Här presenterar vi ett protokoll för nätverkslänkar skanning sond nanolithography aktiverad iterativ anpassningen av sonden matriser, samt utnyttjandet av litografiska mönster för cellytan interaktionsstudier.
Scanning sonden mikroskopi har möjliggjort skapandet av en mängd metoder för konstruktiv (’tillsatser’) uppifrån tillverkning av nanometerskalan funktioner. Historiskt har varit en stor nackdel med skanning sonden litografi intimt låg genomströmning av inre sonden system. Detta har tacklats med hjälp av matriser av flera sonder för att möjliggöra ökad nanolithography genomströmning. För att genomföra sådana parallelliserad nanolithography, korrekt uppriktning av sonden matriser med substrat yta är viktigt, så att alla prober göra kontakt med ytan samtidigt när litografiska mallning börjar. Det här protokollet beskriver användningen av polymer penna litografi att producera nanometerskalan funktioner över centimeter och medelstora utrymmen, underlättas genom användning av en algoritm för snabb, noggrann och automatiserad uppriktning av sonden matriser. Här visar nanolithography av tioler på guld substrat generering av funktioner med hög jämnhet. Dessa mönster är sedan functionalized med Fibronektin för användning i samband med surface-regisserad morfologi cellstudier.
Framstegen inom nanotekniken är beroende av utvecklingen av tekniker kan effektivt och pålitligt fabricera nanoskala funktioner på ytor. 1 , 2 dock generera sådana har över stora områden (flera cm2) tillförlitligt och på relativt låg kostnad är en icke-trivial strävan. De flesta befintliga tekniker, härrör från halvledarindustrin, lita på ablativ photolithography att fabricera ‘hårt’ material. Mer nyligen, litografiska tekniker härrör från genomsökning sonden mikroskopi (SPM) har dykt upp som en bekväm och mångsidig strategi för den rapid prototyping av nanoskala mönster. 3 SPM-baserade tekniker kan snabbt och bekvämt ‘skriva’ något användardefinierade mönster. Den mest kända av dessa är dopp-pen nanolithography (DPN), uppfunnen av Mirkin et al.,4 där en skanning sond används som en ”penna” för att överföra en molekylär ‘bläck’ till ytan producerar funktioner på ett sätt som är analoga med skrivande. Under omgivningsförhållanden, som en sond är scannade över en yta ‘bläck’ molekylerna överförs till den ytan via en vatten menisk som bildar mellan sonden och ytan (figur 1). DPN kan således nanolithographic nedfall av ett brett utbud av material, inklusive ‘mjuka’ material såsom polymerer och biomolekyler. 5 relaterade tekniker använder sonder konstruerad med kanaler för leverans av flytande, omväxlande kallas ‘nanopipettes’ och ‘nano-fountain pennor’, har också rapporterats. 6 , 7 , 8
Det främsta hindret för en bredare tillämpning av SPM-derived litografi är genomströmning, eftersom det kräver en orimligt lång tid att mönster centimeter-skala områden med en enda sond. Tidiga insatser för att adressera detta fokuserade på parallelization av fribärande-baserade DPN, med både ‘en-dimensionell’ och ‘tvådimensionella’ (2D) sond matriser som rapporteras för litografin av centimeter stora områden. 5 , 9 dock dessa fribärande arrayer produceras genom relativt komplexa utgångsämnet framställningsmetoder och är relativt bräckliga. Uppfinningen av polymer penna litografi (PPL) upp denna fråga genom att ersätta de vanliga SPM-utliggare med en 2D array av mjuk siloxan elastomer sonder limmade på en glasskiva. 10 denna enkla sonden setup avsevärt minskar kostnaderna och komplexiteten av mönstring stora områden, öppna upp nanolithography till ett bredare användningsområde. Denna fribärande-fri arkitektur har utökats till att hård-tip soft-våren litografi,11 som ger en hybrid mjuk elastomeriska backing hårt kisel tips ger förbättrad upplösning jämfört med mönster som produceras med hjälp av mjuk elastomer tips.
En avgörande faktor i utförandet av dessa 2D array teknik är att sonden matrisen måste vara exakt parallellt med ytan substratet så att när litografi utnyttjas, alla sonderna kommer i kontakt med ytan samtidigt. Även en liten förskjutning kan orsaka en stor skillnad i storleken från ena sidan av matrisen till den andra, eftersom vissa sonder kommer i kontakt med ytan tidigare under nedstigningen av arrayen, medan andra kommer att komma i kontakt senare eller inte alls. 12 exakt anpassning är särskilt viktigt med PPL på grund av deformability av de mjuka elastomer sonderna, där sonderna kontakta ytan tidigare komprimeras, vilket ger en större fotavtryck på ytan.
Det tidiga arbetet på PPL anställd rent visuell inspektion att vägleda justeringsprocessen, med hjälp av en kamera monterad ovanför matrisen för att följa deformationen av de pyramidala sonderna som de tog i kontakt med ytan. 10 justering bedömdes genom att observera vilken sida av proberna kom i kontakt med ytan först, och sedan justera vinkel och upprepa proceduren på en iterativ sätt tills skillnaden i kontakt på varje sida av sonden var icke-urskiljbara för ögat. Som proceduren justering är beroende av subjektiv visuell inspektion av operatören, är reproducerbarhet låg.
En mer objektiv syn har därefter utvecklats, bestående av en kraftsensor monterad under substraten för att mäta den kraft som anbringas vid kontakt av sonderna på ytan. 12 justering uppnåddes således genom att justera de tilt vinklar för att maximera den kraft som utövas, som visade att alla sonderna samtidigt i kontakt. Denna metod visade att anpassningen till inom 0,004 ° om ytan var möjligt. Denna ‘force feedback nivellering’ har nu genomförts i helautomatiska system i två oberoende rapporter. 13 , 14 både använda en triad av kraftgivare monterade antingen under substratet eller ovanför matrisen och mäta mängden kraft som utövas vid kontakt mellan sonden matriser och yta. Dessa system ger hög precision, anmäla avvikelser på ≤0.001 ° över en 1 cm längd skala,14 eller ≤ 0.0003 ° över 1,4 cm.13 dessa automatiserade alignment system ger också stora besparingar i operatörstiden och totala tiden för att slutföra den litografi-processen.
En viktig tillämpning av hög genomströmning ytan fabrication aktiveras med denna teknik är generation av cell kultur substrat. Det är nu väl etablerat det cell fenotypen kan manipuleras genom att styra inledande samspelet mellan celler och surface-funktioner, och att detta kan förbättras på nanonivå. 15 särskilt sonden litografi skanningsmetoderna har visat sig vara en lättköpt metod för att producera en mängd nanofabricerade ytor för sådan cell kultur experiment. 16 till exempel ytor presentera nanoskala mönster själv monterade enskiktslager och extracellulära matrix proteiner mallade av PPL och DPN har använts för att studera potentialen för nano-modifierade material i material inducerad differentiering av stamceller. 17
Det här protokollet beskriver utnyttjandet av en modifierad atomic force Mikroskop (AFM) system som gör att stora ytor PPL. Vi detalj detektion av kraft använder flera kraftgivare som medel för att bestämma sond-yta kontakt, tillsammans med en algoritm som automatiserar iterativ justeringsprocessen. Efterföljande funktionalisering av dessa mönster med den extracellulära matrix protein Fibronektin och kulturen av humana mesenkymala stamceller (hMSC) beskrivs, som en demonstration av PPL-fabricerade ytor tillämpas för cellodling.
Detta protokoll syftar till att förse användare med en bekväm metod att snabbt genomföra nanolithographic mönstring med hög jämnhet och kontrollerbar funktionen storlek över stora områden (cm2). Substrat som bär dessa stort område nanopatterns kan sedan vidareutvecklas för en mängd tillämpningar. En större tillämpning av denna teknik är i generationen av nanofabricerade ytor för cellytan interaktionsstudier. Den här rapporten visar några belysande exempel på cellkultur på dessa material, visar kontroll av hMSC morfologi av nanofabricerade substrat.
En viktig faktor i detta protokoll är automatisering av förfarandet för justering (steg 4) som tillåter mycket enhetlig och hög genomströmning produktion av funktioner på ytor, ner till nanoskala upplösning, vilket gör den snabb omsättningen av cell kultur experiment. Den polymer penna litografi utförs med denna justering algoritm är kunna generera nanoskala funktioner inom ca 30 min. Den reproducerbarhet och noggrannhet på automatisk justering, och således likformigheten av de mönstrade funktionerna, är emellertid kritiskt beroende på kvaliteten på de sond arrayer som produceras (steg 1 och 2). Eventuella brister i deras förberedelser som resulterar i trubbiga, trasiga eller saknas sonder; såsom instängd luft kan bubblor (steg 1,5) eller felaktig separation av sonderna från master (steg 1,8) resultera i felaktig justering och dålig kvalitet litografi.
Detta rapporterade metod aktier en begränsning i likhet med andra metoder för anpassning som förlitar sig på force feedback. Korrekt bestämning av när sonderna är i kontakt med ytan begränsas av behovet av att redogöra för bakgrunden vibrationer som orsakas av den omgivande miljön och rörlighet för provet scenen. I allmänhet sensorerna har en kraft känslighet i den µN regimen (2 µN i detta fall), men anpassningen algoritmen är utformad för att endast registrera en styrka av minst 490 µN som slutgiltig kontakt mellan sonderna och ytan, för att undvika eventuella ‘falska positiva’ resul terande från bakgrundsljud. 13 således denna metod tenderar att producera stora funktioner (1-2 µm) eftersom sonderna måste förlängas ett stort avstånd på z-axeln (med en åtföljande högre kraft) för att registrera kontakt. För att kompensera, mindre funktioner kan genereras genom att minska z-axeln avstånd reste under litografi steg (t.ex., att ange inställningen ‘Svart’ i steg 5.2.3.2 som 3 µm istället för 5 µm).
Även med denna begränsning, automation algoritmen ändå kunna hantera en kritisk aspekt i tillämpningen av parallelliserad sonden litografi skanningsmetoderna, eftersom anpassningen var tidigare den mest krävande och oprecisa tidssteg i den genomförandet av dessa tekniker. Detta automation nu skiftar det hastighetsbegränsande steget i tillverkningsprocessen från justeringen till den litografiska skriva själv. Medan detta protokoll visar tillämpningen av proceduren justering på PPL, skulle ramen kunna tillämpas på ett antal SPL tekniker såsom lipid-DPN26 och matrix-assisted litografi27 samt potentiella framtida katalytisk sonden system. 28
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiellt stöd från en mängd källor inklusive UK Engineering och Physical Sciences Research Council (bevilja refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) och en graduate UNIVERSITETSSTIPENDIUM för JH; Leverhulme förtroende (RPG-2014-292); Wellcome Trust institutionella strategiskt stödfonden (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); och University of Manchester för en University of Manchester Research Institute (UMRI pump priming fond) och en Presidential doktorand stipendium till SW. tekniskt stöd av Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) erkänns också tacksamt.
Equipment | |||
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage | NanoSurf | P40008 | |
AFM control software | NanoSurf | C3000 | |
Engraving pen | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
Plasma Cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
Economy Dry Oxygen Service Pump | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
Tube Rotator | Stuart | SB3 | |
Vacuum Desiccator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
Milli-Q Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
Modular Humidity Generator | proUmid | MHG32 | |
Proline Plus Pipette 100-1000 µL | Sartorius | 728070 | |
Silicon masters | NIL Technology | custom-made | |
Upright snapshot fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
Microscope objectives | Olympus | 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
Upright bright field microscope | Leica | DM 2500M | |
Ultrasonicator | Ultrawave Ltd. | U95 | |
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results | Microsoft | Excel | |
Reagent | |||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34863 | FLAMMABLE |
Microscope Sildes, Clear, Ground | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated | Gelest | VDT-731 | |
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane | Gelest | SIT7900.0 | |
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution | Sigma-Aldrich | 479527 | HARMFUL, TOXIC |
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated | Gelest | HMS-301 | |
Weigh Boat 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
Pasteur pipette | Appleton Woods | KS230 | |
Petri dish | SARSTEDT | 82.1473 | |
Razor blade | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
Adhesive Carbon Tape | Agar scientific | AGG3939 | |
16-Mercaptohexadecanoic acid | Sigma-Aldrich | 448303-1G | HARMFUL, TOXIC |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | FLAMMABLE |
Gold coated microscope slide | Sigma-Aldrich | 643203 | Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | HARMFUL, TOXIC |
Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 529303 | HARMFUL, TOXIC |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84415 | HARMFUL, TOXIC |
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 675105 | HARMFUL, TOXIC |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Cobalt(II) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 203106 | HARMFUL, TOXIC |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza UK | PT-3001 | |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza UK | PT-2501 | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
CELLSTAR Centrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | HARMFUL, TOXIC |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "Detergent" in manuscript |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Rabbit anti-fibronectin antibody | Abcam | ab2413 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
12-well plate | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
T75 tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
cantilever | BudgetSensor | ContAl-G |