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Genetics

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

Descrevemos a estratégia de produção de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) como veículos para a entrega CRISPR/Cas9 para as células. Com uma capacidade de mediar a edição de gene rápido e robusto nas células, IDLVs apresentar um mais seguro e plataforma de vector igualmente eficazes para a entrega do gene comparado com vetores integrase-competentes.

Abstract

Particulas de Lentivirus vetores são uma escolha ideal para a entrega de componentes de edição de gene de células devido à sua capacidade para estàvel transducing uma ampla variedade de células e mediando a altos níveis de expressão gênica. No entanto, sua capacidade de integrar o genoma celular do hospedeiro aumenta o risco de mutagenicidade insercional e assim gera preocupações de segurança e limita o seu uso em situações clínicas. Além disso, a expressão persistente de gene-editando componentes entregues por estes aumentos de integração-competente Lentivirus vetores (ICLVs) a probabilidade de promíscuo gene alvejar. Como alternativa, foi desenvolvida uma nova geração de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) que aborda muitas dessas preocupações. Aqui o protocolo de produção de uma nova e melhorada plataforma IDLV para edição de genes mediada por CRISPR e lista as etapas envolvidas na purificação e concentração de tais vetores é descrita e sua transdução e gene-edição eficiência usando HEK-293T demonstrou-se células. Este protocolo é facilmente escalável e pode ser usado para gerar IDLVs foram capazes de transducing células in vitro e in vivo. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a produção de ICLVs.

Introduction

Edição de gene preciso constitui a pedra angular das grandes avanços biomédicos que envolvem o desenvolvimento de novas estratégias para combater doenças genéticas. Na vanguarda das tecnologias de edição de gene é o método baseando-se no uso do cabrilhantado regularly -eunterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que foi inicialmente identificado como um componente da imunidade bacteriana contra a invasão de material genético viral (revisto em referências1,2). Uma grande vantagem do sistema CRISPR/Cas9 sobre outras ferramentas de edição de gene, como nucleases dedo de zinco (ZFNs) e as nucleases efetoras como ativador da transcrição (TALENs) (revistas em referência3), é a relativa simplicidade de design do plasmídeo e construção de componentes CRISPR — um recurso que tem alimentado a expansão do gene-edição de alguns laboratórios especializados para uma comunidade de pesquisa muito mais ampla. Além disso, a simplicidade de programação CRISPR/Cas9 e sua capacidade de reconhecimento do alvo multiplexado alimentaram ainda mais sua popularidade como uma tecnologia de baixo custo e fácil de usar. Entre os vários métodos disponíveis para pesquisadores entregar tais componentes de edição de gene para as células, vetores virais continuam a ser de longe o sistema mais popular e eficiente.

Vetores de Lentivirus (LVs) têm emergido como o veículo de escolha para entregar os componentes do CRISPR/Cas9 sistema na vivo para diversas aplicações4,5,6,7. Vários recursos chaves fazem LVs uma escolha popular para este processo, incluindo a sua capacidade de infectar células de divisão e não dividindo, baixa imunogenicidade e mínima toxicidade celular (revisto em referência8). Como resultado, a terapia gênica mediada por LV tem sido empregada em tratamentos de doenças infecciosas, tais como o HBV, HIV-1 e HSV-1, bem como na correção de defeitos subjacentes humanas doenças hereditárias, como fibrose cística e degeneração macular neo-vascular 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Além disso, a LVs foram efetivamente modificados para realizar a edição de gene multiplex em distinta loci genômicos usando um vetor único sistema12.

No entanto, a propriedade inerente de LVs para integrar o genoma do hospedeiro pode ser mutagênico e frequentemente desfavorecem sua utilidade como veículos de entrega do transgene, especialmente em situações clínicas. Além disso, desde que integrado estàvel LVs expressam seus transgenes níveis elevados sustentavelmente, este sistema é suficientemente adaptados para a entrega de componentes de edição de gene como CRISPR/Cas9; superexpressão de RNA Cas9-guia (gRNA) e proteínas similares, tais como ZFNs, estão associados com níveis elevados de efeitos fora do alvo, que incluem mutações indesejáveis13,14,15,16 , 17 e que potencialmente pode melhorar a citotoxicidade18. Portanto, para obter precisão edição de gene com efeitos mínimos fora do alvo, é imperativo para design de sistemas que permitem a expressão transiente de gene editando componentes.

Nos últimos anos, uma variedade de plataformas de entrega foram desenvolvidos para expressar transitoriamente CRISPR/Cas9 em células16,19,20,21 (revisto em referência22). Estes incluem métodos que dependem diretamente introduzir Cas9 purificado, juntamente com as guia apropriada RNAs em células, que foi mostrado para ser mais eficaz no gene alvo-edição em comparação com a transfeccao mediada por plasmídeo16. Estudos têm demonstrado que ribonucleoprotein (RNP) complexos consistindo de guia RNA/Cas9 partículas são rapidamente virou depois da mediação de clivagem de DNA em seus alvos, sugerindo que a expressão a curto prazo desses componentes é suficiente para alcançar gene robusto edição16. É concebível, não-integração de plataformas de vetor viral como vetores de vírus adeno-associado (AAVs) podem fornecer uma alternativa viável para entregar máquinas edição de gene em células. Infelizmente, capsids AAV possuem capacidade de embalagem significativamente menor do que o LVs (< 5KB), que dificulta severamente sua capacidade para empacotar o toolkit CRISPR multi-componentes dentro de um único vetor (revisto em referência8). É interessante notar que a adição de compostos que inibem a histona deacetilases (por exemplo, o butirato de sódio23) ou impedir o ciclo celular (por exemplo, cafeína24) foram mostrados para aumentar a concentração de particulas de Lentivirus. Apesar dos progressos recentes, os sistemas de expressão transiente desenvolvidos até agora ainda são impedidos por várias deficiências, tais como a baixa eficiência da produção, que levam a reduzida concentração viral e transdução de baixa eficiência dos vírus gerados através de tais abordagens25.

Vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) representam um grande avanço no desenvolvimento de veículos de entrega de gene, como eles combinam a capacidade de empacotamento de VLS com o benefício adicionado de AAV-como manutenção epissomal nas células. Esses recursos ajudam IDLVs largamente contornar as principais questões associadas com a integração de vetores, vis-à-vis a superexpressão contínua do potencial genotóxico de elementos e mutagenicidade mediada por integração. Foi previamente demonstrado que IDLVs podem ser modificadas com êxito para melhorar a expressão de gene epissomal26,27. Com relação à entrega de mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baixa produção e menor expressão dos genomas episome-suportado em relação a sistemas de Lentivirus integrase-proficiente limita sua utilidade como ferramentas de bona fide para a entrega de genoma-edição construções de transgénicas. Recentemente demonstramos que tanto a expressão do transgene e títulos virais associados à produção de IDLV são significativamente melhorados através da inclusão de binding sites para o fator de transcrição Sp1 dentro da gaveta de expressão viral28. Os IDLVs modificados robustamente suportado gene mediada por CRISPR edição tanto in vitro (em células HEK-293T) e na vivo (no pós mitóticas neurônios), enquanto a indução de mutações de fora do alvo mínimas comparadas com o correspondente mediada por ICLV sistemas de28. Em geral, desenvolvemos um romance, compacto, tudo-em-um kit de ferramentas CRISPR executados em uma plataforma IDLV e descritas as várias vantagens de usar esse veículo entrega para edição avançada do gene.

Aqui, o protocolo de produção do sistema de IDLV-CRISPR/Cas9 é descrito, incluindo as diversas etapas envolvidas em assembly, purificação, concentração e titulação da IDLVs, bem como estratégias para validar a eficácia de gene-edição destes vetores. Este protocolo é facilmente escalável para atender as necessidades de diferentes investigadores e é projetado para gerar com êxito vetores de LV, com uma concentração na faixa de 1 x 1010 transducing unidades (TU) / mL. Os vetores gerados através deste protocolo podem ser utilizados para infectar eficientemente vários diferentes tipos de células, incluindo células-tronco embrionárias difícil-para-transduce, células hematopoiéticas (células T e macrófagos) e culta e vivo em- neurônios injetados. Além disso, o protocolo é igualmente adequado para a produção de vetores de Lentivirus integrase-competente em quantidades semelhantes.

Figure 1
Figura 1: embalagem de IDLV. (a) esquema do tipo selvagem integrase proteína (b) o plasmídeo modificado foi derivado de psPAX2 (ver métodos, construção de plasmídeo para detalhes). Imagem de gel de agarose representante dos clones selecionados para clones mutantes integrase. Preparado usando um isolamento de DNA plasmídeo padrão mini kit de amostras de DNA foram analisadas por digestão com EcoRV e SphI. O clone digerido corretamente (número 5, caixa vermelha tracejada) verificou-se ainda mais por sequenciamento direto (Sanger) para a substituição de D64E em INT. A fita de empacotamento deficiente integrase foi nomeada pBK43. (c) diagrama esquemático do protocolo do transfection transiente empregadas para gerar vetores de IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T células transfectadas com VSV-G, embalagens e fitas do transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 tudo-em-um plasmídeo). Partículas virais que brote para fora da membrana celular contêm o RNA completo do vetor (expressado o transgene cassete). A segunda geração do sistema de embalagem-IDLV foi usada, que inclui as proteínas reguladoras Tat e expressão de Rev. Rev é complementada ainda mais de uma gaveta separada (RSV-REV-plasmídeo). Abrev: vírus de repetição, VSV-G, estomatite vesicular LTR-Long-terminal G-proteína, promotor de pCMV-citomegalovírus; Promotor de Rous sarcoma vírus (RSV); RRE-(elemento de resposta Rev). Outros elementos reguladores na gaveta a expressão incluem locais Sp1-obrigatórios, elemento Rev Response (RRE), marmota hepatite vírus Posttranscriptional regulamentar elemento (WPRE), um promotor de 1 α fator núcleo-alongamento (EFS-NC), a embalagem de vetor elemento ψ (psi), promotor de citomegalovírus (CMV) humano e humano U6 promotor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. cultivo de células HEK-293T e propagação de células para transfeccao

Nota: Rim embrionário humano 293T (HEK-293T) as células são cultivadas em DMEM, mídia de alta glicose suplementada com soro 10% bezerro suplementado com promotores de crescimento e de ferro e 1 x solução de antibiótico antimicótico (100 x de solução contém 10.000 penicilina unidades estreptomicina 10 mg e 25 µ g anfotericina B por mL). A mídia também é complementada com piruvato de sódio 1 x, 1 x mix de aminoácidos não-essenciais e 2 mM L-glutamina (dipeptídeo de estoque 200 mM L-alanil-L-glutamina em 0,85% NaCl). As células são cultivadas em placas de cultura de tecidos de 100mm (área de superfície aproximada de crescimento é 55 cm ²). Uma relação de cultivo sub de 01:10 é usada com sub cultivo a cada 2-3 dias. Tripsina-EDTA 0,05% é usado para a dissociação das células entre passagens. Para manter a consistência entre as experiências, recomendamos testes soros de bezerro quando se muda para um novo lote/lote e monitorar quaisquer alterações no crescimento celular, eficiência de transfeccao e produção de vetores.

  1. Inicie uma nova cultura usando células de baixa passagem (é recomendável não usar células após passagem 15 ou se o crescimento desacelera) por semeadura em uma placa de cultura de tecido de 10 cm. Use DMEM suplementado com 10% de soro para o crescimento da célula. Desenvolvem-se células a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de padrão de cultura de tecidos. Use um padrão hemocytometer para contar células para todas as etapas subsequentes.
  2. Uma vez que as células alcançar 90-95% crescimento confluente, nova propagação em 15 cm placas de cultura de tecidos (abaixo, passos 1.3 - 1.5).
  3. Para propagar novamente, Aspire mídia da placa confluente e suavemente Enxague com PBS 1x estéril. Células com 2 mL de reagente uma dissociação (por exemplo, do Trypsin-EDTA), incubar a 37 ° C, durante 3-5 min. Adicione 8 mL de mídia contendo soro para inactivar o reagente de dissociação e triture 10 - 15 vezes, com uma pipeta de 10 mL serológico para criar uma única célula suspensão. Ressuspender as células nos meios de cultura para obter uma densidade de célula de aproximadamente 4 x 106 células/mL.
  4. Para aumentar a aderência ao substrato, pre-revesti as placas de 15cm com 0,2% de gelatina, adicionar 8 mL de gelatina por placa. Espalhe uniformemente em toda a superfície da placa, incubar a temperatura ambiente por 10 min e desviar o líquido.
  5. Trazer o volume total de cada prato para 25 mL com morna (37 ° C) mídia HEK-293 T (ver nota no passo 1) e as placas de sementes adicionando 2,5 mL de células (total ~ 1 x 107 células/placa). Incube as placas a 37 ° C com 5% CO2 durante a noite ou até que seja alcançada a confluência de 70-80%.
    Nota: Até seis placas de 15cm pode ser usado para a produção. Ajuste o volume dos meios de comunicação por placa de ~ 20-22 mL ao usar mais do que quatro placas (consulte a etapa 5 do protocolo de justificação).

2. transfecting HEK-293T células usando um protocolo baseado em fosfato de cálcio

  1. Reagentes de transfecção
    1. Para preparar 2 x solução tampão BES BBS (50mm BES, 280 mM de NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), combinar 16,36 g de NaCl, 10,65 g de BES (N, N-bis (2-hidroxietil) -2-amino-ácido etanesulfónico) e 0,21 g de Na2HPO4. Adicionar bidestilada H2O (dd-H2O) até 900 mL. Dissolver, titula-se pH 6,95 com 1 M de NaOH e trazer o volume até 1 L. Filter, via unidade de filtro 0.22 µM. Loja a-20 ° C.
    2. Prepare 1M CaCl2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µM. Loja a 4 ° C.
  2. Observe as placas que foram semeadas um dia antes. As células estão prontas para transfeccao quando atingem a confluência de 70-80%.
  3. Aspirar a velha mídia das placas e suavemente adicionar mídia recém-preparado sem soro.
    Nota: Ver Arquivo complementar 1-plasmídeos para obter detalhes sobre os plasmideos escolhidos e sua preparação.
  4. Prepare a mistura do plasmídeo, plasmídeos alíquotas os quatro em um tubo cônico de 15 mL. Para uma preparação de prato único de 15 cm, use 37,5 µ g do CRISPR/Cas9-transferência vector (pBK198 ou pBK189), 25 µ g de pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µ g pMD2.G e 6,25 µ g de pREV (Figura 1C).
  5. Adicione 312,5 µ l 1M CaCl2 à mistura do plasmídeo. Para isso, adicione a 1,25 mL de estéril dd-H20.
  6. Lentamente (drop-wise), adicione 1,25 mL de solução de x BBS 2 enquanto num Vortex mistura. Incube durante 30 min à temperatura ambiente.
  7. Adicione a mistura de transfeccao gota a gota para cada placa de 15 cm (2,5 mL por placa). Agitar suavemente o frasco as placas e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 2-3 h. Depois disso, adicionar 2,5 mL (10%) soro por placa e continuar incubando durante a noite (12-18 h).
    Nota: Alguns laboratórios usam 3% CO2 incubadoras para estabilizar o pH de mídia. No entanto, não observamos qualquer diferença na eficiência de transfeccao entre 3% e 5% de CO2. Além disso, o tamanho do CaPO4 precipita é crucial para a eficiência do transfection; a mistura de transfeccao tem de ser limpo antes de sua adição para as células. Se a mistura torna-se nublado durante a incubação, prepare-se fresco 2 x BBS (pH = 6,95).

Figure 2
Figura 2: concentração de partículas virais usando gradiente protocolo duplo-sacarose. Partículas virais colhidas o sobrenadante (SN) são carregadas em gradiente gradiente de sacarose. soluções de sacarose de 70%, 60%, 30% e 20% são usadas para criar o gradiente. Após centrifugação, as partículas coletadas de fracções de sacarose a 30-60% são carregadas em uma almofada de sacarose 20% mais e precipitadas. O pellet final contendo partículas virais purificadas é resuspended em 1X PBS para uso mais (ver texto para mais detalhes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. o dia depois do Transfection

  1. Observe as células para garantir que eles estão se aproximando de confluência de 100% neste ponto com pouca ou nenhuma morte celular. Substitua a mídia adicionando-se 25 mL de DMEM fresco + 10% de soro para cada placa. Continue a incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para um adicional 48 h.
    Nota: Ajuste o volume de mídia na etapa 3.1 se usando mais do que seis placas de 15 cm (ver passo 5.2, nota).

4. colheita de vírus

  1. Recolha o sobrenadante cuidadosamente todas as placas de cultura de tecido contendo as células transfectadas usando uma pipeta de cultura de tecido estéril 10 mL e piscina em tubos de centrífuga de 50 mL.
  2. Limpe a suspensão por centrifugação a 400-450 x g durante 10 minutos utilizando uma centrífuga do tabletop. Filtre o sobrenadante através de uma unidade de vácuo filtro de 0,45 µm.
    Nota: O sobrenadante filtrado pode ser armazenado a 4 ° C por até 4 dias antes de prosseguir com a concentração, ou aliquotadas e armazenado a-80 ° C. Uma concentração esperada de IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (não concentrado) virais preparações deve ser ~ 2 x 107 TU/mL (consulte a etapa 6 para determinação de título). No entanto, evite sujeitar os preparativos virais de vários ciclos de gelo-degelo, como cada rodada de congelamento e degelo resulta em uma perda de 10-20% de concentração funcional.

5. concentração de partículas virais por ultracentrifugação

Nota: Utilizamos um método duplo-sacarose de purificação que envolve duas etapas: uma etapa de gradiente de sacarose e um passo de almofada de sacarose (Figura 2).

  1. Carregar os tubos cónicos ultracentrifugação na seguinte ordem para criar um gradiente de sacarose: 0,5 mL 70% de sacarose (dissolvido 1X PBS), sacarose de 60% de 0,5 mL (dissolvido em DMEM), sacarose 30% de 1 mL (dissolvido em DMEM) e sacarose 20% de 2 mL (dissolvido em 1X PBS).
  2. Adicione cuidadosamente o sobrenadante contendo vírus para o gradiente. Como o volume total de sobrenadante de quatro placas de 15 cm de 100 mL, use seis tubos de ultracentrifugação por spin para processar todo o volume do vírus sobrenadante.
    1. Cada tubo de ultracentrifugação utilizado para esta etapa tem uma capacidade volumétrica de até 30 mL (incluindo o volume de sacarose), distribuir o sobrenadante viral igualmente entre tubos, deixando pelo menos 10% headspace para evitar derrame.
    2. Ajuste o volume de cultura de ~ 20-22 mL por placa ao usar mais do que quatro placas de 15cm para cada experimento, para que o volume final do líquido sobrenadante viral em pool facilmente pode ser acomodado dentro de seis tubos de ultracentrifugação.
    3. Preenchimento ultracentrifugação tubos pelo menos três quartos de sua capacidade de volume total, caso contrário ruptura de tubos pode ocorrer durante a centrifugação, resultando em possível perda de amostra e/ou equipamento de danos.
  3. Equilibrar os tubos com 1X PBS e centrifugar as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C (ver Tabela de materiais para obter detalhes do rotor).
    Nota: Para evitar o rompimento da camada de sacarose durante a aceleração, defina o se lentamente acelerar o rotor até 200 rpm durante o primeiro 3 min do spin. Da mesma forma, defina o se para desacelerar lentamente o rotor de 200 rpm para 0 rpm mais 3 min no final do spin.
  4. Cuidadosamente colete frações de 30-60% de sacarose em tubos limpos (Figura 2). Adicionar 1 frio x PBS para as frações em pool e levar o volume a 100 mL; Misture pipetando subindo e descendo várias vezes.
  5. Prossiga para a etapa de coxim de sacarose por camadas cuidadosamente a preparação viral em uma almofada de sacarose. Para isso, adicione 4 mL de sacarose 20% (em 1X PBS) para o tubo, seguido de ~ 20-25 mL da solução de viral por tubo. Se os tubos estão a menos de três quartos completo, top-up com PBS 1x estéril.
  6. Cuidadosamente, equilibrar e centrifugar as amostras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C, como antes. Decantar o sobrenadante e permitir que o restante liquido seja invertendo-se os tubos em papel toalha.
  7. Aspire as gotas restantes a fim de remover todo o líquido da pelota. Neste passo, os pellets contendo vírus devem ser pouco visíveis como pequenas manchas translúcidas.
  8. Resuspenda pelotas adicionando 70 µ l de PBS 1x para o primeiro tubo e completamente pipetagem da suspensão, posteriormente transferindo a suspensão para o próximo tubo e mistura como antes, continuando até que todas as pelotas são resuspended.
  9. Lave os tubos com um adicional 50 µ l de frio 1X PBS e mistura como antes. Certifique-se que o volume combinado da suspensão final é ~ 120 µ l e aparece ligeiramente leitoso; limpá-la por centrifugação a 10.000 x g, durante 30 s na microcentrifuga do tabletop.
  10. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco, fazer 10 alíquotas µ l e armazená-los a-80 ° C.
    Nota: Evite realizar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento nas amostras de Lentivirus. Exceto quando a centrifugação é necessária, esforços devem ser feitos para realizar as etapas restantes em capas de cultura de tecidos, ou designados quartos de cultura de tecidos utilizando medidas de biossegurança adequadas (ver discussão).

6. estimativa da concentração Viral

  1. p24 -enzima-lig da imunoabsorção método de ensaio (ELISA)
    Nota: O ensaio é realizado utilizando placas de 96 poços de ligação de alta como de acordo com as instruções do programa de vacina de AIDS NIH para HIV-1 p24 ensaio de captura de antígeno Kit (veja a Tabela de materiais) com modificações29.
    1. No dia seguinte, lavar os poços três vezes com 200 µ l 0,05% Tween 20 em PBS frio (solução de PBS-T). Cubra o prato com 100 µ l de anticorpo monoclonal anti-p24 a uma diluição de 1:1500 em PBS 1x e incubar durante a noite a 4 ° C.
    2. Para eliminar a ligação não-específica, bloquear a placa com 200 µ l 1% BSA em PBS; lavar três vezes com 200 µ l 0,05% Tween 20 em PBS frio (solução de PBS-T) pelo menos 1 h à temperatura ambiente.
    3. Preparar amostras: Para preparações de vetor concentrado, diluir 1 µ l da amostra 100-fold adicionando µ l 89 de dd-H20 e 10 µ l de Triton X-100 (concentração final de 10%). Para as preparações não concentrado, prepare dez vezes amostras diluídas (adicionar 80 µ l de dd-H20 e 10 µ l de Triton X-100 (concentração final de 10%) a 10 µ l da amostra).
      Nota: As amostras podem ser armazenadas a-20 º C a este passo por um longo período de tempo para uso posterior.
    4. Prepare padrões de HIV-1, aplicando uma diluição serial 2 vezes (com uma partida concentração 5 ng/mL).
    5. Diluir o concentrado de amostras (a partir de ações pré-diluído 1: 100) em RPMI 1640 suplementado com 0,2% Tween 20 e 1% de BSA para estabelecer 01:10, 000, 01:50, 000 e diluições de 1:250,000. Diluir as amostras não concentrado (de 01:10 pré-diluído estoques) em RPMI 1640 suplementado com 0,2% Tween 20 e 1% de BSA para estabelecer diluições de 1: 500, 1:2500 e 1:12,500.
    6. Aplicação das amostras da placa em triplica e incubar durante a noite a 4 ° C.
    7. No dia seguinte, lavar os poços seis vezes e incubar a 37 ° C por 4 h com 100 anticorpo anti-p24 polyclonal µ l, diluído 1: 1000 em RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% de BSA e soro normal do rato de 2% (NMS).
    8. Lave seis vezes como acima e incubar a 37 ° C, durante 1 h com peroxidase de rábano de anticabra coelho 1:10,000 IgG diluído em RPMI 1640 suplementado com soro de cabra normal de 5%, 2% NMS, BSA de 0,25% e 0,01% Tween 20.
    9. Lave a placa, como acima e incubar com substrato de peroxidase TMB em temperatura ambiente por 15 min.
    10. Pare a reação adicionando-se 100 µ l de 1 N HCL. Medir a absorvância da amostra a 450 nm, utilizando a absorvância da placa leitor.
  2. Medição da intensidade de repórter fluorescentes
    1. Método de FACS
      Nota: A medida da depleção de sinal GFP nas células pode ser estimada com precisão, medindo a intensidade média de fluorescência das células transduzidas através de citometria de fluxo. Refira por favor o papel recente 28 para análise de dados de FACS, apresentação e interpretação. O protocolo é descrito da seguinte maneira.
      1. Faça uma diluição serial dez vezes da preparação (a partir de 10-1 a 10-5) da preparação viral em 1X PBS.
      2. Sementes de aproximadamente 5 x 105 293T células em cada poço de uma placa de 6 em um volume final de 2ml por bem. Adicionar 10 µ l de cada diluição viral para as células e incubar as células a 37 ° C por 48 h.
      3. Colheita de células para análise de FACS como segue: Adicionar 200 µ l de solução de tripsina-EDTA 0,05% e incubar as células a 37 ° C por 5 min. adicionar 2 mL de uma mídia DMEM completa e coletar amostras em tubos cônico de 15 mL.
      4. Células de pelotas por centrifugação a 400 x g a 4 ° C e resuspenda o pellet em 500 µ l de PBS 1x frio.
      5. Para fixação, adicionar um volume igual de solução de formaldeído de 4% para essa suspensão e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
      6. Células fixas de pelotas e ressuspender em 1 mL de 1X PBS. Analisar a expressão de GFP, usando um instrumento de FACS, conforme descrito em Ortinski et al . 28 brevemente, use a seguinte fórmula para determinar o título funcional do vírus:
        Equation 1
        Nota: Aqui Tg = número de células GFP-positivo contado; TN = número total de células contadas; N = número total de células transfectadas; V = volume (em µ l) usado para a transdução. Por exemplo: se 1 x 106 células foram transfectadas com 10 µ l de vírus, 2 x 104 células foram contados e 5 x 103 eram GFP-positivo, com base na equação acima o título funcional seria:
        Equation 2
    2. Contagem de células GFP-positivo
      1. Calcule a multiplicidade de infecção (MOI) usada para a transdução. Teste uma gama ampla de MOIs (1-10), com o aumento da MOIs, resultando em uma maior eficiência de transdução.
      2. Antes de transfeccao, sementes de uma placa de 6 com aproximadamente 3-4 x 105 células por poço. Uma vez que alcança as células > transduce de confluência de 90% (normalmente dentro de 24 h), com o vírus purificado a MOIs pré-determinado.
      3. Incube a placa a 37 ° C com 5% CO2 em uma padrão cultura de tecidos e células de monitor em intervalos regulares para 1-7 dias para mudanças no sinal GFP.
      4. Contar o número de células GFP-positivo com um microscópio fluorescente (plano 4 X objetivo, N.D. 0.1, ampliação de 40 X) equipado com um conjunto de filtro GFP (excitação de comprimento de onda-470 nm, emissão de onda-525 nm), usando o ingênuo células (un-transduzidas) para definir a população de células GFP-negativo e positivas.
      5. Estime o título final ajustando para o fator de diluição e o volume, usando a seguinte fórmula:
        Equation 3
        Nota: Aqui, N = número de células GFP-positivo, D = factor de diluição, M = fator de ampliação (geralmente 20 X), V = volume de vírus usada por transdução. Por exemplo, para 20 células GFP-positivo (N), contadas a uma diluição de 10-4 (01:10, 000) em uma amostra de 10 µ l (V) a 20 X ampliação (M) (D) resultaria em um título funcional de (20 x 104) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* para ajustar-se por mL)

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Representative Results

Validação da nocaute-eficiência dos vetores de IDLV-CRISPR/Cas9
Usamos as células GFP-expressando 293T como um modelo para validar a eficiência de nocaute de gene CRISPR/Cas9-mediada. Células GFP + foram geradas pela transdução de células HEK-293T com pLenti-GFP (vBK201a) em um MOI de 0.5 (Figura 3b, painel de "no-virus"). A fita de sgRNA-para-GFP/Cas9 tudo-em-um vetor foi empacotada em partículas IDLV ou ICLV e a eficiência da produção foi avaliada por p24 ELISA (veja acima; e Figura 3a). Os títulos dos vetores contendo sites Sp1-vinculação (concentração seguinte) foram encontrados para ser na faixa de 1010 TU/mL. Em seguida, avaliamos a eficiência do nocaute GFP usando microscopia fluorescente (Figura 3b). Para este fim, 5 x 105 GFP-expressando 293T células foram semeadas em uma placa de 6 e nós lhes transfectadas 24h mais tarde com IDLV - ou ICLV-CRISPR/Cas9 no MOIs de 1 e 5 (Figura 3b). As células foram incubadas por 24 h, após o qual o meio de cultura foi substituído e as células foram incubadas durante um adicional 48 h, antes repropagação as placas para dias subsequentes do experimento.

Em um estudo recente, Nós medimos a intensidade de fluorescência média de GFP + células transfectadas com ICLV/CRISPR ou IDLV/CRISPR componentes através de de citometria de fluxo28. Vimos a GFP-esgotamento comparável em pós-transdução de amostras 14 dias (pt) (2-4% depleção de sinal) e quase idênticas depleção de GFP 21 dias pt (> depleção de 99% de sinal)28. Em concordância com as observações anteriores, observamos um ~ quíntuplo redução no número de GFP-positivo logo em 7 dias pt (Figura 3), células com uma depleção de sinal quase completo observada por 14 dias pt (dados não mostrados) após transdução com ambos os sistemas de ICLV - e IDLV-CRISPR/Cas9. A perda de sinal foi avaliada como a relação das células que permaneceram GFP-positivo após o tratamento e o número total de células GFP-positivo de ingênuo. Estes resultados demonstram claramente que CRISPR/Cas9 construções entregadas por IDLVs são comparáveis com aqueles entregues por suas contrapartes integrando na sua capacidade de mediar a edição de gene rápido, robusto e sustentado em dividir células.

Figure 3
Figura 3: avaliação de títulos virais. (a) pelo p.24-ensaio de ELISA. Títulos para o Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (barra preta) concentrado e Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (barra branca) foram avaliados. Os resultados são registrados no número de cópias / mL, sendo que 1 ng p24-mordaça = 1 x 104 partículas virais. Dados de gráfico de barras representam a média ± SD de experimentos triplicados. (b) eficiência de GFP mediada por avaliação de CRISPR-nocaute. Depleção do sinal GFP foi comparada entre 5 e ICLV-CRISPR/Cas9 - e IDLV-CRISPR/Cas9-transfectadas 293T GFP + células no MOIs de 1. Un-transduzidas (painel "nenhum vírus" na figura) células GFP-positivos foram usadas como controles. Imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de fluorescência na ampliação de X 40 a transdução de post de 7 dias. Abrev: RRE: Rev Response elemento, EFS-NC: promotor de núcleo-alongamento fator 1 α, ψ (psi): elemento de empacotamento de vetor, hU6: humano U6 promotor, Puro: gaveta de puromicina-resistência, WPRE: marmota hepatite vírus Posttranscriptional regulamentar Elemento, LTR: Repetição de Long-terminal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo complementar 1: plasmídeos Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

IDLVs começaram a emergir como o veículo de escolha para na vivo gene-edição, especialmente no contexto de doenças genéticas, devido em grande parte para o baixo risco de mutagênese associado a estes vetores, em comparação com a integração de plataformas de entrega22 , 28. no manuscrito atual, nós procuramos detalhar o protocolo associado com a produção do sistema melhorada para a IDLV-CRISPR/Cas9 tudo-em-um que foi recentemente desenvolvido em nosso laboratório,28.

Modificações para as plataformas existentes
Com este método, fomos capazes de gerar IDLV-CRISPR/Cas9 e ICLV-CRISPR/Cas9 vetores em títulos na faixa de 1 x 1010 TU/mL (Figura 3a). Esta melhoria na eficiência da produção pode ser atribuída à adição de sítio de ligação Sp1 dentro vetor CRISPR/Cas9 de tudo-em-um. Com efeito, recentemente informamos a inclusão do Sp1 resulta em um aumento de ~2.5-fold da eficiência do empacotamento dos vetores de IDLV - e ICLV-CRISPR/Cas9 e uma ~ 7-fold aumento de títulos em geral funcionais. Estes resultados estão de acordo com o trabalho anterior de vários grupos, destacando o Sp1 como um regulador chave do selvagem-tipo HIV-130,31,32,33,34,35 .

Passos críticos e solução de problemas
Como apontado acima, Sp1-IDLVs carregando CRISPR/Cas9 transgenes foram capazes de gerar títulos nas proximidades de 1 x 1010 TU/mL por ~ 5 x 107 células de produtor. Concentração inferior a estas seria indicativa de erros no processo de produção, caso em que o seguinte crucial pontos devem ser considerados para melhoria do título: 1) recomenda-se que as células de produtor de preferência ser de número de passagem baixa, com substituição após ≥ 15 passagens e/ou quando é observado o crescimento mais lento. 2) a escolha de componentes de mídia do celular é importante em termos de eficiência de produção. Por exemplo, no lugar do comumente usados fetal soro bovino, achamos que o uso de soro de vitelo cósmica consistentemente melhorou o crescimento celular e produção viral, sendo econômica ao mesmo tempo. 3) a aptidão de produção das diferentes linhas de HEK deve ser cuidadosamente avaliada. Por exemplo, encontramos um ~ tríplice diferença de rendimento de produção viral entre células 293T e 293-FT (ver Tabela de materiais) células (dados não mostrados). 4) recomenda-se que as células transfected quando são aproximadamente 70-80% de confluencia, com baixas densidades de célula, resultando em morte celular prematura devido a toxicidade viral e densidades maiores, resultando em uma queda marcada na eficiência da produção. Como regra geral, sugerimos a contabilidade para uma densidade de celular que permite que as células para se submeter a um adicionais redondo do pós-transfection divisão celular. 5) por último, a eficiência do transfection é altamente dependente do pH de 2 x BBS, que deverá ser mantida em 6,95 exatamente para transfeccao ideal. Portanto, é altamente recomendável que cada novo lote de 2 x BBS ser verificado em escala piloto-do transfection.

Segurança e manipulação de vetor
Há várias considerações de segurança importante durante a produção de vetores IDLV e ICLV com este protocolo. Em primeiro lugar, trabalhar com lentivírus requer contenção de Bio-segurança nível II. Apesar das características de segurança oferecidas por vetores SIN, atividade transcricional residual de vetores do pecado tem sido relatado36. Além disso, o trabalho anterior demonstrou que IDLV - e ICLV-genomas podem ser produtivamente resgatados pelo HIV-127. Portanto, é altamente recomendável que efectuar ensaios de competência de replicação (RCA), especialmente quando concentrados lentivírus estão sendo usados37. Para os procedimentos de segurança em relação a manipulação de preparações de vetor de Lentivirus, consulte biossegurança em laboratórios biomédicos, 4ª edição, publicado pelo Centers for Disease Control (CDC), que podem ser encontrados on-line38e microbiológicas. Na mesma nota, terceira geração sistemas39 com características de biossegurança aprimorada de empacotamento pode ser usada para empacotar IDLVs e ICLVs, embora com menor eficiência do que o sistema de segunda geração.

Significado e sentidos futuros
Em geral, o protocolo de produção para IDLVs para CRISPR/Cas9 - mediada por gene edição descrito aqui representa a primeira avaliação da eficiência deste sistema em células dividindo rapidamente. Usando células GFP-positivo HEK-293T, demonstrámos que Sp1-CRISPR/Cas9 entregado por IDLVs pode eficientemente e rapidamente editar GFP nestas células, com cinética semelhante como ICLVs. Estas observações são amplamente consistentes com os resultados do trabalho anterior usando complexos ribonucleoprotein (RNPs Cas9) para gene edição através de métodos não-virais do transfection. Esta plataforma de novela mais enriquece deexpansão toolbox para a entrega de componentes de edição de gene e outras cargas moleculares para as células.

Como discutido anteriormente, apesar dos recentes progressos no desenvolvimento de sistemas baseados em Lentivirus gene-entrega, existem alguns que sem opções para plataformas que permitem a produção sustentável de alta-título de vetores virais para gene alvo rápido e transitório manipulação. Através da incorporação de motivos para um fator de transcrição altamente expressa na gaveta do transgene expressão de vinculação, pudemos abordar simultaneamente vários desses problemas. Esta manipulação simples contudo crítica abre-se uma série de avenidas para o desenvolvimento de plataformas de entrega de semelhante. É particularmente útil testar se a expressão do transgene pode ser reforçada através de qualquer adição de numerosas cópias do motivo da ligação do mesmo, ou por multiplexação o motivo Sp1 com ligação a sites de outros fatores de transcrição. Com tais ferramentas à nossa disposição, é tentador especular essa expressão de relativamente fracos promotores tecido-específicos, como aqueles para Synapsin humana eu (hSyn) e o rato-dependente de cálcio/calmodulina proteína quinase II (CaMKII), poderia ser significativamente melhorou tanto in vitro e in vivo.

Enquanto o atual estudo limitou-se a testar a capacidade de "knockdown" gene de Cas9/CRISPR IDLV-entregue, em princípio, a versatilidade do nosso sistema seria passível de diversos aplicativos de edição de gene, tais como aqueles depender o cataliticamente inactiva dCas940. Finalmente, combinado com endonucleases menores, tais como SaCas941 e Cpf142, a plataforma descrita neste estudo pode ser adotada para o estabelecimento de sistemas altamente eficiente baseado em AAV gene-entrega em um espaço relativamente curto de tempo, que proporcionaria a vantagem adicionada de baixa imunogenicidade em comparação aos vetores Lentivirus. Escusado será dizer, tais abordagens seria um passo positivo para o desenvolvimento do romance, eficiente e clinicamente seguros vetores virais.

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Disclosures

Patente da USC-499-P (1175) foi arquivado pela Universidade da Carolina do Sul em relação ao trabalho descrito neste manuscrito.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer o departamento de neurobiologia, Duke University School of Medicine e gabinete do reitor para a ciência básica, Duke University. Agradecemos também a membros do núcleo do vetor Viral Duke para comentários sobre o manuscrito. Plasmídeo pLenti CRISPRv2 foi presente do Feng Zhang (Broad Institute). O sistema de LV-embalagem, incluindo o psPAX2 de plasmídeos, VSV-G, pMD2.G e pRSV-Rev foi um presente tipo de Didier Trono (EPFL, Suíça). Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido pela Universidade de Carolina do Sul escola de medicina, conceda RDF18080-E202 (Rafaella).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

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References

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Genética edição 130 transferência de genes mediada por Viral células HEK-293T vetores de Lentivirus integrase deficiente gene CRISPR/Cas9 edição sistema p24 ELISA gradiente de sacarose ultracentrifugação FACS
Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células
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Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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