Summary
Vi presenterer en ny tilnærming for å karakterisere kreftceller. Vi kombinert immunofluorescence med DNA fluorescerende -på plass-hybridisering evaluere celler fanget av en functionalized medisinske wire kan i vivo berikende CTCs direkte fra pasienten blod.
Abstract
Sirkulerende kreftceller er (CTCs) assosiert med dårlig overlevelse i metastatisk kreft. Deres ID, phenotyping og genotyperingteknologi kan føre til en bedre forståelse av svulst heterogenitet og dermed lette valg av pasienter for personlig behandling. Imidlertid er dette hindret på grunn av sjeldenhet av CTCs. Vi presenterer en innovativ tilnærming for prøvetaking et høyt volum av pasientens blod og få informasjon om tilstedeværelse, fenotype og gene translokasjon av CTCs. Metoden kombinerer immunofluorescence flekker og DNA fluorescerende -på plass-hybridisering (DNA fisk) og er basert på en functionalized medisinske wire. Denne ledningen er en innovativ enhet som tillater i vivo isolering av CTCs fra store mengder perifert blod. Blod volumet vist av en 30 minutters administrasjon av ledningen er ca 1,5-3 L. For å demonstrere gjennomførbarheten av denne tilnærmingen, epithelial celle vedheft molekyl (EpCAM) uttrykk og chromosomal translokasjon av ALK-genet ble bestemt i ikke-småcellet lungekreft kreftcelle (NSCLC) linjer av functionalized ledningen og farget med immuno-DNA fisk tilnærming. Vår største utfordring var å utføre analysen på en 3D-struktur, functionalized ledningen, og å finne immuno-fenotypen fisk signalene på dette støtter bruk av konvensjonelle fluorescens mikroskop. Resultatene indikerer at fange CTCs og analysere deres fenotypen og chromosomal omorganisering kan potensielt representerer en ny kameraten diagnostiske tilnærming og gir en innovativ strategi for å forbedre personlig kreft behandlinger.
Introduction
CTCs representerer et viktig skritt i kreft celle spredning1. Deres tilstedeværelse i perifert blod av pasienter er tilknyttet (metastatisk) tilbakefall og sykdom progresjon2,3. CTC isolering og karakterisering fra blodet av pasienter er en ikke-invasiv flytende biopsi. De siste årene har blitt det stadig tydeligere som overvåking progresjon og svar av svulster på ulike behandlinger bruker denne typen analyser gir viktig klinisk informasjon4,5. Flytende biopsi er enda mer nyttig når kirurgi er ikke gjennomførbart eller når primære tumor vev er ikke tilgjengelig, dvs.for ikke-biopsiable lesjoner. Derfor er denne tilnærmingen lovende i bestemte kreft innstillinger som metastatisk NSCLC, der tilstedeværelse av CTCs har vist seg å ha en negativ prognostiske rolle6. NSCLC er en svulst det har spesielt målrettet terapeutiske metoder7,8,9 designet for å fungere på bestemte molekyler (molekylære mål) kjent være involvert i veksten, progresjon, og spredningen av sykdommen. Derfor er påvisning av konkrete mål under sykdomsprogresjon nødvendig. CTC undersøkelse er en svært interessant diagnostiske tilnærming til å oppdage og overvåke narkotika mål uten behov for primær eller metastatisk vev. For eksempel er oppdagelsen av ALK-genet translocations i NSCLC celler forbundet med følsomhet overfor crizotinib, en spesifikk målrettet terapi10. Men i dag utføres oppdagelsen av ALK translocations bare på fine-nål aspirates eller liten biopsier; som et resultat, uten en svulst er vev ALK analyse ikke mulig. CTCs er et potensielt alternativ til tumor vev-baserte undersøkelser og en lovende følgesvenn diagnostiske tilnærming.
Til tross for deres mulige betydning er CTCs fortsatt gjenstand for stor debatt blant forskning, hovedsakelig på grunn av deres sjeldenhet (1-10 celler/mL perifert blod11). Gjeldende flytende biopsi metoder bruker en begrenset mengde blod (dvs., 1-30 mL)12,13, men dette skaper en situasjon suboptimal følsomhet for gjenkjenning av CTCs. Derfor, forskning er garantert å finne tilnærminger og utvikle enheter å utføre CTC målrettede flytende biopsi på et større volum av perifert blod.
En alternativ enhet, en functionalized medisinske wire (se Tabell for materiale), er blitt bebygget å overvinne blod prøvetaking begrensninger og få et mer representativt analyse av CTCs. Denne functionalized wire er CE godkjent medisinsk utstyr som fanger CTCs direkte fra blodet kreft pasienter1. Det består av en 16-cm lange rustfritt stål wire (figur 1a) med 2-cm lange functionalized tips belagt med et 0,2 µm tykke lag av gull. Laget blir igjen dekket av en 1-5 µm tykke polycarboxylate hydrogel stratum covalently kombinert med antistoffer rettet mot EpCAM, en av de mest uttrykt antigener på overflaten av CTCs14. Functionalized spissen av ledningen er innført i en blodåre armen pasienten og forblir i posisjon for minst 30 min. Denne fremgangsmåten lar isolering av CTCs i vivo, direkte i perifert blod og skjermen ca 1,5 til 3,0 L blod (ca 300-fold mer enn brukes for alternative tilnærminger)1.
Pantel et al. vist effekten av denne tilnærmingen hjelpe CTCs direkte i armen vener lunge kreft pasienter15. De utført wire immunofluorescence flekker for å identifisere CTCs bruke konvensjonelle antistoffer rettet mot EpCAM og pan-cytokeratin og CD45 for gjenkjenning av leucocyte. Ledningen ble undersøkt under en optisk fluorescens mikroskop15. Forfatterne viste at enheten klarte å isolere CTCs, men de ikke undersøke alle terapi-relaterte mål som ALK translocations.
Presentert metoden tar sikte på å identifisere mulige CTCs i NSCLC linjer på grunnlag av phenotypical parametere, f.eks, EpCAM positivitet og tilstedeværelsen av molekylære biomarkers, for eksempel ALK status (figur 1b). Denne 3 dager lange prosedyren kombinerer en functionalized wire og immunofluorescence flekker med DNA fluorescens -på plass-hybridisering (DNA fisk), kalt Immuno-DNA-fisk. At CTCs er sjeldne enheter, er fordelen med denne protokollen at CTCs kan være preget på samme ledning både immunophenotypic funksjoner og DNA rearrangements.
Protocol
1. Immuno-DNA fisk på en 2D dekkglassvæske
- Dekkglassvæske forberedelse og tilhenger celle såing
Merk: Utføre alle følgende under laminær strømning hette i sterile forhold.- Legg til dekkglassvæske til 100% etanol å desinfisere dem.
Merk: Vi bruker 12 mm × 12 mm silikon-støttet kvadrerte coverslips (reagenser er oppført i Tabellen for materiale). - Sett coverslips i en Petriskål (100 mm diameter). Tørr bruker tvunget luftstrøm for 5 min.
- Vask Petriskål med 15 mL steril 1 × Dulbecco fosfat bufret saltvann (PBS).
- Vask Petriskål med 10 mL av komplett medium (se tabell 1).
- Frø tilhenger celler (ca 1,650,000 celler i 10 mL av medium, telt av FACS analyse) ved å forsiktig slippe celle suspensjon på Petriskål hente uniform celle plating (ca 30.000 celler/cm2).
Merk: For ~ 70% samløpet, tilhenger celler skal kultivert på coverslips for minst 48 timer.
- Legg til dekkglassvæske til 100% etanol å desinfisere dem.
- Fiksering og permeabilization
FORSIKTIG: Aceton er en brannfarlig og irriterende flyktige stoff. Bruk bare aceton-motstandsdyktig plast eller Glassbeholdere (uten PVC eller PVDF).
Merk: Disse trinnene under kjemiske avtrekksvifte.- Fjerne kultur mediet bruker en engangs aspirating pipetter.
- Vask Petriskål med 1 × PBS.
- Ved hjelp av pinsett, vask coverslips av dyppe dem i et glass beaker inneholder 5 mL 1 × PBS.
- Tørr coverslips på blotting papir.
- Fastsette cellene på dekkglassvæske ved leve det i en 100% aceton løsning for 10 min ved romtemperatur (RT).
- Fjerne dekkglassvæske av pinsett. Tørr dekkglassvæske bruker en tvunget luftstrøm for 5 min.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet. Dekkglassvæske bør lagres ved 20 ° C.
- Immunofluorescence dag 1
Merk: Dette trinnet involverer en overnatting (O/N) inkubering (~ 16 h).- Vask coverslips 1 × PBS to ganger.
- Slipp 100 µL av antistoff fortynning buffer (se tabell 1 for detaljer) på dekkglassvæske og Inkuber i 30 min på RT.
Merk: Løsning volumet skal justeres på grunnlag av dekkglassvæske overflaten for å dekke hele dekkglassvæske og unngå overflyt. - Klargjør antistoff blandingen (tabell 1) ved hjelp av en 1:20 fortynning av monoklonale primære antistoff konjugert med fluorochrome og antistoff fortynning buffer, som angitt i dataarket leveres av produsenten.
Merk: Det anbefales sterkt å bruke monoklonale antistoffer konjugert med thermostable fluorochrome. Hvis en ikke-thermostable fluorochrome, kan temperaturen utnyttet under DNA-fisk trinnene av protokollen skade fluorochrome og slukke fluorescerende utslippene. I denne protokollen, vi valgte en EpCAM-FITC-antistoff (1:20 fortynning), som ikke viser noen vesentlige problemer med utnyttet temperatur. - Skyll coverslips to ganger i 1 × PBS.
- Plasser coverslips celle-side opp i et fuktig kammer og slipp 100 µL av antistoff miksen på dekkglassvæske.
Merk: Løsning volumet skal justeres på grunnlag av dekkglassvæske overflaten til å dekke hele dekkglassvæske og redusere risikoen for overflyt. - Inkuber O/N (~ 16 h) i mørket på 4 ° C.
- Immunofluorescence dag 2
- Blokkere antistoff inkubasjon ved å vaske coverslips 1 × PBS to ganger.
Merk: Lagre coverslips midt i 100 µL av 1 × PBS på 4 ° C i et kammer med konstant fuktig miljø i mørket før fisk analysen er utført.
- Blokkere antistoff inkubasjon ved å vaske coverslips 1 × PBS to ganger.
- 2D DNA-fisk dag 2
FORSIKTIG: Spesiell oppmerksomhet må betales til den høye temperaturen på instrumenter og fuktig chamber.- Angi hybridisering ovnen og tørr varme ovnen (~ 3 h før DNA-fisk protokollen). Angi hybridisering ovnen ved 75 ° C, angi tørr varme ovnen ved 37 ° C og kule 0,4 × SSC løsningen (pH = 7.0 ± 0.1) (se tabell 1for SSC oppskrift) til 4 ° C.
Merk: pH statusen fisk buffere er kritisk: pH = 7.0 ± 0.1. - Vask dekkglassvæske tre ganger i iskalde 0,4 × SSC løsning.
- Tørr dekkglassvæske under kjemiske avtrekksvifte i 10 min i mørket.
- Vortex for 10 s og utføre en rask spinn ned (med maksimal hastighet) av sonden fra veggen av sonden-rør.
- Plass dekkglassvæske celle-siden på en dråpe 5 µL av fisk sonde på et lysbilde og sel alle kanter av dekkglassvæske med gummi sement.
FORSIKTIG: De neste to trinnene omfatter høye temperaturer. Bruk vernehansker. - Sette lysbildet i en mørke fuktige kammer i hybridisering ovnen i 8 min ved 75 ° C i fullstendig DNA rødsprit.
- Flytte fuktig kammeret i tørr varme ovnen på 37 ° C O/N.
- Angi hybridisering ovnen og tørr varme ovnen (~ 3 h før DNA-fisk protokollen). Angi hybridisering ovnen ved 75 ° C, angi tørr varme ovnen ved 37 ° C og kule 0,4 × SSC løsningen (pH = 7.0 ± 0.1) (se tabell 1for SSC oppskrift) til 4 ° C.
- 2D DNA-fisk dag 3
- Angi vannbad ved 72 ° C og Plasser en lysbilde-flekk krukke med 0,4 × SSC buffer i det (tabell 1). Etter 30 min, Kontroller temperaturen på 0.4 × SSC bufferen, som må være på 72 ± 1 ° C.
- Forberede glass kanner: med 2 × SSC + 0,05% mellom buffer (pH = 7.0 ± 0.1) (tabell 1) og en andre med destillert vann.
- Fjerne fuktig kammeret fra ovnen, nøye fjerne gummi sement fra lysbildet og koble til dekkglassvæske med pinsett.
- Vask dekkglassvæske av dipping 0,4 × SSC i 2 minutter på 72 ° C.
- Vask dekkglassvæske av dipping i 2 × SSC + 0,05% mellom bufferen for 30 s.
- Skyll dekkglassvæske i destillert vann.
- Tørr coverslips under kjemiske avtrekksvifte i 10 min i mørket.
- Montere dekkglassvæske i flytende montering medium med 1,5 µg/mL 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til counterstain totale DNA. Plasser den dekkglassvæske celle-siden ned på en dråpe 5 µL av montering medium på et lysbilde, trykk pinsett på dekkglassvæske å få luft ut, og forsegle med neglelakk.
Merk: Montering middels volum skal justeres basert på størrelsen på dekkglassvæske overflaten.
- 2D mikroskop observasjon og analyse
Merk: Bilder kan erverves med forskjellige mikroskop systemer.
- Hente bilder med en 12-biters digital kamera og 20 × / 0,50 NA og 40 × / 0,65 NA målet med passende filtre for rød (eksitasjon: 599 nm, utslipp: 588 nm), grønn (eksitasjon: 509, utslipp: 524), og blå (eksitasjon: 367 nm, utslipp: 452 nm) sonder.
- Analysere bilder ved hjelp av Programvareverktøyet av valget.
Merk: For å evaluere den immunofluorescence flekker og den ALK-sonde lokaliseringen, vi brukte ImageJ. Lysbilder kan lagres på 20 ° C i mørket maksimalt 3 uker. For langvarig lagring foreslår vi bruke bestemte montering medium for langtidslagring.
2. Immuno-DNA fisk på Wire
- Cellen spike linjeinngang på wire (3D støtte)
Merk: Foreløpig oppsett involverer en nøyaktig utvalg av tilhenger celler linjer basert på EpCAM-positivitet. Ledningen er functionalized med anti-EpCAM antistoffer slik at bare EpCAM-positive celler er farget.
Merk: Ikke berør den functionalized delen av å unngå noen skade.
Merk: Alle trinn gjennomføres under laminær strømning hette i sterile forhold.- Resuspend hele innholdet av en MT75 kolbe (80% samløpet) i 5 mL ampuller med 4 mL komplett medium; for en enkelt pigg, er rundt 2.000.000 celler anbefalt å maksimere celler vedheft til ledningen.
- Fjerne ledningen fra emballasjen glass.
- Dukkert functionalized gull delen av ledningen inn i ampullen, at wire-stopperen er en vanntett passer for ampullen. Forsegle med laboratoriet film.
Merk: Bruk av 5 mL tube anbefales å tillate en riktig match mellom wire-stopperen og ampullen. - Inkuber i 30 min på RT i et rør rotator (0-120 vinkel).
- Skyll ledningen tre ganger i 1 × PBS løsning med 3 ulike ren ampuller.
- Fiksering og permeabilization
FORSIKTIG: Aceton er en brennbar substans som kan irritere luftveiene. Bare bruk aceton-motstandsdyktig plast eller Glassbeholdere (uten PVC eller PVDF).
Merk: Disse trinnene under kjemiske avtrekksvifte.- Air-Dry ledningen.
- Fastsette cellene av dipping ledningen i aceton 100% løsning for 10 min på RT. Bruk en 5 mL tube.
Merk: Wire-stopperen må ikke komme i kontakt med bindemiddel. - Air-Dry ledningen for 5 min på RT.
Merk: Protokollen kan pauses her. Ledningen må lagres på 20 ° C. Når pakking ledningen for langvarig lagring, plassere wire-stopperen ved functionalized og nøye inn ledningen glassrør lagring, ta vare ikke for å skade functionalized spissen. Lukk lagring glasset og lagre (loddrett eller vannrett) på 20 ° C.
- Immunofluorescence dag 1
Merk: Dette trinnet involverer en O/N inkubering (~ 16 h).- Vask to ganger i 1 × PBS løsning ved hjelp av 5 mL tube.
- Inkuber ledningen i antistoff fortynning buffer for 30 min på RT bruker 5 mL tube.
- Forberede 150 µL av antistoff blanding med en fortynning av monoklonale primære antistoff konjugert med fluorochrome i antistoff fortynning buffer, som angitt i dataarket. For eksempel EpCAM-FITC antistoff ble brukt med en 1:20 fortynning.
- Bruke et p200 tips til å utføre inkubasjon som følger: trekke ut ledningen fra wire-stopperen og forsiktig sett ledningen gjennom større hullet tips. Sett den unfunctionalized enden først og langsomt dra ledningen gjennom mindre hullet til gull delen er like utenfor større hullet.
- Forsiktig slippe 150 µL av antistoff mix (for eksempel anti EpCAM_FITC antistoff 1:20 fortynnet) i spissen. For å unngå risikoen for boble dannelse, forsiktig snurre ledningen til den functionalized delen er helt nedsenket.
- Seal opp hullet tips. Innpakning laboratorium filmen rundt hullet kan hjelpe.
- Inkuber loddrett O/N (~ 16 h) i mørket på 4 ° C.
- Immunofluorescence dag 2
- Blokkere antistoff inkubasjon ved å vaske ledningen to ganger i 1 × PBS.
- Sett ledningen i sin wire-stopperen.
Merk: Butikken i 1 X PBS på 4 ° C i en 5 mL medisinglass før fisk analysen er utført.
- 3D DNA-fisk dag 2
FORSIKTIG: Spesiell oppmerksomhet må betales til høy temperatur av instrumenter og fuktig kammer.- Angi hybridisering ovnen og tørr varme ovnen (~ 3 h før DNA-fisk protokollen). Angi hybridisering ovnen ved 75 ° C, angi tørr varme ovnen ved 37 ° C og kule 0,4 × SSC løsningen (pH = 7.0 ± 0.1) til 4 ° C.
Merk: pH status fisk buffere er kritisk, og må være 7.0 ± 0.1. - Vask ledningen 3 ganger i iskalde 0,4 × SSC løsning.
Merk: Holde wire i mørket for å unngå fluorochrome photobleaching under følgende prosedyrer. - Tørr i 10 min i mørket under røyk skapet.
- Vortex og spinn sonden 5 s.
- Slippe 10 µL av sonden i theglass microtubes. Dekk med laboratoriet film.
- Spinne microtubes som følger: Pakk microtube i en tørr absorberende, papir satt i en 50-mL tube og spinne kort.
- Forsiktig plassere tørket ledningen inn i microtube og sett wire-stopperen. Forsegle med gummi sement.
FORSIKTIG: De neste to trinnene omfatter høye temperaturer.
- Angi hybridisering ovnen og tørr varme ovnen (~ 3 h før DNA-fisk protokollen). Angi hybridisering ovnen ved 75 ° C, angi tørr varme ovnen ved 37 ° C og kule 0,4 × SSC løsningen (pH = 7.0 ± 0.1) til 4 ° C.
- Sette et lysbilde flekker krukke med 0,4 × SSC løsning i et vannbad og satt på 72 ° C.
- Sjekk 0,4 × SSC løsning temperaturen til den når 72 ± 1 ° C.
- Forberede kanner for glass med 2 × SSC + 0,05% Tween (pH = 7.0 ± 0.1) løsning og den andre med destillert vann.
- Fjerne fuktig kammeret fra ovnen tørr, forsiktig fjerne gummi sement fra wire-stopperen ved hjelp av pinsett, og tar ut ledningen.
Merk: Trekk forsiktig ubestrøket slutten av ledningen gjennom IN-stopperen, være forsiktig med å skade den functionalized spissen. - Dypp wire i 0,4 × SSC løsningen i 2 minutter på 72 ° C.
- Vask ledningen i 2 × SSC + 0,05% mellom løsning for 30 s på RT.
- Vask ledningen i destillert vann på RT.
- Tørr ledningen under avtrekksvifte i 10 min i mørket.
- Utarbeide en DAPI lager løsning av 1.43 µM i 2 mL 1 × PBS.
- Inkuber functionalized spissen av ledningen med DAPI løsning i 2 mL ampuller 1t i mørket på RT.
- Skyll ledningen to ganger i 1 × PBS og air-dry.
- Plasser ledningen i wire holderen. Nøye stikk functionalized gjennom inngangspunkt av spesielle holderen, til spissen samsvarer med et koblingen punkt. Pass på at du ikke skader functionalized spissen (figur 1a).
- Den spesielle plassholder på mikroskopet scenen. Justere fokus på mikroskopet ved hjelp av en 20 × linse. Først grovt fokusere på spesielle støtte og Juster fint på celler som vises lys i DAPI-kanalen.
- Bare sette i fokus cellene sentrale linsen.
Merk: Bilder kan erverves med forskjellige mikroskop systemer. I denne innstillingen bruker vi en konvensjonell fluorescerende mikroskop utstyrt med en standard kommersiell programvare for bildeopptak. - Hente bilder med en 12-biters digital kamera og 20 × / 0,50 NA og 40 × / 0,65 NA målet med passende filtre for rød (eksitasjon: 599 nm, utslipp: 588 nm), grønn (eksitasjon: 509, utslipp: 524), og blå (eksitasjon: 367 nm, utslipp: 452 nm) sonder.
Merk: Bilder kan visualiseres ved hjelp av ulike verktøy og programvare. Vi bruker ImageJ for å evaluere immunofluorescence flekker og ALK-sonden lokalisering.
Merk: Protokollen kan pauses her. Ledningen må lagres på 20 ° C. Når pakking ledningen for langvarig lagring, plassere wire-stopperen ved functionalized og nøye inn ledningen glassrør lagring, ta vare ikke for å skade functionalized spissen. Lukk lagring glasset og lagre (loddrett eller vannrett) på 20 ° C.
Representative Results
Bruke beskrevet ovenfor det er mulig å utføre Immuno-DNA fisk analysen på CTCs (eller andre tilsvarende celler) beriket av functionalized ledningen. Før du setter opp denne protokollen, var kompatibiliteten til de to teknikkene bestemt (immuno-fluorescens med fisk) på standard 2D støtter. To forskjellige NSCLC cellelinjer uttrykke EpCAM (må overholde ledningen kombinert med antistoffer mot EpCAM) ble valgt. De har en annen ALK status, som er nyttig å teste ulike Start forhold. Først, NCI-H1975, har wild type (WT) ALK gener, mens andre, NCI-H3122, er preget av ALK translocations.
En ALK-genet nullresultat bortsett detection system for fisk analysen ble brukt. Systemet består av to sonder, en (oransje) hybridizing til det proksimale området i ALK på 2p 23 og en (grønn) hybridizing distale til ALK. På 2D støtter gitt Immuno-DNA fisk veldefinerte signaler for både antistoff og sonde (figur 2). Spesielt cellelinjer både viste veldefinerte EpCAM membran lokalisering. Videre sonde signaler dukket opp lys og skarp: NCI-H1975 celler viste overlappende oransje og grønne sonder, bekrefter wildtype status ALK-genet (figur 2a, b). Omvendt, viste NCI-H3122 celler overlappende signaler og enkelt grønne prikker, reflekterer en sletting av ALK-genet (figur 2 c, d). Når Immuno-DNA fisk analysen ble utført 3D støtter functionalized wire, antistoffer og sonde signaler generelt mindre definerte enn på 2D støtte. EpCAM flekker var synlig. ALK sonde signaler var mindre definert men fortsatt reflekterte den forventede ALK statusen (Figur 3). Resultatene viste at immunofluorescence flekker ikke forstyrre DNA fisk signaler. Sonder hybridiserte med sine mål. NCI-H3122 celle linje viste en avvikende ALK-genet status (figur 3b), i motsetning til NCI-H1975, med en vill type ALK-genet (figur 3a).
Figur 1 : Functionalized wire, skjematisk arrangement av ALK nullresultat bortsett sonder, ordningen med forventede bruksmønstre ALK omorganisering og spesielle holderen. (en) røde bokser markere tre hoveddelene i ledningen: functionalized tips, wire-stopper og un functionalized tips. Functionalized spissen er den mest delikate del av ledningen og må ikke bli rørt under håndtering for å unngå celle avdeling eller skade. (b) de grønne og røde sonder hver henholdsvis binde til sekvenser oppstrøms og nedstrøms for loci av ALK-genet (på venstre). Til høyre vises exemplificative mønstre av ALK ordninger. Rød og grønn co lokalisering signaler på normale celler; atskilt grønne og røde signaler indikerer en ALK-genet kromosom pause (translokasjon av ALK-genet) og en grønn-oransje colocalization signal (avvikende celle-1). En rød signal og to grønne signaler angir tapet av en rød signal, antyder en chromosomal translokasjon og sletting (avvikende celle-2). (c) Wire holder; røde bokser fremheve områder der behandling er nødvendig når du håndterer ledningen under mikroskopi analyse. Ledningen kan gjennomgå en 360 ° analyse ved å vri omdreiende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Immuno-DNA fisk analysen på 2D støtte (dekkglassvæske). (en, b) NCI-H1975 celler svakt positiv for EpCAM. EpCAM FITC signaler var merkbar. Oransje og grønne sonder av ALK pause-hverandre Overlappet, bekrefter WT status ALK-genet i NCIH1975 cellen linje. Celler viser mer enn to sammenkoblede signaler var til stede på grunn av deres aneuploidy. (c, d) I høy EpCAM-uttrykke NCIH3122 celle linjen var immunofluorescence signaler lyse, som ble understreket i celle-celle veikryss. FISK analyser bekreftet sletting av ALK-genet, typisk for denne cellen linje. Røde piler indikerer enkelt grønne sonder (uten tilsvarende oransje sonder), reflekterer ALK-genet sletting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immuno-DNA fisk analysen med functionalized ledningen som 3D støtte. (en) representant bilde av NCI-H1975 celler på ledningen. Selv om 3D form av cellene i ledningen gjør vanskelig å skaffe fullt ut i fokus bilder, er EpCAM signalet godt synlig i alle celler. (b) representant bilde av NCI-H3122 celler på ledningen. ALK sonder viste genet sletting (røde piler), som tidligere sett på 2D støtte. Synlig bakgrunn signalene ble sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av polymer laget. Men det ikke betydelig påvirke celle identifikasjon eller fluorescens analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Komposisjon | Merk | Aksjer |
| Cellen fullstendig kultur medium | RPMI 1640 + 2 mM glutamin + 5-10% fosterets bovin Serum (FBS). | RPMI: 4 ° C; Glutamin, FBS: 20 ° C | |
| Antistoff Diluition Buffer | 1% BSA, 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS | RT. Seal med laboratoriet film. | |
| 20 x SSC løsning | 3 M natriumklorid, 300 mM trisodium citrate oppløst i ddH20 | Filtrere løsning og pH = 7.0 +/-0,1 med HCl | RT. Seal med laboratoriet film. |
| 0,4 x SSC løsning | Fortynne lager 20 x SSC i destillert H2O | Filtrere løsning og pH = 7.0 +/-0,1 med HCl | RT. |
Tabell 1: Løsninger oppskrifter.
Discussion
I dette papiret, for første gang, en metode immunofluorescence flekker og DNA fisk, for bruk med functionalized ledningen ble foreslått. Metoden ble kalt Immuno-DNA fisk. Denne teknikken ble utviklet å tillate samtidig identifikasjon av antatte CTCs på en 3D wire på grunnlag av phenotypical parametere, for eksempel positivitet å EpCAM (hendelse 1), og å lette oppdagelsen av molekylære endringer, for eksempel ALK-genet status ( hendelse 2). Samtidige identifikasjon av to hendelser gjør påvisning av deres co lokalisering. Derfor kan denne tilnærmingen skreddersys for å identifisere og karakterisere CTCs Hentet fra blod kreftpasienter. Potensielle effekten av haemo-komponenter og leukocytter på flekker prosedyren påvirker ikke vanligvis prosedyren. Spesielt angitt data rapportert i litteraturen at haemo-komponenter og leukocytter ikke påvirker den immunofluorescence flekker av cellene knyttet til ledningen, det avgjørende skrittet å identifisere faktiske CTCs1,15.
Fluorescens lysstyrken Immuno-DNA fisk er litt mindre markert enn en tradisjonell immunophototyping analysen og er et resultat av den høye temperaturen nødvendig for fisk analysen. Men er immunofluorescence flekker fortsatt betydelige. For eksempel er et svakt signal fortsatt synlig i lav EpCAM-uttrykke celle linjen NCIH1975. Den høye temperaturen som kreves for fisk analysen er den viktigste begrensende faktoren i å velge den riktige fluorochrome knyttet til antistoffer. I denne protokollen, må antistoffer være koblet til en thermostable fluorochrome for å tåle DNA rødsprit temperaturen. For eksempel er phycoerythrin, en thermosensitive fluorochrome, ikke anbefalt i denne innstillingen på grunn av fluorochrome fornedrelse skyldes høy temperatur. Fluorescein isothiocyanate er et godt valg og ofte vanlig fluorochrome ansatt på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescence signalet er svært dårlig på standard 2D støtter. På wire støtte, kan polymer laget indusere en liten autofluorescence signal, spesielt på den røde kanalen. I motsetning til 2D bakgrunnen, et aspecific bakgrunn signal merkbar på ledningen, men påvirker ikke betydelig kjerner identifikasjon eller cellen karakterisering.
Mikroskopet evaluering av ledningen er mye mer fatiguing enn på en 2D støtte på grunn av grensene for en optisk mikroskop lese overflaten av en sylindriske-formet 3D struktur. Men kan dette problemet overvinnes ved roterende wire holderen og anskaffe bildene som er hovedsakelig lokalisert langs midtlinjen av ledningen. Wire abonnenten tillater en 360 ° rotasjon av ledningen. Når fokusert på kjerner, holde endrer fluorescens kanaler ikke nødvendigvis fokus på målet. Derfor er det viktig å opprettholde fokus på indre-celle målområdet.
Denne teknikken kan skreddersys for å oppdage og karakterisere celler i forskjellige typer 3D støtter. Det kan også være mulig å bruke forskjellige antistoffer og FISH sonder. Når du velger å bruke ulike antistoffer, er fluorochrome thermostability og det uttrykket målet antigen på cellemembranen viktige faktorer å vurdere. Intra-cytoplasmatic antigener kan også være farget. Når bruker ulike fisk sonder, er det viktig å sjekke dataarket spesifikasjonene for rødsprit prosedyren og forberede celler FISKEN analysen tilsvarende.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
| Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
| Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
| RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
| Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
| RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
| H20 | MilliPore | ||
| XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
| DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
| EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
| Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
| Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
| STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
| SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
| ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
| Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
| Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).
- Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
- Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).
- Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
- Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
- Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
- Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
- Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
