膜タンパク質の再構成
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Overview
再構成は、元のフォームまたは関数に分離生体分子を返すプロセスです。これは、膜タンパク質は、細胞の重要な機能を有効にし、近くの脂質の動作に影響を研究するため便利です。原精製膜蛋白質の機能を研究するには、彼らは人工脂質膜にそれらを統合することによって再構成する必要があります。
このビデオは、膜タンパク質の再構成の概念と洗剤、人工の小胞に隔離された蛋白質の定款及びソリューションから洗剤の分離、脂質を用いた人工膜小胞の形成を使用して蛋白質の隔離など、関連する手順を紹介します。最後に、2 つのアプリケーションが覆われている: 膜の輸送蛋白質及び集光性タンパク質の再構成の再構成。
再構成は、元のフォームまたは機能に分離生体分子を復元するプロセスです。このアプローチは、膜タンパク質は、多くの重要な細胞プロセスを有効にして、隣接の脂質の動作に影響を勉強するときによく使用されます。ただし、細胞環境の複雑さは、膜タンパク質機能の勉強は難しいin-situ 。タンパク質を抽出し、精製することができますが、膜なしの実際の関数を評価できません。したがって、分離膜蛋白質はリポソームなどの人工の脂質膜への統合によって再構成されたです。膜タンパク質溶解、一般的な再構成手順と生化学のいくつかのアプリケーションの原則を紹介します。
細胞膜は、主にリン脂質と膜タンパク質で構成されます。リン脂質二重層の脂肪酸の疎水性尾は 2 層で相互に対話しながら親水性のリン酸ヘッドが水性インテリアと、セルの外観と対話を形成します。
いくつかの膜タンパク質はのみ静電気または noncovalent 相互作用によって膜と対話します。’不可欠な蛋白質’ と呼ばれる、他の人は、脂質二重層に埋め込まれます。
二層のような不可欠なタンパク質は親水性が終了し、疎水性中心があるし、疎水性相互作用によって固定されます。全体の膜にまたがる不可欠なタンパク質は、膜貫通蛋白質と呼ばれます。
これらの蛋白質と細胞膜の相互作用が強いことも、細胞を溶解分離しませんそれらです。洗剤と呼ばれる特殊な界面活性剤を使用して蛋白質を抽出します。リン脂質と同様に、洗剤は親水性のヘッドと脂溶性の尾があるし、膜を自由に入力することができます。
膜内洗剤の脂溶性のツインテールは疎水性蛋白質のコアと対話します。これは、タンパク質-脂質相互作用を混乱させる親水性の洗剤ヘッドのシェルを持つタンパク質を囲みます。
蛋白質界面活性剤複合体今簡単に膜から分離します。水溶液に可溶と人工膜の再構成の準備ができて、洗剤は複合体をつくる。
蛋白質はしばしば人工膜小胞であるリポソームの膜に再構成されました。リポソームを準備するには、乾燥脂質が水分し、小胞形成を誘導するのに興奮しています。洗剤を追加するときは、リポソーム膜に組み込まれます。
蛋白質を再構成するリポソームと可溶性タンパク質が結合され、透析または化学吸着によって、洗剤がソリューションから削除されます。タンパク質とリポソーム急速に組み立ててプロテオリポソーム、だから親水性グループのみが公開されます。タンパク質には、細胞膜で分離して調べることができます彼らと、機能します。
リポソームの膜タンパク質の再構成のプロトコルを介してタンパク質再構成の基礎を説明しましたので、これで行こう
膜タンパク質を分離するには、セルが分離されます。遠心分離と切れ目のない細胞が削除されます。
上清は膜をペレットを高速で遠心分離します。ペレットの再懸濁は、タンパク質を抽出する洗剤が追加されます。
残りの細胞の残骸が追加の遠心分離によって削除されます。タンパク質は、カラム ・ クロマトグラフィと培養上清より精製した集中や必要に応じてさらに精製します。
リポソームを準備するには、有機溶媒中でリン脂質の懸濁液、窒素またはアルゴンの下で乾燥させます。
リン脂質が水和反応バッファーと水和および混合物は、リポソームの作成を完了する超音波処理します。
洗剤は、蛋白質と結合されるリポソームを可溶化に追加されます。
洗剤は、ポリスチレン ビーズ、透析、または洗剤バインド列への吸着によって削除されます。結果プロテオリポソームは浄化され、その後の実験で使用する準備ができています。
今、あなたは、膜タンパク質の再構成手順の基本原則に精通しているが、生化学のタンパク質再構成のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。
膜輸送タンパク質は、トランスポート メカニズムの明確な理解を得るために再構成されました。その関数の後の再構成は、ヨウ化物イオンの流出を確認しました。その後、様々 な小分子イオン チャネル阻害剤や度の存在下で輸送活動を調べた。このように、これらの小さな分子の輸送蛋白質との直接相互作用を検討する可能性が。
クロロフィルとカロテノイド結合膜タンパク質植物の光を収穫、電荷分離を促進するため、光損傷を軽減します。これらの集光性タンパク質を再構成によって、フォールディング動力学と顔料との相互作用を学ぶことができます。この手法で再構成した集光性タンパク質は、ネイティブ蛋白質に非常に同じような光学的性質を持っていた。蛍光発光分光法は、顔料から再構成された集光性タンパク質へのエネルギー移動の研究に使用できます。
膜タンパク質の再構成にゼウスのビデオを見てきただけ。再構成はさらに調査のため細胞模倣に重要な蛋白質を転送する方法です。このビデオ タンパク質溶解、溶解のプロトコル、および生化学のいくつかのアプリケーションの原則の説明。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
