 dekkglassvæske (figur 1). Start programmet fra en side å holde bobler fra å bli fanget under dekkglassvæske og forstyrrende med bildebehandling. Bruke en 22 x 22 mm #1 dekkglassvæske på toppen av delen å redusere stikkende og fordampning.

2. maskinvare og instrumentering oppsett

  1. Plasser iscenesatte, transgene ormer på scenen av en invertert mikroskop med en ≥ 0,7 numeriske Aperture Plan-Apochromat 20 x objektiv, motorisert XY scenen kontrollert av en joystick, et bilde splitter og fluorescens filtre for samtidige GCaMP5 og mCherry eksitasjon og utslipp, kameraer for fluorescens og infrarød brightfield imaging, og et triggerable lys Emitting Diode (LED) belysning system (figur 2A).
    Merk: En 80/20 bjelke-splitter sender 80% av bildet signal til fluorescens kameraet og 20% brightfield kameraet. En oppreist mikroskop kan også brukes, men NGM delen bør plasseres et glass lysbilde og den store dekkglassvæske i dette tilfellet.
    1. Bruk kikkert okularene for å velge en orm for bildebehandling. Når et dyr er valgt, skyv infrarød filteret på plass over kondensatoren.
  2. Transistor-transistor logikk (TTL) utløsere
    1. Fest coaxial-kabler fra hver av de tre TTL utløse produksjon linjene på fluorescens kameraet. Koble første utdataene til BNC input #3 av LED belysning systemet.
    2. Koble andre utdataene til en BNC 'banan' adapter med grønne og brune ledninger fra 8-pin GPIO kontakten til GPIO input #3 (pin 4) og bakken (pin 5) av av infrarødt kamera, henholdsvis.
    3. Koble tredje utdataene til en BNC 'banan' adapter med genser ledninger som kjører til #8 inngangen og bakken i digital oppkjøpet enheten (figur 2B).
  3. Digital oppkjøpet enhet (DAQ)
    1. Koble DAQ microcontroller styret (se Tabell of Materials) til PCen via en USB-kabel. Oppdatere firmware med standard Firmata protokollen (se Tabell for materiale) og konfigurere USB porten til å kommunisere på 57600 baud.
  4. Lysdioder
    1. Kjøre den LED programvaren (se Tabell for materiale). Bytte utløse modus fra 'Kontinuerlig til 'Gated' og velg utløser kanal ' 3' for begge 470 og 590 nm lysdioder.
    2. Slå på og angi LED strøm for hver LED (f.eks sett i 470 nm LED 20% og 590 nm LED til 40%).
  5. Kjør føljetong-trinns kommunikasjon skript "XY-scenen-finalen" i Bonsai (se Tabell for materiale)30. Klikk på noden grå 'CsvWriter' og Velg mappe for lagring av innspilte X og Y scenen informasjon (Figur 3). Trykk grønn pilspissen i verktøylinjen for å initialisere DAQ.
    Merk: Vil skriptet starte innspillingen X og Y scenen posisjon når fluorescens kameraet sender en TTL-signal. Dette skriptet utganger fire kolonner med data: ramme tall, X-posisjon (µm), Y-posisjon (µm) og intervallet mellom rammer (s).
  6. I av infrarødt kamera opptaksprogramvaren (se Tabell for materiale) under "Egendefinert videomoduser," Velg "Modus 1" (2 x 2 binning, 1024 x 1024 piksler), og "Pixel Format Raw 8". Under ' utløser / Strobe', satt utløser inntastingslisten (GPIO) til "3", polariteten til "Høy", "Modus" til "14". Veksle 'Aktiverer' stoppe ramme oppkjøpet før en TTL utløser signalet er mottatt.
    1. Forlater det vinduet åpen, klikker du den røde "Record"-knappen på verktøylinjen for hovedkameraet. Velg mappen for bildesekvenser lagres. Velg 'Buffered' opptaksmodus, og lagre "Bilder" i JPEG-format. Klikk "Start registrering" for å initialisere oppkjøpet.
  7. Fluorescens kamera og bilde splitter
    Merk: GCaMP5 og mCherry fluorescens kanaler må samles samtidig for å sikre riktig image registrering for ratiometric kvantifisering. Et bilde splitter kan tokanals oppkjøp av GCaMP5 og mCherry fluorescens på en sensor.
    1. I kategorien 'Fange' image oppkjøpet programvare (se Tabell for materiale), angi eksponeringstid til 10 ms, binning 4 x, og bildedybde til 16-biters. Velg en midtstilt kameraet subarray 512 piksler bredt 256 piksler høy. Klikk "Vis utdata utløser alternativer" og angi alle utløsere "Positive".
      Merk: DAQ kan noen ganger savner TTL utløsere hvis de 10 ms eller mindre.
    2. Sikre at 'Utløser 1' og 'Utløser 2' er satt til "Eksponering" mens 'Utløser 3' er satt til "Programmerbar" med en "periode" av 25 ms. Under kategorien "Sequence", velger 'Tidsforløp' med en 'felt Delay1"på 50 ms samle bilder på 20 Hz. Velg 'lagre midlertidig Buffer."
  8. AVDRAG få og laser intensitet under tre kanal AC confocal imaging
    1. Angi avdrag forsterkningen så bakgrunn fluorescens er på et nivå bare over et minimum (svart nivå). Øke 561 nm (grønn) laser makt til en enkelt mettet 12- eller 16-biters piksel er observert på presynaptic terminus i mCherry kanalen.
    2. Juster 488 nm (blå) laser intensitet slik at GCaMP5 fluorescens vises bare på presynaptic terminus over bakgrunnen. Dette lav innstilling forhindrer metning av GCaMP5 piksler når fluorescensen øker i svaret å sterk Ca2 + transienter. Åpne AC confocal hullet helt å maksimere lett fange.

3. Ratiometric Ca2 + bildebehandling og atferd opptak

  1. Under kategorien "Sequence" i fluorescens oppkjøpet programvaren, klikker du "Start" for å starte innspillingen. Spore ormen med styrespaken, å holde cellene og synapser rundt i fokus og i midten av synsfelt (FOV). Klikk på 'Statistikk'-knappen i vinduet histogrammet for å vise pixel statistikk for hver kanal.
  2. Justere LED makt til å sikre et maksimalt én piksel mCherry fluorescens endestasjonen presynaptic til ≥ 8000 teller (~ 4000 photoelectrons), som gir en ~ 12-biters dynamikkområdet over bakgrunnen (~ 100 photoelectrons). GCaMP5 signaler på presynaptic terminus under hvile (lav) Ca2 + bør være rundt ~ 2500 teller - bare synlig over bakgrunnen.
  3. Inn til en egg-legging aktiv tilstand er nådd. Dette skjer vanligvis hver 20-30 minutter i en vill-type orm7. Lagre en 10-minutters delsett (12,001 rammer), 6000 bilder før og etter egg-legging (ramme 6,001). Oppbevar det samme delsettet av brightfield bilder av ormen atferd og timepoints av XY scenen posisjon og presis synkronisering av data strømmen går tapt.
  4. ImageJ og BioFormats plugin (se Tabell for materiale) konvertere bildesekvenser bilde cytometri Standard (.ics) format slik at det kan importeres til programmet Ratiometric kvantifisering.

4. image segmentering og kvantitativ analyse

  1. Importere bildesekvenser i programmet Ratiometric kvantifisering (se Tabell for materiale). Klikk 'Automatisk kontrast' i 'Verktøy'-menyen, og juster kontrasten av hver kanal å etablere riktig svart (~ 1800) og hvit nivåer (10.000). Velg "Endre farger..." i verktøymenyen for å bekrefte at mCherry og GCaMP5 kanal Fargetilordninger er riktig (Figur 4A - C).
    1. Høyreklikk på tidsserien i kategorien "Sequence" og 20 rammer/s og 1,25 µm/bildepunkt.
  2. Velg 'Forhold' på 'Verktøy'-menyen og velg "GCaMP5" for "Channel A" og "mCherry" for 'Channel B'. Klikk på "Beregn" ved 'Threshold' trekke bakgrunnen fra hver bildesekvens. Velg "Bruk en regnbue LUT på forholdet kanal".
    Merk: For en innspilling med betyr opprinnelig forholdet mellom 0,3 (lav Ca2 +) og en maks 2-3 (høy Ca2 +), en egnet oppslagstabell ville være fra 0 (blå) til 1 (rød).
  3. Generere en intensitet Modulated forholdet kanalen benytter mCherry kanalen (Figur 4D). Intensitet Modulated forholdet kanalen er en millioner av farger image der forholdet fargen er kartlagt på lysstyrken på mCherry kanalen.
  4. Under kategorien "Mål" opprette en objekt-finne protokoll ved å dra verktøyet "Finne objekter bruker intensitet" til ruten '-protokollen. Klikk 'cog"for å angi vinduet på mCherry intensitetsverdiene og finne objekter.
    1. Velg intensitet verdier ≥ 2 standardavvik (SD) over bakgrunnen (f.eks nedre grense for ~ 2500, øvre grense 65 535). Kontroller presynaptic terminus oppdages og som "automatisk oppdatering tilbakemelding" er valgt på menyen målinger.
      Merk: Programvaren kan også identifisere objekter ved deres standard avvik fra bakgrunn bruker en relaterte protokoll "SD intensitet." Hvis et spesielt lyst objekt inn FOV, kan det imidlertid dramatisk endre mener intensiteten under disse timepoints, påvirker intensitet konsentrasjon brukes til å finne HSN. Denne variasjonen vil ikke oppstå hvis rå intensitetsverdiene brukes til å finne objekter.
  5. Legge til flere filtre målretting bare mCherry kanalen (størrelse, Max intensitet, etc.) hvis det er nødvendig å ekskludere uønskede objekter som hodet, hale og gut fluorescens. Velg 'Gjøre målet element' mål-menyen og velg "Alle Timepoints."
    Merk: Dette vil utføre protokollen, skriver alle mål til en kommadelt (CSV)-fil som skal eksporteres ved hjelp av kommandoen «eksportere» i fil-menyen.
  6. Åpne exported.csv fil og kopiere Timepoint, området (µm2), mener (forholdet kanal), Centroid X (µm) og Centroid Y (µm) data i et nytt ark. Eksportfilen a.csv uten kolonneoverskrifter. Ratiometric kvantifisering programvaren kan klassifisere en celle rundt som ett eller flere objekter per timepoint.
    1. Sette sammen disse objektene, kan du bruke egendefinerte skript 'AnalzyeGCaMP_2017.m'.
      Merk: Skriptet også identifiserer Ca2 + (forholdet) toppene i dataene, og lagrer a.csv fil timepoints, topp amplitudes og topp bredder. Det genererer PostScript-filer for rå og kommenterte forholdet spor. Med denne informasjonen, bør Ca2 + forbigående amplitude og inter forbigående intervall fastsettes.
  7. Legge til utgang X og Y centroid verdier fra hvert fluorescens objekt X og Y-verdiene som er registrert av XY-trinns skriptet fra Bonsai. Bruk net XY posisjon til å generere en orm bevegelse sporing og beregne celle forskyvning og hastighet som følger med ulik virkemåte stater31.
  8. Importere innspilte brightfield bildene til ImageJ som en virtuell stack. Kommentere egg-legging hendelser og andre virkemåter. Sammenligne tidsberegningen av Ca2 + toppene fra forholdet sporingen.

Representative Results

Enkel montering teknikken beskrevet her (figur 1) forårsaker minimal endringer kultur miljøet i L4 og voksen C. elegans samtidig som høy oppløsning i oppføre dyr gjennom et glass dekkglassvæske (Figur 4). Synkronisering av LED-lyskilder, scenen kontrollere og kameraet eksponeringer muliggjør datainnsamling fra flere strømmer på 20 rammer/s for opp til 1 h. mellomliggende forstørrelse (20 x) med høy numeriske blenderåpning mål (0,7 til 0,8) gir god romlig oppløsning på synaptic regionen i egg-legging atferd krets, selv med 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/bildepunkt). Samtidige oppkjøp av GCaMP5 og mCherry fluorescens signaler (Figur 4A, B) brukes til å generere en piksel for piksel forholdet kanal som kompenserer for endringer i dyr bevegelse og fokus (Figur 4D). HSN presynaptic terminus er så stort som mange neuronal cellen legemer i C. elegans, og endringer i presynaptic HSN Ca2 + kan være tydelig visualisert. Den store FOV av infrarød brightfield kameraet tillater ormen spores manuelt under opptak (Figur 4E). For hvert dyr, kan endringer i intracellulær Ca2 + være korrelert med atferd tydelig i brightfield imaging inkludert egg utgivelse og endringer i bevegelse (Figur 4E).

Kvantifisering av HSN Ca2 + og fart bekrefter at ormer endre deres bevegelse når de går over til egg-legging oppførsel. Det er betydelige forskjeller i ormen hastighet før, under og etter egg-legging aktiv tilstand (figur 5et). Dette er ikke forårsaket av støy avbilding eller sporingssystem. Zoome inn en egg-legging hendelse, vi observerer en sterk endring i GCaMP5 fluorescens (ΔF/F) før hendelsen egg-legging mCherry fluorescens er relativt uendret (figur 5B). Målt endringer i GCaMP5:mCherry forholdet (ΔR/R) tydelig viser en HSN Ca2 + forbigående ~ 4 s før egg utgivelse (figur 5B). Samtidig med vulval muskel sammentrekning, en klar bremse av ormen bevegelse oppstår som ender med egg utgivelse. Tidligere resultater har vist at cholinergic VC motor neurons, som er innerveres av HSNs, viser toppen aktivitet under sterk vulval muskelsammentrekninger og under egg utgivelsen 8,10,27. Vi har også vist at optogenetic aktivering av VC neurons kjører en umiddelbar bremse av bevegelse, noe som tyder på at VC neurons kan aktiveres ved vulval muskel sammentrekning, bremse bevegelse til motta tilbakemelding av egg utgivelse27 .

Avbilding og sporingssystem beskrevet tillater visualisering av romlig organisering av egg-legging atferd (figur 5C). Som tidligere vist, ormer angi vedvarende kjøres frem bevegelse like før aktiveres32. Ormer tilbringer mesteparten av tiden beite på bakterier i sentrum av agar delen. Før innreise til aktiv tilstand flytte ormer fra maten, som er sammenfallende med utseendet på sjeldne HSN Ca2 + transienter. HSN aktivitet deretter overganger i briste skyting, med flere tett linjeavstand HSN Ca2 + transienter som opprettholde egg-legging hendelser. Ormer så ofte snu fortsette fremover bevegelse og legge egg på vei mot sin startposisjon nær OP50 bakterier. Vi antar at endringer i lokale O2 og/eller CO2 konsentrasjonen kan påvirke hvor ormer vil legge egg33,34.

Figure 1
Figur 1. C. elegans montering teknikk for høy-resolution tenkelig egg-legging krets aktivitet og oppførsel. Toppen, siste fjellet fra siden. Bunnen, siste fjellet som viste gjennom bunnen av den store dekkglassvæske. Pilene angir OP50 bakteriell mat, C. elegans ormer og egg, klemt mellom NGM agar delen og den store 24 x 60 mm dekkglassvæske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Widefield ratiometric Ca2 + bildebehandling og atferd opptak på en invertert epifluorescence mikroskop. (A) ormen posisjonen og virkemåten er fanget i brightfield via en 20 x (0,8 NA) Plan-Apochromat målet ved hjelp av infrarød (750-790 nm) lys (lilla piler) slippes ut fra en halogenlampe gjennom NGM delen. En joystick og motorisert scenen kontrolleren brukes til å vedlikeholde ormen i synsfeltet under opptak. Scenen posisjon (Δx, Δy) sendes til PC av den serielle porten. GCaMP5 og mCherry proteiner i ormen er glade med 470 nm (blå piler) og 590 nm (gule piler) lys lysemittrende dioder (LED). Slippes ut GCaMP5 (grønn pil) og mCherry (oransje piler) fluorescens sammen med infrarøde lyset passerer gjennom et multi bandet dichroic speil (se Tabell for materiale). En 80/20 bjelke-splitter sender 20% av lyset gjennom en 0.63 x demagnifer fangst på en infrarød-sensitive CMOS-kamera (lilla pil). De resterende 80% av lys sendes gjennom side-port av mikroskopet til et bilde splitter som skiller GCaMP5 og mCherry fluorescens på separate halvdelene av en sCMOS kameraet mens du fjerner infrarød brightfield lys. Data fra begge kameraene er overført til en PC via USB3 kabler. Utløse portene fra fluorescens sCMOS kameraet (blå) brukes til å sende + 5V TTL utløser LED belysning systemet, infrarøde brightfield CMOS kameraet og digitale Kjøp enhet (DAQ). (B) utløse 3 utgang TTL signaler oppdages av DAQ på digital pin #8 og sendt til PC via en USB-tilkobling. Disse digitale innganger utløse en ' der XY' serielle kommandoen fra Bonsai programvare skript (XY-scenen-finalen) som leser X- og Y scenen posisjon for hver GCaMP5/mCherry fluorescens/infrarød bildet tatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Oppsett av Bonsai føljetong-trinns kommunikasjon skriptet XY-scenen-finalen. De DigitalInput-noden (rosa) leser TTL utløsere kommer inn pin #8 av DAQ. For hver positiv TTL spenning (grønn), DAQ gjør et tidsstempel (blå) og skriver en "Der XY?" streng (rosa) til scenen kontrolleren via serieporten (grå). Noden SerialStringRead (rosa) leser X- og Y koordinere responsen fra scenen kontrolleren. Denne strengen deretter konverteres til mikron og adskilt av X og Y scenen koordinater. Til slutt, disse fire strømmer er kombinert med en zip node (blå) og en fire column.csv-fil er skrevet: ramme antall TTL signaler mottatt (utvalg node, rosa), X og Y koordinatene og intervallet mellom etterfølgende timepoints (vanligvis ~ 50 ms når opptak på 20 Hz). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representative micrographs HSN fluorescens og helt dyr brightfield under egg-legging atferd. (En-D) Samtidige ratiometric avbildning av GCaMP5 og mCherry fluorescens i HSNs like før egg utgivelse. HSN presynaptic termini angis med pilspisser. (C) flette av GCaMP5 og mCherry fluorescens. (D) intensitet-modulert GCaMP5:mCherry ratio; en høy ratio (rød) angir høy intracellulær Ca2 + på presynaptic terminus. (E) Brightfield bilde av hele etter egg har blitt lagt. Pilspisser angir fremre og bakre halvdelene av vulva som egg er lagt. Skala for alle bilder er 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Opptak av HSN Ca2 + og bevegelse hastighet under egg-legging atferd. (A) spor av GCaMP5:mCherry forholdet endringer i respons til intracellulær Ca2 + transienter (ΔR/R, rød) sammen med øyeblikkelig ormen fart (µm/s, blå). Egg-legging hendelser er angitt med pilspisser. (B) spor av HSN GCaMP5 fluorescens (grønn, ΔF/F), mCherry fluorescens (rød, ΔF/F), GCaMP5:mCherry fluorescens forholdet (svart, ΔR/R) og ormen fart (blå) rundt tidspunktet for egg utgivelse. (C) romlig organisering av egg-legging og bevegelse under hele 10 minutters innspillingen. Ormen sporet er Hentet fra XY scenen informasjonen ble lagt til centroid plasseringen av HSN fra mCherry fluorescens innspillingen. Tidspunktet for HSN transienter (røde sirkler), egg-legging hendelser (svart pilspisser) og starten og slutten av opptaket (grønn og blå diamanter) angis. Skala bar er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Effekter av transgener:

Fordi mCherry uttrykk er blitt bedre gjennom codon-optimalisering og intron innsetting (og mest tilgjengelige GCaMP journalister har ikke), injisere ~ 4 x antall GCaMP5-uttrykke plasmider å sikre sammenlignbare nivåer av GCaMP5 fluorescens under sterk Ca 2 + transienter. Redning av lin-15(n765ts) mutasjon gir lettvinte utvinning av transgene dyr med minimal effekt på egg-legging og andre virkemåter35. Effekter av transgener bør være integrert for å sikre ensartet uttrykk og imaging forhold mellom forskjellige dyr25. Valgbar indikatorer inkludert antibiotikaresistens36,37 og redning av temperatur-sensitive lethals38 burde også fungere, men, fordi ikke-transgene dyr er døde, bekreftelse av transgene integrering og homozygosity er vanskeligere forhold til markører som presenterer en synlig fenotypen25. Dominerende markører som forstyrrer vanlig bevegelse og redusere fitness, som rol-6(dm), skal unngås39. Bildebehandling i lite-1 er mutant bakgrunn avgjørende for å redusere blå lys rømme svar under tenkelig23,40,41. Ekstra mutasjon av gur-3, som fungerer parallelt med lite-1, kan ytterligere redusere gjenværende atferd og fysiologiske endringer forårsaket av blått lys42. Beleilig, gur-3, lite-1og lin-15 ligger i den høyre halvdelen av kromosom X, som skal forenkle bygging av nye stammer for Ca2 + bildebehandling og optogenetic eksperimenter.

Fordi eksponeringstider er kort og bilder er samlet på 20 Hz, må GCaMP5 og mCherry signaler være lyse. Den mest sannsynlige forklaringen støyende Ca2 + opptak er svak fluorescens forårsaket av svak reporter uttrykk. Arrangører bør også være rimelig spesifikke for regionen blir fotografert. HSN celle kroppen og synapser på vulval musklene ligger i sentrum av kroppen, flere uttrykk fra nlp-3 Promotøren i hodet og halen er vanligvis utenfor synsfeltet og kan utelukkes med andre filtre i den Ratiometric kvantifisering programvare. For å sikre at observert endringer i GCaMP5 fluorescens resultatet fra faktiske endringer i intracellulær Ca2 +, kontroll effekter av transgener uttrykke GFP i stedet for GCaMP5 bør være uavhengig forberedt og analysert26. Nyere Ca2 + journalister med forskjellige Ca2 + sensitiviteter kinetics og farger har utvidet valg av tenkelig verktøy, men hver ny reporteren skal valideres ved hjelp av Ca2 +-ufølsom fluorescerende variant14 ,16.

Media:

NGM plater for bildebehandling bør være forberedt med høy kvalitet agar. Lavere kvalitet agar vil ikke helt løses ved autoklavering, etterlot små partikler som scatter lys under imaging og øke bakgrunnen fluorescens. Molekylær biologi klasse agarose kan brukes i stedet, men hvor lagt skal reduseres for å opprettholde tilsvarende plate fasthet.

Sammenligninger til andre montering metoder:

Tidligere tilnærminger til bildet aktivitet i egg-legging atferd krets har brukt ormer immobilisert med lim til en agarose pad. Under disse forholdene, krets aktivitet og egg-legging atferd er ikke favorisert uten en reduksjon i kultur medier osmolaritet8,10,44,45. Nyere bevis antyder at flere ormen atferd er modulert av bevegelse, heve spørsmål om forholdet celle aktivitet i immobilisert dyr som sett i fritt oppføre dyr. Vi har nylig vist at egg-legging krets aktivitet uventet fases med bevegelse26,27. Tilsvarende integrerer compartmentalized Ca2 + signalering i RIA interneuron aktivitet fra sensoriske neurons og hodet motor neurons under foraging bevegelser46. Defecation atferd er også ledsaget av en presis og stereotype endring i bevegelse som gjør dyr til å bevege seg bort fra sin foraging plass før utviste avfall47. Sammen tyder disse resultatene på at kort opptak av krets aktivitet fra immobilisert dyr kan være fundamentalt forskjellig fra de innhentet i fritt oppføre dyr.

Til tross for direkte under en dekkglassvæske, ligner ormen atferd som sett på standard NGM plater. Lagt egg vil gå på å klekkes, og den lille mengden mat avsatt tillater L1 Larvene til vokser til voksne (data ikke vist). Den store agar samlede størrelsen gir rimelig gassutveksling og motstår dehydrering, selv for mye mat vil øke bakgrunnen fluorescens. Mens denne metoden fungerer best for voksne, kan teknikken også brukes til bildet L4 dyr. Tykkelsen på vandig laget mellom delen og dekkglassvæske er imidlertid slik at mindre Larvene har problemer med å gjennomgå, og kan ofte få innesperret i kjølvannet av en bevegelig voksen.

En begrensning av denne montering teknikken er at direkte mekanisk eller kjemikalie stimulering presise områder av kroppen er vanskelig. Siste utviklingen i mønstret belysning teknikker tillater separat magnetisering av hode eller hale-uttrykt mikrobiell opsins med egen belysning og oppdagelse av GCaMP/mCherry fluorescens i midbody48,49. Derfor kan det være mulig å overvinne problemet med optogenetic tilnærminger.

Sammenlignet med andre Ca 2 + Imaging tilnærminger:

Denne metoden fungerer veldig bra for registrering av endringer i cytoplasmatiske Ca2 + fra enkelt, løst celler og deres synaptic regioner. Real-time, volumetriske bildebehandling av nerveceller i hodet har nylig oppnådd med plasseringen av cellen kjerner for cellen identifikasjon og å quantitate endringer i nucleoplasmic kalsium50,51,52. Forholdet mellom kjernefysiske og synaptic Ca2 + er fortsatt uklart. Våre data tyder på de mest synlige endringene i HSN intracellulær Ca2 + forekommer presynaptic jernbanestasjonen termini fra cellen soma (Figur 4 d). De presynaptic termini på HSN og VC neurons er innebygd i postsynaptic vulval musklene26. Det er ikke klart om det ville være tilstrekkelig oppløsning for Z-dimensjonen selv med spinning disk eller lys ark teknikker å tilskrive presynaptic Ca2 + signaler til bestemte celler uten å stole på noen måte på somatiske kalsium for cellen identifikasjon . Ved hjelp av metodene beskrevet her, hver 10 min, tokanals opptak med 12,001 256 x 256 pixel for 16-biters TIFF-bilder er ~ 4 GB. Forholdet og intensitet modulert forholdet kanaler dobbel filstørrelsen til ~ 8 GB. En typisk eksperiment opptak 10 dyr fra hver av to genotyper (vill-type og eksperimentell) genererer nesten 150 GB primærdataene og krever 20 h å samle og analysere. Volumetric analyser med 10 Z skiver per timepoint ville kreve en størrelsesorden mer data og analytisk tid, forklarer hvorfor så få slike studier er fullført.

Maskinvare:

Vi registrere og analysere bildesekvenser på dobbelt prosessor arbeidsstasjoner med høy ytelse (f.eks gaming) grafikkort, 64 GB RAM, og høy gjennomførelse SSD disker (se Tabell for materiale). Data skal lagres på nettverk redundant array of independent disker (RAID) og sikkerhetskopiert til skyen ved en off-site data center.

Vi anbefaler å bruke kraftige collimated LED for pulserende fluorescens eksitasjon metall metallhalid eller kvikksølv-basert lyskilder. Det finnes flere tilgjengelige multi-farge LED-systemer. Mens noen av disse LED-systemer har en høyere upfront kostnader, kan de har en lang levetid (> 20 000 h) samtidig opphisse fire eller flere ulike fluorophores og gir presis timelige kontroll med en føljetong og/eller TTL grensesnitt med lav latens (10-300 µs bytte tid). Utløser sikrer at prøven er bare lyser når dataene faktisk samles. Vi vanligvis bruker en 10 ms eksponering hver 50 ms (20% plikt rate). Dette reduserer Phototoksisitet og Bevegelsesuskarphet under bildebehandling, som tidligere rapportert43.

Vi bruker sCMOS kameraer for deres fart og stort utvalg av små, sensitive piksler. En EM-CCD kamera er en mer kostbart alternativ, men 'blomst' effekter kan resultere i fanget photoelectrons smitte til bildepunktene. Nye rygg-opplyst sCMOS kameraer har lignende fotosensitivitet av EM-CCDs reduserte kostnader. Uansett må hvilken sensor brukes, GCaMP5 og mCherry kanaler hentes samtidig. Sekvensiell fange i flytte ormer vil føre til dårlig registrerte bilder uegnet for ratiometric kvantifisering. Tokanals bildebehandling kan oppnås på en enkelt kamera etter deling av kanaler med en bilde splitter (figur 2) eller med to identiske kameraer. Det dynamiske spekteret av 16-biters bilder er anbefalt over 8-biters bilder for nøyaktig ratiometric kvantifisering. For brightfield bilder av ormen atferd fange vi bruker en 1 in. 4.1 MP nær infrarød USB3 kamera for å fange stor 2 x 2 binned 1024 x 1024 8-biters bildesekvenser etter JPEG-komprimering. Den større FOV tilgjengelig på nyere mikroskop modeller kan en voksen orm å bli visualisert på 20 x etter 0.63 x demagnification med bare liten vignettering (figur 4E).

Vi anbefaler at du bruker standard TTL voltage signaler for å synkronisere belysning og rammen fange. På grunn av potensielle latencies i ulik programvare anbefales det at brukere konfigurere fluorescens kameraet med utløser utganger som master med TTL utganger kjører alle andre enheter. På denne måten hentes brightfield og scene posisjonsinformasjon for hver Ca2 + måling.

Splitt- eller resonans punkt-skanning AC confocal mikroskop vanligvis finnes i delte AC confocal fasiliteter gir også utmerket ytelse under ratiometric Ca2 + bildebehandling. Slike instrumenter kan brukes å fange to eller flere fluorescens kanaler med brightfield24. I dette tilfellet AC confocal hullet skal åpnes maksimale diameter, og en spektral detektor bør brukes til å skille GCaMP5, mCherry og infrarød brightfield signaler. Dette maksimerer lys samling fra en tykk (~ 20 µm) skive samtidig gir avvisning av ut-av-fokus fluorescens. Ettall downside er den mindre FOV og flere begrensninger for maskinvare- og tilpasning.

Programvare:

De fleste produsenter skip og installere deres kameraer og mikroskop med proprietær programvare, inkludert konfigurering av utløser innganger og utganger. Funksjonene og ytelsen til denne programvaren under opptak kan variere. Fordi raskt flytte ormer kan være utfordrende for å spore, bilde vises under innspillingen må være jevn og stabil på 20 Hz. Ytelsen kan bildesekvenser bli midlertidig lagret i RAM med behaviorally relevante delsett lagret på slutten av eksperimentet. Disse to-kanals bildesekvensfiler kan konverteres til det åpne bildet cytometri Standard formatet (.ics) for import til Ratiometric kvantifisering programvaren. OME-TIFF er et nyere åpen kildekode bildeformat, men forskjellige installasjoner ikke kan lagre TIFF bildesekvenser større enn 4 GB.

Den viktigste funksjonen i rørledningen kvantifisering er generasjon av forholdet kanalen og deretter en upartisk bilde segmentering prosedyren med mCherry fluorescens finne celler av interesse. Objektet størrelsen, XY centroid plassering og minimum, mener hver objektet, og maksimal fluorescens intensitetsverdiene for hver kanal (inkludert forholdet kanalen) beregnes. Sammen, brukes disse verdiene til quantitate endringer i intracellulær Ca2 + i hver timepoint i innspillingen. Objektet mål for hver timepoint eksporteres deretter som a.csv fil for senere analyser.

En stor begrensning av protokollen beskrevet her er avhengigheten av flytter dataene i ulike former gjennom et lappeteppe av programvareprodukter. En ekstra irritasjon er at noen av programvaren er åpen kildekode og gratis mens andre er lukket, dyrt og ujevnt oppdatert. En stor forbedring vil være å bruke eller utvikle ett stykke programvare (ideelt åpen-kilde) som gir lignende ytelse og lette-av-bruk fra oppkjøpet til analyse. Som nevnt ovenfor, dobler ratiometric analyse både filstørrelsen og tiden det tar å fullføre et eksperiment. Generering av kameraet drivere som kan integreres i kan tilpasses av bruker rammer som Bonsai ville tillate bilder og andre datastrømmer samles inn og analysert i sanntid, betydelig bedre gjennomstrømming.

Fremtidsutsiktene:

Mens vi vanligvis spore ormen bevegelser manuelt, bør sporing av ormen centroid oppdaget i infrarødt lys eller mørk-felt opptak tillate flere noder som gir lukket justering av scenen posisjon og automatisert for bildebehandling sporing (Figur 3 og data ikke vist). Fleste fluorescens opptakene med denne metoden er mørk og blottet for biologisk interessante data. På sensor eller sanntid etter oppkjøp image bearbeiding teknikker som beskjære bildesekvenser til relevante objekter vil tillate økt romlig oppløsning og fremskynde data analyse rørledningen, spesielt hvis flere Z-skiver samles for hver timepoint å visualisere aktivitet innen alle pre- og postsynaptic celler i kretsen.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det finnes ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra NINDS til KMC (R01 NS086932). LMN ble støttet av et stipend fra programmet NIGMS IMSD (R25 GM076419). Stammer brukt i denne studien C. elegans genetikk Center, som er finansiert av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takker James Baker og Mason Klein for nyttig diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).

Tags

Nevrovitenskap problemet 132 Caenorhabditis elegans kalsium atferd fluorescens bildebehandling Ca2 + journalister
Ratiometric kalsium avbilding av individuelle Neurons i oppfører seg <em>Caenorhabditis Elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock… More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter