Rekonstitution von Membranproteinen
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Overview
Rekonstitution ist der Prozess der Rückkehr eines isolierten Biomolekül in seiner ursprünglichen Form oder Funktion. Dies ist besonders nützlich für die Untersuchung der Membranproteine, die ermöglichen wichtige Zellfunktionen und beeinflussen das Verhalten des nahe gelegenen Lipide. Um die Funktion des gereinigten Membranproteine an Ort und Stelle zu studieren, müssen sie wieder hergestellt durch eine künstliche Lipidmembran einzugliedern.
Dieses Video stellt Membrane Protein Rekonstitution Konzepte und Verfahren, wie Protein isoliert mit Reinigungsmittel, Bildung von künstliche Vesikel mit Lipiden, Einbeziehung des isolierten Proteins in die künstliche Vesikel und Trennung des Waschmittels aus der Lösung. Zu guter Letzt zwei Anwendungen abgedeckt werden: Wiederherstellung des Membran-Transportproteine und Rekonstitution des Licht-ernten Proteine.
Rekonstitution ist der Prozess der Wiederherstellung einer isolierten Biomolekül zu seiner ursprünglichen Form oder Funktionalität. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, wenn Membranproteine, die viele wichtige zelluläre Prozesse ermöglichen und beeinflussen das Verhalten des benachbarten Lipide zu studieren. Die Komplexität der Zelle Umgebung erschwert jedoch Membran Proteinfunktionen zu studieren in-situ. Die Proteine können extrahiert und gereinigt, aber ihre eigentlichen Funktionen nicht ohne eine Membran ausgewertet werden. Deshalb sind isolierte Membranproteine durch Integration in eine künstliche Lipidmembran, z. B. ein Liposom rekonstituiert . Dieses Video führt die Grundsätze der Membrane Protein Rekonstitution, eine allgemeine Rekonstitution und einige Anwendungen in der Biochemie.
Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden und Membranproteine. Die Phospholipide bilden eine Bilayer, in dem die hydrophilen Phosphat-Köpfe mit wässrigen innen und außen der Zelle, interagieren, während die hydrophoben Fettsäure-Tails in der Bilayer miteinander interagieren.
Manche Membranproteine interagieren nur mit der Membran durch elektrostatische oder Nichtkovalente Wechselwirkungen. Andere, genannt “integrale Proteine”, sind in der Lipid-Bilayer eingebettet.
Wie der Bilayer integrale Proteine haben hydrophilen enden und eine hydrophobe Zentrum und durch hydrophobe Wechselwirkungen in Position gehalten werden. Integrale Proteine, die die gesamte Membran erstrecken sind bekannt als “transmembranen Proteine”.
Die Wechselwirkungen zwischen dieser Proteine und die Membran sind so stark, dass sogar lyse der Zellen nicht trennen wird. Ein spezieller Tensid genannt ein Waschmittel wird verwendet, um die Proteine zu extrahieren. Ähnlich wie Phospholipide, Reinigungsmittel haben hydrophilen Köpfe und lipophilen Endstücke und können die Membran frei eingeben.
Innerhalb der Membran interagieren die lipophilen Endstücke des Waschmittels mit den hydrophoben Protein-Kern. Dies umschließt das Protein mit einer Schale der hydrophilen Waschmittel Köpfe, die die Protein-Lipid-Wechselwirkungen stört.
Der Protein-Reinigungsmittel-Komplex ist jetzt leicht von der Membran getrennt. Das Waschmittel macht den Komplex löslich in wässrigen Lösungen und bereit für die Wiederherstellung in eine künstliche Membran.
Proteine werden häufig in den Membranen der Liposomen, die künstliche Vesikel sind wiederhergestellt. Um Liposomen vorzubereiten, sind getrocknete Lipide hydratisiert und aufgeregt, um Vesikel Bildung zu induzieren. Wenn ein Spülmittel hinzugefügt wird, ist es die Membranen der Liposomen integriert.
Um das Protein wieder zusammenzusetzen, solubilisiert Proteine und Liposomen kombiniert, und dann das Waschmittel aus Lösung durch Dialyse oder chemische Adsorption entfernt. Die Proteine Liposomen schnell montieren und in Proteoliposomes, also nur die hydrophilen Gruppen ausgesetzt sind. Die Proteine funktionieren dann wie sie in einer Zellmembran und isoliert untersucht werden können.
Jetzt, wo wir die Grundlagen des Proteins Rekonstitution behandelt haben, gehen Sie wir über ein Protokoll für Neuaufbau Membranproteine in Liposomen.
Um zu beginnen, die Membranproteine zu isolieren, sind die Zellen lysiert. Ungebrochene Zellen werden mit Zentrifugation entfernt.
Der Überstand wird mit einer höheren Geschwindigkeit zu die Membranen Pellets zentrifugiert. Die Kugel ist wieder ausgesetzt und eine Reinigungsmittel wird hinzugefügt, um die Proteine zu extrahieren.
Die restlichen Zellenrückstand wird durch zusätzliche Zentrifugation entfernt. Das Protein ist von der Überstand mit Säulenchromatographie gereinigt und dann konzentriert oder weiter nach Bedarf gereinigt.
Um mit den Vorbereitungen der Liposomen, ist eine Suspension von Phospholipiden in organischen Lösungsmittel unter Stickstoff oder Argon getrocknet.
Die Phospholipide sind hydratisiert mit Hydratation Puffer, und die Mischung ist beschallt, um die Erstellung der Liposomen abzuschließen.
Waschmittel wird hinzugefügt, die Liposomen solubilisieren die ist dann mit den Proteinen kombiniert.
Das Reinigungsmittel wird durch Adsorption auf Polystyrol-Kügelchen, Dialyse oder eine Waschmittel-Bindung Spalte entfernt. Die sich daraus ergebenden Proteoliposomes sind bereit, gereinigt und in späteren Experimenten verwendet werden.
Nun, da Sie mit den Grundlagen von einer Membran-Protein-Rekonstitution vertraut sind, schauen Sie sich bitte an ein paar Anwendungen von Protein Rekonstitution in Biochemie.
Membrane Transportprotein war wieder hergestellt, um ein klareres Verständnis für seine Transportmechanismus zu gewinnen. Ihrer Funktion nach Rekonstitution wurde mit einem Ausfluss von Iodid-Ionen verifiziert. Dann wurde die Transportaktivität in Anwesenheit von verschiedenen niedermolekulare Ionen-Kanal-Hemmer und Potentiatoren untersucht. Auf diese Weise konnte der direkten Interaktionen dieser kleinen Moleküle mit dem Transportprotein untersucht werden.
Chlorophyll und Carotinoid-bindende Membranproteine in Pflanzen ernten Licht, Förderung der Ladungstrennung und leichte Schäden zu mildern. Durch diese Licht-ernten Proteine Neuaufbau, können ihre Faltung Dynamik und Interaktion mit Pigmenten studiert werden. Die Licht-ernten Proteine rekonstituiert mit dieser Technik hatte sehr ähnliche optische Eigenschaften, die native Proteine. Fluoreszenz-Emission-Spektroskopie kann dann zur Energieübertragung von Pigmenten in die rekonstituierte Licht-ernten Proteine zu studieren.
Sie haben nur Jupiters Video auf Wiederherstellung von Membranproteinen angesehen. Rekonstitution ist eine Möglichkeit, wichtige Proteine in einer Zelle Mimik zur weiteren Untersuchung übertragen. Dieses Video behandelt die Grundsätze der Protein Rekonstitution, eine Rekonstitution Protokoll und ein paar Anwendungen in der Biochemie. Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
