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Cancer Research

ट्यूमर कोशिकाओं परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए एक चिकित्सा तार का उपयोग कर के लक्षण वर्णन: एक 3 डी दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डीएनए मछली पर आधारित

doi: 10.3791/56936 Published: December 21, 2017

Summary

हम ट्यूमर कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं । हम डीएनए फ्लोरोसेंट के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस संयुक्त-में-सीटू-संकरण रोगी रक्त से सीधे CTCs को समृद्ध करने में सक्षम एक कार्यात्मक चिकित्सा तार द्वारा कब्जा कर लिया कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए.

Abstract

परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) मेटास्टेटिक कैंसर में गरीब अस्तित्व के साथ जुड़े रहे हैं । उनकी पहचान, phenotyping, और genotyping ट्यूमर विविधता की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व और इस तरह व्यक्तिगत उपचार के लिए रोगियों के चयन की सुविधा हो सकती है । हालांकि, इस CTCs की दुर्लभ वस्तु की वजह से बाधा है । हम रोगी रक्त की एक उच्च मात्रा नमूना और उपस्थिति, phenotype, और CTCs के जीन translocation के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं । विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए फ्लोरोसेंट-में-सीटू-संकरण (डीएनए मछली) को जोड़ती है और एक कार्यात्मक चिकित्सा तार पर आधारित है । इस तार परिधीय रक्त की एक बड़ी मात्रा से CTCs के vivo में अलगाव की अनुमति देता है कि एक अभिनव डिवाइस है. रक्त की मात्रा तार के 30 min प्रशासन द्वारा दिखलाई पड़ती है लगभग 1.5-3 L इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) अभिव्यक्ति और ALK जीन के गुणसूत्र translocation गैर में निर्धारित किया गया छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) कार्यात्मक तार द्वारा कब्जा कर लिया सेल लाइनों और एक bliss-डीएनए मछली दृष्टिकोण के साथ सना हुआ । हमारी मुख्य चुनौती के लिए एक 3d संरचना पर परख प्रदर्शन किया गया, कार्यात्मक तार, और bliss निर्धारित करने के लिए इस समर्थन पर phenotype और मछली संकेतों एक पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । परिणाम प्राप्त संकेत मिलता है कि CTCs को पकड़ने और उनके phenotype और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था का विश्लेषण संभवतः एक नया साथी नैदानिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते है और व्यक्तिगत कैंसर उपचार में सुधार के लिए एक अभिनव रणनीति प्रदान कर सकता है ।

Introduction

CTCs कैंसर कोशिका प्रसार1के एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं । रोगियों के परिधीय रक्त में उनकी उपस्थिति (मेटास्टेटिक) पतन और रोग प्रगति2,3के साथ जुड़ा हुआ है । सीटीसी अलगाव और कैंसर के रोगियों के रक्त से लक्षण वर्णन गैर इनवेसिव तरल बायोप्सी का एक प्रकार है । हाल के वर्षों में, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि निगरानी प्रगति और ट्यूमर की प्रतिक्रिया इस तरह के विश्लेषण का उपयोग करने के लिए विभिन्न उपचार के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक जानकारी4प्रदान करता है,5. जब शल्य चिकित्सा व्यवहार्य नहीं है या प्राथमिक ट्यूमर ऊतक उपलब्ध नहीं है जब तरल बायोप्सी और भी अधिक उपयोगी है, यानी, गैर-biopsiable घावों के लिए. इसलिए, इस दृष्टिकोण मेटास्टेटिक NSCLC, जहां CTCs की उपस्थिति के लिए एक नकारात्मक शकुन भूमिका है दिखाया गया है जैसे विशिष्ट कैंसर सेटिंग्स में होनहार है6। NSCLC एक ट्यूमर है कि विशेष रूप से लक्षित चिकित्सकीय दृष्टिकोण7,8,9 विशिष्ट अणुओं (आणविक लक्ष्य) को विकास, प्रगति में शामिल होने के लिए जाना जाता है पर कार्य करने के लिए डिज़ाइन से लाभ है, और बीमारी का फैलाव । इसलिए, रोग प्रगति के दौरान विशिष्ट लक्ष्यों का पता लगाने की जरूरत है । सीटीसी जांच प्राथमिक या मेटास्टेटिक ऊतकों की आवश्यकता के बिना दवा के लक्ष्य का पता लगाने और निगरानी करने के लिए एक अत्यंत दिलचस्प नैदानिक दृष्टिकोण है । उदाहरण के लिए, NSCLC कोशिकाओं में ALK जीन अनुवादन का पता लगाने crizotinib के लिए संवेदनशीलता के साथ जुड़ा हुआ है, एक विशिष्ट लक्षित थेरेपी10. हालांकि, वर्तमान में, ALK अनुवादन का पता लगाने केवल ठीक सुई tracheal या छोटे बायोप्सी पर मार डाला है; एक परिणाम के रूप में, एक ट्यूमर ऊतक ALK विश्लेषण के बिना संभव नहीं है । CTCs ट्यूमर ऊतक के लिए एक संभावित विकल्प आधारित जांच कर रहे है और एक उच्च होनहार साथी नैदानिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

उनके संभावित महत्व के बावजूद, CTCs अभी भी अनुसंधान के बीच बड़ी बहस का विषय है, मुख्य रूप से उनके दुर्लभ कारण (1-10 कोशिकाओं परिधीय रक्त के11/ वर्तमान तरल बायोप्सी तरीके रक्त की एक सीमित मात्रा में (अर्थात, 1-30 मिलीलीटर)12,13का उपयोग करें, लेकिन यह CTCs का पता लगाने के लिए उपइष्टतम संवेदनशीलता की स्थिति पैदा करता है । इसलिए, अनुसंधान खोजने के लिए वारंट है दृष्टिकोण और उपकरणों के विकास के परिधीय रक्त की एक बड़ी मात्रा पर सीटीसी-लक्षित तरल बायोप्सी प्रदर्शन करने के लिए ।

एक वैकल्पिक उपकरण, एक कार्यात्मक चिकित्सा तार ( सामग्री की तालिकादेखें), रक्त नमूना सीमाओं पर काबू पाने और CTCs के एक अधिक प्रतिनिधि विश्लेषण प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है । इस कार्यात्मक तार एक CE-अनुमोदित चिकित्सा उपकरण है कि कैंसर रोगियों के खून से सीधे CTCs कब्जा है1. यह एक 16 सेमी लंबे स्टेनलेस स्टील के तार से बना है (चित्र 1a) एक 2-सेमी लंबी कार्यात्मक टिप के साथ लेपित सोने की एक ०.२-µm मोटी परत के साथ । परत एक 1 से 5 µm-मोटी polycarboxylate hydrogel परत द्वारा कवर में है EpCAM के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी के साथ युग्मित covalently, एक सबसे व्यापक रूप से व्यक्त एंटीजन की सतह पर CTCs14। तार के कार्यात्मक टिप रोगी की बांह की एक नस में शुरू की है और कम से कम 30 मिनट के लिए स्थिति में रहता है । इस दृष्टिकोण vivo में CTCs के अलगाव की अनुमति देता है, सीधे परिधीय रक्त में, और के बारे में स्क्रीन करने के लिए 1.5-3.0 रक्त के एल (लगभग ३००-गुना अधिक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया मात्रा)1.

पैंटेल एट अल. CTCs को अलग करने में इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का प्रदर्शन सीधे फेफड़ों के कैंसर के रोगियों के हाथ नसों में15। वे EpCAM और पान-cytokeratin के खिलाफ निर्देशित पारंपरिक एंटीबॉडी का उपयोग CTCs की पहचान करने के लिए तार इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन किया, और CD45 का पता लगाने के लिए leucocyte. इस तार की जांच एक ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी15के तहत की गई थी । लेखकों ने दिखा दिया कि डिवाइस को CTCs से अलग करने में सक्षम था, लेकिन उन्होंने किसी भी थेरेपी से संबंधित लक्ष्य की जांच नहीं की, जैसे ALK अनुवादन ।

प्रस्तुत विधि का उद्देश्य phenotypical मापदंडों के आधार पर NSCLC कोशिका रेखाओं में ख्यात CTCs की पहचान करना है, जैसे, EpCAM धनात्मकता और आणविक उपमार्कों की उपस्थिति, मसलन ALK स्थिति (चित्र 1b). यह 3 दिन लंबी प्रक्रिया एक कार्यात्मक तार को जोड़ती है और डीएनए प्रतिदीप्ति के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला-में-सीटू-संकरण (डीएनए मछली), नाम bliss-डीएनए-मछली । यह देखते हुए कि CTCs दुर्लभ संस्थाओं हैं, इस प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि CTCs दोनों immunophenotypic सुविधाओं और डीएनए पुनर्व्यवस्थाओं के मामले में एक ही तार पर विशेषता हो सकती है ।

Protocol

1. bliss-एक 2d Coverslip पर डीएनए मछली

  1. Coverslip वडा र अनुयाई सेल सीडिंग
    नोट: बाँझ स्थितियों में एक लामिना प्रवाह हुड के तहत सभी निम्न चरणों का पालन करें ।
    1. उंहें विसंक्रमित करने के लिए १००% इथेनॉल में coverslip विसर्जित कर दिया ।
      नोट: हम 12 मिमी × 12 मिमी सिलिकॉन समर्थित स्क्वायर्ड coverslips का उपयोग करें (सभी एजेंट सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं) ।
    2. coverslips को पेट्री डिश में रखें (१०० mm व्यास) । 5 मिनट के लिए मजबूर हवा के प्रवाह का उपयोग कर सूखी ।
    3. 15 मिलीलीटर बाँझ 1 × Dulbecco के फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ पेट्री पकवान धो लो ।
    4. पेट्री डिश को पूरे मध् यम के 10 मिलीलीटर से धोएं ( 1 तालिकादेखें) ।
    5. बीज अनुयाई कोशिकाओं (लगभग १,६५०,००० कोशिकाओं के माध्यम से 10 मिलीलीटर में, FACS विश्लेषण द्वारा गिना) धीरे पेट्री डिश पर सेल निलंबन छोड़ने के लिए वर्दी सेल चढ़ाना प्राप्त (के बारे में ३०,००० कोशिकाओं/
      नोट: ~ ७०% संगम के लिए, अनुयाई कोशिकाओं को कम से ४८ h के लिए coverslips पर कल्चरित किया जाना चाहिए ।
  2. निर्धारण और permeabilization
    चेतावनी: एसीटोन एक ज्वलनशील और परेशान अस्थिर पदार्थ है । केवल एसीटोन प्रतिरोधी प्लास्टिक या ग्लास कंटेनर (कोई पीवीसी या PVDF) का उपयोग करें ।
    नोट: एक रासायनिक धुएं हुड के तहत इन चरणों का प्रदर्शन ।
    1. एक डिस्पोजेबल aspirating प्लास्टिक का उपयोग कर संस्कृति मध्यम निकालें ।
    2. 1 × पंजाबियों के साथ पेट्री डिश धो लो ।
    3. चिमटी का प्रयोग करके, coverslips को 1 × पंजाबियों के 5 मिलीलीटर युक्त एक गिलास चोंच में डूबा कर धो लें ।
    4. coverslips को सोख्ता कागज पर सुखाएं ।
    5. कक्ष तापमान (RT) पर 10 मिनट के लिए एक १००% एसीटोन समाधान में डुबोकर coverslip पर कोशिकाओं को ठीक करें ।
    6. चिमटी से coverslip निकालें । सूखी coverslip 5 मिनट के लिए एक मजबूर हवा के प्रवाह का उपयोग कर ।
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है । coverslip-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस Day 1
    नोट: इस चरण में एक रात (O/N) मशीन (~ 16 एच) शामिल है ।
    1. 1 × पंजाब में coverslips दो बार धो लो ।
    2. ड्रॉप १०० एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर के µ एल (विवरण के लिए 1 तालिका देखें) पर coverslip और आर टी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: समाधान मात्रा coverslip सतह के आधार पर पूरे coverslip कवर और ओवरफ्लो के खतरे से बचने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
    3. एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें (तालिका 1) fluorochrome और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर के साथ मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के एक 1:20 कमजोर पड़ने का उपयोग कर, के रूप में निर्माता द्वारा प्रदान की डेटापत्रक में निर्दिष्ट ।
      नोट: यह दृढ़ता से thermostable fluorochrome के साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग करने की सलाह दी है । यदि एक गैर thermostable fluorochrome प्रयोग किया जाता है, तापमान प्रोटोकॉल के डीएनए मछली कदम के दौरान उपयोग fluorochrome को नुकसान पहुंचा सकता है और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को बुझाने । इस प्रोटोकॉल में, हम एक EpCAM-FITC एंटीबॉडी (1:20 कमजोर पड़ने), जो उपयोग तापमान के साथ कोई महत्वपूर्ण समस्या नहीं दिखा था के लिए चुना है ।
    4. 1 × पंजाबियों में दो बार coverslips कुल्ला ।
    5. प्लेस coverslips सेल-एक आर्द्र कक्ष में ऊपर की ओर और coverslip पर एंटीबॉडी मिश्रण के १०० µ एल ड्रॉप ।
      नोट: समाधान मात्रा coverslip सतह के आधार पर पूरे coverslip कवर और ओवरफ़्लो के जोखिम को कम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
    6. 4 ° c पर अंधेरे में (~ 16 एच) गर्मी ओ/
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस Day 2
    1. ब्लॉक 1 × पंजाब में दो बार coverslips धुलाई द्वारा एंटीबॉडी मशीन ।
      नोट: दुकान अंधेरे में लगातार आर्द्र वातावरण के साथ एक कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 × पंजाबियों के १०० µ l में डूबे coverslips जब तक मछली परख किया जाता है ।
  5. 2d डीएनए-मछली दिवस 2
    सावधानी: विशेष ध्यान उपकरणों और आर्द्र चैंबर के उच्च तापमान के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ।
    1. संकरण ओवन और सूखी गर्मी ओवन सेट (~ 3 एच डीएनए-मछली प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले) । ७५ ° c पर संकरण ओवन सेट, ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूखी गर्मी ओवन सेट और ०.४ × एसएससी समाधान (पीएच = ७.० ± ०.१) शांत (SSC recipe के लिए तालिका 1देखें) 4 ° c.
      नोट: मछली बफ़र्स की पीएच स्थिति महत्वपूर्ण है: ph = ७.० ± ०.१ ।
    2. धो coverslip तीन बार बर्फ में ठंडा ०.४ × एसएससी समाधान ।
    3. अंधेरे में 10 मिनट के लिए एक रासायनिक धुएं हुड के तहत coverslip सूखी ।
    4. 10 एस के लिए भंवर और एक त्वरित नीचे स्पिन प्रदर्शन (अधिकतम दर पर) जांच की दीवार से ट्यूब ।
    5. एक स्लाइड पर मछली जांच के 5 µ एल की एक बूंद पर नीचे coverslip सेल साइड प्लेस और रबर सीमेंट के साथ coverslip के सभी किनारों को सील ।
      चेतावनी: अगले दो कदम उच्च तापमान शामिल है । सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें ।
    6. पूरा डीएनए विकार के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए संकरण ओवन में एक अंधेरे आर्द्र कक्ष में स्लाइड रखो ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूखी गर्मी ओवन में आर्द्र कक्ष ले जाएं ओ एन/
  6. 2 डी डीएनए-मछली दिवस 3
    1. ७२ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान सेट और इसे में ०.४ × एसएससी बफर के साथ एक स्लाइड धुंधला जार जगह (तालिका 1) । 30 मिनट के बाद, ०.४ × एसएससी बफर, जो ७२ ± 1 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए के तापमान की जांच करें ।
    2. दो ग्लास यूरिन तैयार करें: 2 × SSC + ०.०५% के बीच बफर (pH = ७.० ± ०.१) (तालिका 1) और आसुत जल के साथ एक दूसरे से एक ।
    3. नमी वाले चैम्बर को ओवन से निकालें, ध्यान से रबर सीमेंट को स्लाइड से निकाल कर coverslip को चिमटी से अलग करें ।
    4. ७२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ०.४ × एसएससी में सूई से coverslip धो लो ।
    5. 2 × SSC में सूई से coverslip धो लो + ०.०५% के बीच बफर 30 एस के लिए
    6. आसुत जल में coverslip कुल्ला ।
    7. अंधेरे में 10 मिनट के लिए एक रासायनिक धुएं हुड के तहत coverslips सूखी ।
    8. माउंट coverslip तरल बढ़ते मध्यम में १.५ µ g/एमएल 4 ´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ counterstain कुल डीएनए । एक स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 5 µ एल की एक बूंद पर coverslip सेल-साइड नीचे रखें, हवा बाहर निकलने के लिए coverslip पर चिमटी दबाएँ, और नेल पॉलिश के साथ सील.
      नोट: बढ़ते मध्यम मात्रा coverslip सतह के आकार के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए ।
  7. 2 डी माइक्रोस्कोप अवलोकन और विश्लेषण
    नोट: छवियां विभिंन माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ प्राप्त किया जा सकता है ।
हम छवि अधिग्रहण (सामग्री की तालिका) के लिए एक मानक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ संपंन एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया ।
  1. एक 12-bit डिजिटल कैमरा और 20 ×/0.50 na और 40 ×/0.65 ना उद्देश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ लाल (उत्तेजना: का उपयोग कर छवियां प्राप्त करें ५९९ एनएम, उत्सर्जन: ५८८ एनएम), ग्रीन (उत्तेजना: ५०९, उत्सर्जन: ५२४), और नीले (उत्तेजना: ३६७ एनएम, उत्सर्जन: ४५२ एनएम) जांच ।
  2. पसंद का सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग छवियों का विश्लेषण ।
    नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और ALK-जांच स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए, हम ImageJ का इस्तेमाल किया । स्लाइड 3 सप्ताह की अधिकतम के लिए अंधेरे में-20 ° c में संग्रहित किया जा सकता है । लंबे समय तक भंडारण के लिए, हम दीर्घकालिक भंडारण के लिए विशिष्ट बढ़ते माध्यम का उपयोग करने का सुझाव है ।

2. bliss-डीएनए वायर पर मछली

  1. सेल लाइन स्पाइक में तार पर (3 डी समर्थन)
    नोट: प्रारंभिक सेट-अप अनुयाई कोशिकाओं EpCAM-धनात्मकता के आधार पर लाइनों की एक सटीक चयन शामिल है । तार विरोधी EpCAM एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक है ताकि केवल EpCAM-सकारात्मक कोशिकाओं दाग रहे हैं ।
    नोट: किसी भी क्षति से बचने के लिए तार के कार्यात्मक हिस्सा स्पर्श न करें ।
    नोट: सभी कदम बाँझ स्थितियों में एक लामिना प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए ।
    1. एक 5 मिलीलीटर की शीशी में एक T75 कुप्पी (८०% संगम) की पूरी सामग्री को फिर से सस्पेंड करें 4 मिलीलीटर का उपयोग पूर्ण माध्यम से; एक एकल स्पाइक के लिए में, के बारे में २,०००,००० कोशिकाओं को तार करने के लिए आसंजन कोशिकाओं को अधिकतम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।
    2. इसके शीशे की पैकेजिंग से वायर को हटा दें ।
    3. शीशी में तार के कार्यात्मक सोने का हिस्सा डुबकी, यह सुनिश्चित करना है कि तार डाट शीशी के लिए एक निर्विवाद फिट है । प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील ।
      नोट: 5 एमएल ट्यूब का उपयोग तार डाट और शीशी के बीच एक सही मैच के लिए अनुमति देने के लिए सिफारिश की है ।
    4. आरटी में एक ट्यूब रोटेटर (0-120 कोण) में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    5. तार कुल्ला 1 × पंजाबियों समाधान 3 अलग साफ शीशियों का उपयोग में तीन बार ।
  2. निर्धारण और permeabilization
    सावधानी: एसीटोन एक ज्वलनशील पदार्थ है जो श्वसन तंत्र को परेशान कर सकता है । केवल एसीटोन प्रतिरोधी प्लास्टिक या ग्लास कंटेनर (कोई पीवीसी या PVDF) का उपयोग करें ।
    नोट: एक रासायनिक धुएं हुड के तहत इन चरणों का प्रदर्शन ।
    1. हवा-तार सूख गया ।
    2. एसीटोन में तार सूई के लिए १००% समाधान पर 10 मिनट के लिए RT. a 5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें ।
      नोट: तार-डाट कर निर्धारण के संपर्क में नहीं आना चाहिए.
    3. एयर-आरटी पर 5 मिनट के लिए तार सूखी
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । तार-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । जब लंबी अवधि के भंडारण के लिए तार पैकिंग, जगह तार-डाट कार्यात्मक टिप के बगल में है और ध्यान से भंडारण ग्लास ट्यूब में तार डालने, ध्यान कार्यात्मकता टिप को नुकसान नहीं ले । -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण कांच और दुकान (खड़ी या क्षैतिज) बंद करें ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस Day 1
    नोट: इस चरण में एक O/N मशीन (~ 16 एच) शामिल है ।
    1. 1 × पंजाबियों समाधान में दो बार धो 5 एमएल ट्यूब का उपयोग कर ।
    2. आरटी में 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में तार मशीन 5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर ।
    3. एंटीबॉडी मिश्रण के १५० µ एल संयुग्मित कमजोर पड़ने बफर में fluorochrome के साथ मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी एंटीबॉडी के एक कमजोर पड़ने के साथ तैयार, के रूप में डेटा पत्रक में निर्दिष्ट । उदाहरण के लिए, EpCAM-FITC एंटीबॉडी एक 1:20 कमजोर पड़ने के साथ प्रयोग किया जाता था ।
    4. एक p200 टिप का प्रयोग करने के लिए मशीन प्रदर्शन, के रूप में इस प्रकार है: तार डाट से तार निकालने और धीरे टिप के बड़े छेद के माध्यम से तार डालें । पहले कार्यात्मक अंत डालें और धीरे छोटे छेद के माध्यम से तार खींच जब तक सोने का हिस्सा सिर्फ बड़ा छेद से परे है ।
    5. धीरे एंटीबॉडी मिश्रण के १५० µ एल ड्रॉप (उदाहरण के लिए विरोधी EpCAM_FITC एंटीबॉडी 1:20 पतला) टिप में । बुलबुला गठन के जोखिम से बचने के लिए, धीरे कार्यात्मक हिस्सा पूरी तरह से गिर गया है जब तक तार घुमाव ।
    6. टिप के छेद को सील । छेद के आसपास प्रयोगशाला फिल्म लपेट मदद कर सकते हैं ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में खड़ी O/N (~ 16 एच) की मशीन ।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस day 2
    1. ब्लॉक 1 × पंजाबियों में दो बार तार धोने से एंटीबॉडी मशीन ।
    2. फिर से तार को उसके तार-डाट में डालें.
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब में एक 5 मिलीलीटर की शीशी में स्टोर जब तक मछली परख किया जाता है ।
  5. 3 डी डीएनए-मछली दिवस 2
    सावधानी: विशेष ध्यान उपकरणों और आर्द्र चैंबर के उच्च तापमान के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ।
    1. संकरण ओवन और सूखी गर्मी ओवन सेट (~ 3 एच डीएनए-मछली प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले) । ७५ डिग्री सेल्सियस पर संकरण ओवन सेट, ३७ डिग्री सेल्सियस पर सूखी गर्मी ओवन सेट, और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ०.४ × एसएससी समाधान (पीएच = ७.० ± ०.१) शांत ।
      नोट: मछली बफ़र्स की पीएच स्थिति महत्वपूर्ण है और होना चाहिए ७.० ± ०.१ ।
    2. धो तार 3 बार बर्फ ठंड ०.४ × एसएससी समाधान में ।
      नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं के दौरान fluorochrome photobleaching से बचने के लिए तार को अंधेरे में रखें ।
    3. धुएं अलमारी के नीचे अंधेरे में 10 मिनट के लिए सूखी ।
    4. भंवर और स्पिन 5 एस के लिए जांच ।
    5. theglass microtubes में जांच के 10 µ एल ड्रॉप । प्रयोगशाला फिल्म के साथ कवर ।
    6. स्पिन microtubes के रूप में इस प्रकार है: एक सूखे शोषक में microtube लपेटें, कागज एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया, और संक्षेप में स्पिन ।
    7. ध्यान से सूखे तार को microtube में रखें और तार-डाट डालें । रबर सीमेंट के साथ सील ।
      चेतावनी: अगले दो कदम उच्च तापमान शामिल है ।
सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें ।
  • ७५ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए संकरण ओवन में एक अंधेरे आर्द्र कक्ष में तार रखो पूरा डीएनए विकार प्राप्त करने के लिए ।
  • आर्द्र कक्ष में एक सूखी गर्मी ओवन में ले जाएं ३७ ° c O/N ।
  • 3 डी डीएनए-मछली दिवस 3
    1. एक पानी स्नान में ०.४ × एसएससी समाधान के साथ एक स्लाइड धुंधला जार रखो और ७२ डिग्री सेल्सियस पर सेट ।
    2. ०.४ × एसएससी समाधान तापमान की जांच करें जब तक यह ७२ ± 1 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है ।
    3. दो ग्लास यूरिन, 2 × एसएससी + ०.०५% के बीच (पीएच = ७.० ± ०.१) समाधान और आसुत जल के साथ एक दूसरे के साथ एक तैयार करें ।
    4. सूखी गर्मी ओवन से आर्द्र चैम्बर निकालें, ध्यान से चिमटी का उपयोग तार-डाट से रबर सीमेंट को हटाने, और तार बाहर ले ।
      नोट: ध्यान से में डाट के माध्यम से तार की unकोट अंत खींच, कार्यात्मक टिप नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है ।
    5. ७२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ०.४ × एसएससी समाधान में तार डुबकी ।
    6. 2 × एसएससी में तार धो + ०.०५ आर टी के लिए 30 एस के बीच समाधान ।
    7. आरटी में आसुत जल में तार धो लो ।
    8. अंधेरे में 10 मिनट के लिए धुएं डाकू के तहत तार सूखी ।
    9. 1 × पंजाब के 2 मिलीलीटर में १.४३ µ मीटर की एक DAPI स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    10. एक 2 मिलीलीटर की शीशी में DAPI समाधान के साथ तार के कार्यात्मक टिप के लिए 1 ज में अंधेरे में आरटी मशीन ।
    11. 1 × पंजाबियों और हवा में दो बार तार कुल्ला सूखी ।
  • 3 डी माइक्रोस्कोप अवलोकन और विश्लेषण
    1. तार धारक में तार की स्थिति । ध्यान से विशेष धारक के प्रवेश बिंदु के माध्यम से कार्यात्मक टिप डालें, जब तक टिप युग्मन बिंदु से मेल खाता है । कार्यात्मक टिप (चित्र 1a) को क्षति न पहुंचाएं ।
    2. माइक्रोस्कोप के मंच पर विशेष धारक प्लेस । एक 20 × लेंस का उपयोग कर माइक्रोस्कोप का ध्यान समायोजित करें । पहले मोटे विशेष समर्थन पर ध्यान दें और फिर DAPI-चैनल में चमकीले दिखाई देने वाले कक्षों पर बारीकी से समायोजित करें.
    3. केवल ध्यान में डाल कोशिकाओं लेंस के लिए केंद्रीय ।
      नोट: छवियां विभिंन माइक्रोस्कोप सिस्टम के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इस सेटिंग में, हम एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण के लिए एक मानक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ संपंन का उपयोग करें ।
    4. एक 12-bit डिजिटल कैमरा और 20 ×/0.50 na और 40 ×/0.65 ना उद्देश्य के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ लाल (उत्तेजना: का उपयोग कर छवियां प्राप्त करें ५९९ एनएम, उत्सर्जन: ५८८ एनएम), ग्रीन (उत्तेजना: ५०९, उत्सर्जन: ५२४), और नीले (उत्तेजना: ३६७ एनएम, उत्सर्जन: ४५२ एनएम) जांच ।
      नोट: छवियां विभिंन उपकरणों और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और ALK-जांच स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए ImageJ का उपयोग करें ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । तार-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । जब लंबी अवधि के भंडारण के लिए तार पैकिंग, जगह तार-डाट कार्यात्मक टिप के बगल में है और ध्यान से भंडारण ग्लास ट्यूब में तार डालने, ध्यान कार्यात्मकता टिप को नुकसान नहीं ले । -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण कांच और दुकान (खड़ी या क्षैतिज) बंद करें ।
  • Representative Results

    यह एक bliss-CTCs पर डीएनए मछली परख (या अंय समकक्ष कोशिकाओं) कार्यात्मक तार से समृद्ध प्रदर्शन करने के लिए संभव है ऊपर वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करना । इस प्रोटोकॉल की स्थापना करने से पहले, दो तकनीकों की अनुकूलता (bliss-मछली के साथ प्रतिदीप्ति) मानक 2d का समर्थन करता है निर्धारित किया गया था । दो अलग NSCLC सेल लाइनों EpCAM व्यक्त (EpCAM के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ मिलकर तार का पालन करने की आवश्यकता) का चयन किया गया । वे एक अलग ALK स्थिति है, जो विभिंन प्रारंभिक परिस्थितियों का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है । पहला, NCI-H1975, जंगली प्रकार (WT) ALK जीन है, जबकि दूसरा, NCI-H3122, ALK अनुवादन की विशेषता है ।

    एक ALK जीन तोड़-अलग मछली परख के लिए जांच प्रणाली का इस्तेमाल किया गया था । प्रणाली दो जांच के होते हैं, एक (नारंगी) 2p23 पर ALK के भीतर समीपस्थ क्षेत्र के लिए hybridizing और एक (हरे) ALK के लिए बाहर hybridizing । 2d का समर्थन करता है पर, bliss-डीएनए मछली दोनों एंटीबॉडी और जांच के लिए अच्छी तरह से परिभाषित संकेतों (चित्रा 2) प्रदान की है । विशेष रूप से, दोनों कक्ष लाइनों अच्छी तरह से परिभाषित EpCAM झिल्ली स्थानीयकरण दिखाया । इसके अलावा, जांच संकेत उज्ज्वल और तेज दिखाई: NCI-H1975 कोशिकाओं अतिव्यापी नारंगी और हरे रंग की जांच दिखाई, ALK जीन की wildtype स्थिति की पुष्टि (चित्रा 2a, बी) । इसके विपरीत, NCI-H3122 कोशिकाओं अतिव्यापी संकेतों और एकल हरी डॉट्स दिखाया, ALK जीन का विलोपन को दर्शाती है (चित्रा 2c डी). जब bliss-डीएनए मछली परख 3 डी का समर्थन कार्यात्मक तार, एंटीबॉडी और जांच संकेतों पर प्रदर्शन किया गया आम तौर पर कम 2d समर्थन की तुलना में परिभाषित किया गया । EpCAM धुंधला दिखाई दे रहा था । ALK जांच सिग्नल कम परिभाषित किए गए थे लेकिन अभी भी अपेक्षित ALK स्थिति (आरेख 3) प्रतिबिंबित हुई । परिणामों से पता चला कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला डीएनए मछली संकेतों के साथ हस्तक्षेप नहीं किया । जांच अपने लक्ष्य के साथ विशेष रूप से संकर । NCI-H3122 सेल लाइन एक ंयायपालिका ALK जीन की स्थिति (चित्र 3 बी), NCI-H1975 के विपरीत में, एक जंगली प्रकार ALK जीन (चित्राए) के साथ दिखाया ।

    Figure 1
    चित्र 1 : कार्यात्मक तार, ALK तोड़ की योजनाबद्ध व्यवस्था-अलग जांच, ALK पुनर्व्यवस्था की उंमीद पैटर्न की योजना है, और विशेष धारक । () लाल बक्से तार के तीन मुख्य भागों: कार्यात्मक टिप, तार डाट, और संयुक्त राष्ट्र के कार्यात्मक टिप पर प्रकाश डाला । कार्यात्मक टिप तार का सबसे नाजुक हिस्सा है और हैंडलिंग के दौरान सेल टुकड़ी या नुकसान से बचने के लिए नहीं छुआ जाना चाहिए । () हरी और लाल जांच प्रत्येक क्रमशः ALK जीन के loci के ऊपर और नीचे की ओर जुगाड़ करने के लिए बाइंड (बाईं ओर) । सही पर, ALK व्यवस्थाओं के exemplificative पैटर्न दिखाए जाते हैं. सामान्य कोशिकाओं पर लाल और हरे रंग के सह-स्थानीयकरण का संकेत; अलग हरे और लाल संकेत एक ALK जीन गुणसूत्र तोड़ (ALK जीन के translocation) और एक हरे-नारंगी colocalization संकेत (ंयायपालिका सेल-1) से संकेत मिलता है । एक लाल संकेत और दो हरी संकेतों एक लाल संकेत के नुकसान का संकेत मिलता है, एक गुणसूत्र translocation और एक विलोपन (ंयायपालिका सेल-2) का सुझाव । (c) वायर धारक; लाल बक्से जहां देखभाल की जरूरत है जब सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान तार हैंडलिंग क्षेत्रों पर प्रकाश डाला । तार रोटेटर मोड़ से एक ३६० ° विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2 : bliss-2d समर्थन (coverslip) पर डीएनए मछली परख । (a, b) NCI-H1975 कोशिकाओं EpCAM के लिए कमजोर सकारात्मक । EpCAM FITC संकेत प्रशंसनीय थे । नारंगी और हरे रंग की जांच ALK तोड़-अलग छा, NCIH1975 सेल लाइन में ALK जीन की WT स्थिति की पुष्टि । दो से अधिक युग्मित संकेतों को प्रदर्शित करने वाली कोशिकाएं उनके aneuploidy के कारण मौजूद थीं । (, ) हाई EpCAM-एक्सप्रेस NCIH3122 सेल लाइन में इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल ब्राइट थे, जो सेल-सेल जंक्शनों में लगाए गए थे । मछली विश्लेषण ALK जीन, इस सेल लाइन की खासियत के विलोपन की पुष्टि की । लाल तीर ALK जीन विलोपन को दर्शाती है, एकल हरी जांच (इसी नारंगी जांच के बिना) इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3: bliss-डीएनए मछली परख 3d समर्थन के रूप में कार्यात्मक तार का उपयोग कर । () तार पर NCI-H1975 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि. हालांकि तार पर कोशिकाओं के 3d आकार में पूरी तरह से ध्यान केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना, EpCAM संकेत अच्छी तरह से सभी कोशिकाओं में दिखाई देता है । () तार पर NCI-H3122 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि । ALK जांच जीन विलोपन (लाल तीर) दिखाया, के रूप में पहले 2d समर्थन पर देखा । दिखाई पृष्ठभूमि संकेत सबसे बहुलक परत की उपस्थिति के कारण होने की संभावना थी । हालांकि, यह काफी सेल पहचान या प्रतिदीप्ति विश्लेषण को प्रभावित नहीं किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    बफ़र संयोजन नोट शेयरों
    सेल पूरा संस्कृति माध्यम RPMI १६४० + 2 मिमी Glutamine + 5-10% Foetal गोजातीय सीरम (FBS). RPMI: 4 ° c; Glutamine, FBS:-20 ° c
    एंटीबॉडी Diluition बफर 1% BSA, ०.३% ट्राइटन X-१०० 1x पंजाब में आर टी प्रयोगशाला फिल्म के साथ मुहर ।
    20x SSC समाधान 3 एम सोडियम क्लोराइड, ३०० मिमी trisodium साइट्रेट ddH में भंग20 फ़िल्टर समाधान और pH = ७.० +/-०.१ HCl के साथ आर टी प्रयोगशाला फिल्म के साथ मुहर ।
    0.4 x एसएससी समाधान कमजोर स्टॉक 20x SSC में आसुत एच2 फ़िल्टर समाधान और pH = ७.० +/-०.१ HCl के साथ भ.
    प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील । 2x एसएससी + ०.०५% के बीच 20 समाधान आसुत एच2ओ + ०.०५% के बीच में स्टॉक 20x एसएससी पतला 20 फ़िल्टर समाधान और pH = ७.० +/-०.१ HCl के साथ आर टी प्रयोगशाला फिल्म के साथ मुहर । DAPI समाधान 30 एनएम 1x पंजाब में शेयर १.४३ µ m पतला -अंधेरे हालत में 20 ° c aliquote का उपयोग करने के लिए तैयार

    तालिका 1: समाधान व्यंजनों ।

    Discussion

    इस पत्र में, पहली बार के लिए, एक विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और डीएनए मछली के संयोजन, कार्यात्मक तार के साथ प्रयोग के लिए प्रस्तावित किया गया था । विधि bliss-डीएनए मछली कहा जाता था । इस तकनीक के लिए EpCAM (घटना 1) के लिए धनात्मकता के रूप में phenotypical मापदंडों, के आधार पर एक 3d तार पर ख्यात CTCs की एक साथ पहचान की अनुमति विकसित की गई थी, और ऐसे ALK जीन की स्थिति के रूप में आणविक परिवर्तन, का पता लगाने की सुविधा ( घटना 2) । दोनों घटनाओं की एक साथ पहचान उनके सह स्थानीयकरण का पता लगाने की अनुमति देता है । इसलिए, इस दृष्टिकोण की पहचान और CTCs कैंसर रोगियों के रक्त से प्राप्त विशेषता के अनुरूप किया जा सकता है । haemo के संभावित प्रभाव-घटक और दाग प्रक्रिया पर ल्यूकोसाइट्स आमतौर पर प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करते । विशेष रूप से, साहित्य में रिपोर्ट डेटा संकेत दिया कि haemo-अवयव और ल्यूकोसाइट्स तार से जुड़ी कोशिकाओं के दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस को प्रभावित नहीं करते हैं, महत्वपूर्ण कदम वास्तविक CTCs1की पहचान करने के लिए,15

    bliss की प्रतिदीप्ति चमक-डीएनए मछली थोड़ा कम है कि एक पारंपरिक immunophototyping परख की तुलना में चिह्नित है और उच्च मछली परख के लिए आवश्यक तापमान का परिणाम है । हालांकि, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अभी भी प्रशंसनीय है । उदाहरण के लिए, एक बेहोश संकेत अभी भी कम EpCAM-व्यक्त कक्ष लाइन, NCIH1975 में detectable है । उच्च मछली परख के लिए आवश्यक तापमान एंटीबॉडी से जुड़े सही fluorochrome चुनने में मुख्य सीमित कारक है । इस प्रोटोकॉल में, एंटीबॉडी एक thermostable fluorochrome से जुड़ा होना चाहिए ताकि डीएनए विकार तापमान को सहन करने के लिए । उदाहरण के लिए, phycoerythrin, एक thermosensitive fluorochrome, उच्च तापमान की वजह से fluorochrome क्षरण के कारण इस सेटिंग में अनुशंसित नहीं है । Fluorescein isothiocyanate एक अच्छा विकल्प है और अक्सर आम मछली जांच पर कार्यरत fluorochrome । bliss-डीएनए मछली autofluorescence संकेत मानक 2d का समर्थन करता है पर बहुत गरीब है । तार समर्थन पर, बहुलक परत एक मामूली autofluorescence संकेत, विशेष रूप से लाल चैनल पर प्रेरित हो सकता है । 2 डी पृष्ठभूमि के विपरीत, एक aspecific पृष्ठभूमि संकेत तार पर प्रत्यक्ष है, लेकिन काफी नाभिक पहचान या सेल लक्षण वर्णन को प्रभावित नहीं करता है ।

    तार की माइक्रोस्कोप मूल्यांकन एक बेलनाकार आकार का 3 डी संरचना की सतह को पढ़ने में एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की सीमा के कारण एक 2d समर्थन की तुलना में ज्यादा थकाऊ है । हालांकि, इस कठिनाई तार धारक घूर्णन और छवियों कि मुख्य रूप से तार के midline साथ स्थानीयकृत रहे हैं प्राप्त करने से दूर किया जा सकता है । तार धारक तार के ३६० डिग्री रोटेशन परमिट । एक बार नाभिक पर ध्यान केंद्रित, प्रतिदीप्ति चैनल बदलने जरूरी लक्ष्य क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित नहीं रखना है । इस कारण के लिए, यह आंतरिक-सेल लक्ष्य क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित बनाए रखने के लिए आवश्यक है ।

    इस तकनीक का पता लगाने और 3 डी का समर्थन करता है के विभिंन प्रकार पर कोशिकाओं की विशेषता के अनुरूप किया जा सकता है । यह भी अलग एंटीबॉडी और मछली जांच का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है । जब विभिन्न एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए चुनते हैं, fluorochrome thermostability और लक्ष्य प्रतिजन की अभिव्यक्ति स्तर कोशिका झिल्ली पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं । इंट्रो-cytoplasmatic एंटीजन भी दाग सकते हैं । जब विभिंन मछली जांच का उपयोग कर, यह विकार प्रक्रिया के लिए डेटा पत्रक विनिर्देशों की जांच करने के लिए और तदनुसार मछली परख के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

    Disclosures

    लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ethanol Carlo Erba # 414605
    Tween 20 BIO RAD # 1706531
    PBS (Phosphate Buffered Saline)  Medicago # 09-9400-100
    Acetone Sigma Aldrich # 534064-500ML
    BSA Sigma Aldrich # A7906
    Triton X-100 Detergent BIO RAD # 1610407
    RUBBERCEMENT Royal Talens # 95306500
    Vysis 20X SSC (66g) Abbott Molecular Inc.  # 30-804850 powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended
    RPMI 1640 Gibco # 31870-025
    FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco # 10270-098
    L-Glutamine (200mM) Gibco # 25030-024
    Penicillin-Streptomycin Gibco # 15140-122
    H20 MilliPore
    XT ALK BA MetaSystems Probes # D-6001-100-OG
    DAPI, FluoroPure grade Invitrogen # D21490
    SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Life Technologies # S36973
    EpCAM-FITC (clone: HEA-125) Mitenyi # 130-080-301
    Micro tubes M-Tube18 Gilupi Nanomedizin
    Detektor CANCER01 EpCAM Gilupi Nanomedizin Functionalized wire
    STAR FROST Microscope Slides Knittel GLÄSER VS1117# 076FKB
    SecureSlip Silicone Supported Coverglass GRACE BIO-LABS # 104112
    ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop  ZEISS
    Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software Nikon BR 4.11.00
    Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera Nikon DS-QiMc

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    References

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    ट्यूमर कोशिकाओं परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए एक चिकित्सा तार का उपयोग कर के लक्षण वर्णन: एक 3 डी दृष्टिकोण इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डीएनए मछली पर आधारित
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    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).More

    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).

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