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Bioengineering

基于自动对准的大面积扫描探针光刻及其在细胞培养研究中的应用

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们提出了一个广域扫描探针光刻的协议, 由探针阵列的迭代对准所启用, 以及利用光刻模式进行细胞表面相互作用研究。

Abstract

扫描探针显微镜已使创建了各种方法的建设性 ("添加剂") 自上而下制造纳米尺度的特征。从历史上看, 扫描探针光刻的一个主要缺点是单探头系统的固有的低吞吐量。通过使用多个探测器阵列来解决这一问题, 从而提高了光刻吞吐量。为了实现这种并行光刻, 探针阵列与基体表面的精确对准是至关重要的, 因此当光刻模式开始时, 所有探针都能同时与表面接触。该协议描述了聚合物笔光刻在厘米大小的区域内产生纳米尺度特征的利用, 通过使用一种快速、精确和自动对准探针阵列的算法来促进。在这里, 光刻的硫醇的黄金基板显示的特点, 高均匀性的生成。这些模式, 然后功能性与纤连蛋白用于在表面定向细胞形态学研究的背景下使用。

Introduction

纳米技术的进展依赖于能够高效、可靠地制造表面纳米尺度特征的技术的发展。1,2然而, 在大面积 (多 cm2) 上可靠地产生这样的特性, 而且成本相对较低, 这是一个非平凡的努力。大多数现有的技术, 从半导体工业, 依靠烧蚀光刻制造 ' 硬 ' 材料。最近, 从扫描探针显微镜 (SPM) 中获得的光刻技术已经成为纳米设计快速成型的一种方便、通用的方法。3基于 SPM 的技术能够方便快捷地 "编写" 任何用户定义的模式。最知名的这些是蘸笔光刻 (DPN), 率先由 Mirkin人,4在那里扫描探针被用作 ' 钢笔 ' 转移分子 ' 墨水 ' 的表面产生的特点, 类似于写作。在环境条件下, 当探针在表面扫描时, "墨水" 分子通过在探针和表面之间形成的水半月板转移到表面 (图 1)。DPN 从而允许 nanolithographic 沉积广泛的材料, 包括 ' 软 ' 材料, 如聚合物和生物分子。nanopipettes 还报道了5项相关技术, 这些方法使用了用管道进行流体输送的探头, 不同的称为 ' ' ' ' 和 ' 纳米喷泉笔 '。6,7,8

更广泛地应用 SPM 衍生光刻的主要障碍是吞吐量, 因为它需要过长的时间, 以一个单一的探针模式厘米尺度区域。早期致力于解决这个问题的重点是基于悬臂式 DPN 的并行化, 同时报告了 "一维" 和 "二维" (2D) 探针阵列, 用于对厘米大小的区域进行光刻。5,9然而, 这些悬臂阵列是通过相对复杂的多步骤制造方法产生的, 而且相对脆弱。聚合物笔光刻 (PPL) 的发明解决了这个问题, 通过更换标准的 SPM 悬臂与2D 阵列软硅氧烷弹性探头粘结到玻璃滑梯。10这一简单的探头设置大大降低了阵列大面积的成本和复杂性, 为更广泛的应用开辟了光刻。这种无悬臂结构也被扩展到硬尖端软弹簧光刻,11提供了一个混合软弹性支承与硬硅小贴士, 使改进的分辨率相比, 使用软弹性体提示。

执行这些2D 阵列技术的一个关键因素是探针阵列必须与表面基底完全平行, 以便在使用光刻时, 所有探头同时与表面接触。即使是一个小的错位也会导致从阵列的一侧到另一个的特征大小有很大的差别, 因为一些探针会在阵列下降的时候与表面接触, 而另一些探头会在以后接触到或根本不出现。12精确对准是特别重要的, 由于软弹性体探头的变形性, 在那里接触表面的探头将被压缩, 留下更大的足迹在表面上。

早期的研究人员使用纯粹的视觉检查来指导对准过程, 利用在阵列上方的摄像头观察金字塔探针的变形, 因为它们接触到了表面。10对齐方式是通过观察探针的哪一侧接触到表面首先, 然后调整角度和重复该过程以迭代的方式来判断, 直到探头两侧接触的差异不区分的眼睛。由于该对准程序依赖于操作者主观视觉检查, 重现性较低。

随后, 开发了一种更客观的方法, 由安装在基板下的力传感器组成, 用来测量表面上探头接触时施加的作用力。12通过调整倾斜角度来实现对齐, 从而使施加的力最大化, 这表明所有探头同时处于接触中。该方法表明, 对0.004°内的表面平行是可能的。这项 "力反馈水准" 现已在两份独立报告中实施为全自动系统。13,14都使用在基板下方或阵列上方安装的力传感器的三重, 并测量探针阵列和曲面之间接触所施加的作用力量。这些系统给出了高精度, 报告≤0.001°的不协调度超过1厘米长,14或≤ 0.0003°over 1.4 厘米.13这些自动对齐系统还提供了大量节省操作员时间和总时间来完成光刻工艺。

这种技术所启用的高通量表面制造的一个主要应用是细胞培养基质的生成。现在已经确定了细胞表型可以通过控制细胞和表面特征之间的初始相互作用来操作, 并且可以在纳米尺度上增强。15具体地说, 扫描探针光刻方法已被证明是一种简便的方法来生产各种 nanofabricated 表面的这种细胞培养实验。16例如, 表面呈现的纳米结构的自组装膜和细胞外基质蛋白模板的 DPN 已被用来研究纳米改性材料在材料诱导分化的潜力干细胞。17

该协议描述了一种改进的原子力显微镜 (AFM) 系统的使用, 它能够实现大面积的 PPL。我们详细介绍了用多力传感器检测力的方法, 作为确定探针表面接触的手段, 以及自动化迭代对准过程的算法。对这些模式的后续功能化与细胞外基质蛋白纤维连接蛋白和人骨髓间充质干细胞 (hMSC) 的培养进行了描述, 作为一种用于细胞培养的人工表面的证明。

Protocol

1. 制作的 PPL 笔阵列

  1. 制备烷共聚物混合物:
    1. 添加10µL 铂 (0)-13-乙烯 11, 33-tetramethyldisiloxane 复杂溶液和172µL 13, 57-四甲基-13, 57-tetravinylcyclotetrasiloxane 到250克 (7-8 w/w vinylmethylsiloxane)-甲基 co 聚合物。将这些组件彻底混合在一个旋转搅拌机上7天, 以确保均匀混合。
      注意: 铂 (0)-13-乙烯 11, 33-tetramethyldisiloxane 是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
    2. 添加0.5 克 (25-35 w/w氢)-甲基共聚合物到一个1.7 克的混合物, 从步骤1.1.1 在一个称量船, 并与铲彻底混合。
    3. 将这种混合物转移到真空干燥, 将混合物暴露于低压 (200 mTorr, 0.3 毫巴) 20 分钟, 直到所有的气泡都消散为止。
  2. 放置一个 13 x 13 毫米玻璃幻灯片在一个塑料螺丝顶部填充20毫升2丙醇, 然后把瓶子放在一个超声波浴, 以10分钟, 以消除任何大碎片。将幻灯片浸入新鲜的2丙醇 (100 毫升) 中, 并在氮气流下晾干, 以洗涤滑梯。
  3. 将硅母版18放入4厘米直径的培养皿中, 并添加足够的脱气预聚体混合物 (从步骤 1.1) 直到完全覆盖。通常, 100 µL 是 20 x 20 mm 的主控形状所必需的。将主与预聚体混合物放在真空 dessicator 中。将聚合物再加5分钟, 以除去在混合物转移过程中形成的任何气泡。O2等离子处理的玻璃幻灯片 (步骤 1.4) 应在进行脱气时进行。
  4. 用 O2等离子 (600 mTorr) 在最大射频功率下处理玻璃方块, 以1分钟去除任何有机污染, 并在玻璃上产生均匀的氧化物层, 以粘合弹性体。19在下一步中立即使用等离子处理过的幻灯片。
  5. 小心地将方形玻璃滑块 (从步骤 1.4) 放在母版上的预聚物上 (从步骤 1.3) 与等离子清洗侧朝下。轻轻地按下玻璃滑向硅大师, 以消除任何被困的空气, 并确保一个统一的胶片在主和幻灯片之间夹。
  6. 把夹在上面台阶上的夹心的, 在一个培养皿与硅大师在底部 (, 与玻璃幻灯片背面朝上), 并把盘子放在烤箱在70−80°c 24−48 h 加热治疗。
  7. 从烤箱中取出已固化的阵列, 并允许冷却15分钟, 然后用剃刀刀片小心地从玻璃滑梯的背面和两侧取出任何多余的硅烷, 并使用一股干氮气吹走任何松散的硅烷碎片。
    注: 注意不要用刀片刮掉硅师傅, 因为这可能会损坏不粘涂层。
  8. 将刀片楔入阵列的角, 深度为1毫米, 并仔细地将阵列与主控形状分开。在一个连续的提升动作中执行此操作;不允许阵列回退到主控形状。
  9. 小心地削减和刮走了0.5 毫米的在阵列边缘与刀片刀片。使用一条干氮气来吹走任何松散的。
    注意: 在立体镜或放大镜下执行此修剪步骤可能更容易。注意不要用剃刀刀片刮掉硅师傅, 因为这可能会损坏不粘涂层。

2. 阵列准备和衬底安装

  1. 用 O2等离子处理在探针阵列上生成亲水性表面:
    1. 将在培养皿中的 PPL 笔阵列放入等离子腔, 然后将真空应用于 600 mTorr。开关在等离子发生器 (最大设置) 三十年代。
    2. 释放真空, 删除阵列, 并检查其亲水性通过下降20µL 的去离子水到阵列, 并观察是否有甚至蔓延的水在水面上。如果不发生这种情况, 则将阵列放到第二轮等离子处理上。之后, 用一股干氮气彻底干燥阵列。
  2. 使用双面碳带, 将阵列连接到探头支架的中间。将探头支架安装到 AFM 运动支架上 (图 2)。
  3. 要用 16-巯基酸 (MHA) ("墨迹") 加载 PPL 数组:
    1. 1毫米 16-巯基酸 (MHA) 溶液通过溶解8.6 毫克在30毫升乙醇在管子和放置它在一个超声波浴为10分钟完全溶化化合物。
      警告:16-巯基酸是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
    2. 使用微, 在阵列上存入20µL 的 MHA 解决方案。避免与阵列接触吸管提示。允许它扩散到整个阵列, 然后允许乙醇在环境条件下蒸发。
      注意: 在进行对齐后, PPL 阵列也可以进行墨迹绘制。10
  4. 一旦 MHA 溶液干了, 将探头持有者与 PPL 阵列装入 AFM。

3. 为人的黄金基质的制备。

  1. 黄金基质可以购买, 或由热或电子束沉积内部, 并建立了2纳米钛粘接层, 其次是20纳米金的玻璃或硅片。18
  2. 必要时, 使用步骤1.4 中描述的参数, 用氧等离子体处理来清洁基体。
  3. 将金基板置于 AFM 样品阶段的中间, 并在衬底的边界周围用胶带固定 (图 2)。使用z轴控制器将舞台调整到正确的高度, 如制造商的操作说明所示。

4. 笔阵列的自动对准

  1. 打开并运行计算机上的舞台控制器安装程序 (SetupNSF.exe), 将所有坐标轴和角度重置为预先校准的零点, 然后使用舞台x/y轴控制器控制台将基板移动到所需的对齐位置/打印位置。为获得最佳结果, 基板应放置在舞台中心附近, 在舞台的力传感器之间。
    注意: 在某些型号的计算机中, x/y轴控制器 USB 信号可能会干扰z轴控制器。如果出现这种情况, 请在该步骤之后断开x/y轴控制器 USB 电缆。然后在对齐过程 (步骤 4.7) 之后重新连接它。
  2. 切换舞台释放拉杆以释放采样阶段, 并激活力传感器的三重, 如 AFM 制造商的说明所示。允许力传感器平衡至少15分钟。为获得最佳结果, 请允许30-50 分钟。
  3. 通过直观地观察探头阵列和曲面, 增加 z 轴高度, 使阵列与衬底接近。
    注意: 数组与曲面的距离越近, 对齐过程所需的迭代就越少, 从而节省了时间。
  4. 打开/运行自动对齐程序 (自动对齐 v16.exe), 并在程序中输入相关的对齐参数。
    1. 输入所需的 "角度步长" 参数值, 通常为0.15°。此参数是由程序确定的每个坐标轴的 "最佳" 角度的偏移角度。在0.1 和0.2°之间设置这个参数, 因为比这个范围低的角度不会在探针到表面的方法上产生明显的可探测的力差。
      注: 软件接受 millidegrees 中的值(即1 x 10-3 °)。例如, 对于 0.15°, 用户应该输入 "150"。
    2. 输入所需的粗步长参数值, 通常为0.6 µm。此参数是阶段使用的 z 轴步长, 当它接近初始粗对齐时的探头时。将此参数设置为0.2 到1µm. 较大的步长减小了对齐过程所用的时间, 但降低了对齐的精度, 并增加了探头的磨损。
      注意: 软件接受微米级粗步骤的值。例如, 对于0.6 µm 用户应该输入 "0.6"。
    3. 输入所需的 "精细步骤" 参数值, 通常为0.2 µm。此参数是用于微调最佳对齐方式的 z 轴步长。对于大多数应用程序, 请在0.1 和0.4 µm 之间设置此参数. 较大的值步长将减少对齐过程所需的时间, 但会降低对齐的质量。
      注意: 软件接受微米级精细步骤的值。例如, 对于0.2 µm, 用户应该输入 "0.2"。
    4. 通过使用 "文件夹" 图标、导航到文件位置并按 "确定", 配置 "Excel 文件路径" 并附加所提供的电子表格模板文件的未修改副本。此文件包含用于确定舞台最佳阶段倾斜角度的原始数据和计算结果。
  5. 打开/运行 AFM 控制软件。通过单击 "光谱学" 按钮 (根据制造商的说明) 导航到该程序的光谱学组件, 并将 AFM 扫描头 z 轴设置为10µm 100 毫秒的振荡, 暂停时间为250毫秒, 然后收回10µm 超过100毫秒暂停时间为250毫秒 (图 3)。
  6. 当 AFM 头振荡时, 单击对齐软件的 "开始" 按钮开始自动对齐过程。程序运行时, 软件正在编写和读取步骤4.4.4 中描述的文件中的数据。
    注意: 根据步骤4.3 中设置的初始阶段位置和在步骤4.4 中输入的软件配置, 对齐过程需要30分钟和3小时。
    注意: 在对齐过程中, 舞台控制器控制台仍然处于活动状态-不要在对齐过程中使用它们, 因为它会干扰对齐。
  7. 当对齐完成后, 对齐软件 (从步骤 4.4) 中的绿色灯箱 "对齐" 将被亮起。发生这种情况时, 请单击用户界面上的 "停止" 按钮以结束对齐过程。
  8. 检查电子表格模板文件中的图表, 以获得记录的数据点与软件生成的线条匹配之间的相关性。参见代表性结果为例子的一个好相关, 以典型的 R2价值 > 0.99。如果对齐方式不成功, 请用新准备好的阵列 (步骤 2) 替换探头阵列, 然后重复对齐 (步骤 4.4)。
  9. 使用该轴的舞台控制器控制台在z轴上向上移动舞台。该阶段应以 500 nm 的增量移动, 直到接触可以看到从 AFM 的顶部观看相机。阵列和基体之间的接触可以被观察为一个 "白色点" 的高对比度在单个探针金字塔的顶点。
  10. 此时, 单击 AFM 控制软件上的 "停止" 按钮, 停止步骤4.5 中的光谱学程序。这将收回阵列10µm, 因此留下10µm 可能的 z 轴扩展。检查从 AFM 的顶部查看相机的图像, 以确保探头不与基体接触。

5. 聚合物笔光刻 (PPL)

  1. 通过单击控制软件上的 "光刻" 按钮, 导航到控制软件的光刻组件。选择z调制操作模式并导入将用作光刻图案的光栅 (位图) 或矢量图像。为了生成代表结果中显示的功能, 请使用包含 20 x 20 个黑色像素 (参见补充材料) 的位图, 对应于在 PPL 阵列上每个探头的 20 x 20 点的网格光刻。
  2. 在 AFM 控制器软件的 "像素图形导入" 窗口中输入光刻参数。
    1. 配置要生成的模式的 "大小",例如, 40 µm 的长度和宽度。这些参数指示将缩放位图中图像的宽度和长度。要生成代表结果中显示的功能, 请在两个维度中使用40µm 的宽度和长度。
    2. 将图案的 "原点" 设置为在xy轴上以25µm 生成。这些参数确定图像的中心相对于 AFM x/y轴的中心。设置这些参数以避免在对齐过程中探头处于接触面的区域。
    3. 设置打印 "参数"。这些值决定了如何将探测器扩展 (即与曲面接触) 以响应位图图像中的每个像素。
      1. 从下拉菜单中选择 "调制 Abs Z Pos", 然后 "简化为" 两层。此模式指示 AFM 将探针扩展到仅由两个结果确定的绝对距离, 即 "黑色 (0)" 或 "白色 (1)" 字段。
      2. 分别将 "黑色 (0)" 和 "白色 (1)" 字段中的值设置为5和-5 µm。这些值决定了探测器应在位图图像上的黑色或白色像素之间移动的距离, 通常在3和5µm 之间设置为 "黑色" (, 相对于该轴的零点, 将探头向下延伸到该距离)。-3 至-5 µm 为 "白色" (, 相对于零点, 将探头向上提取3到5µm)。
        注意: 这些代表距离假定5µm 的延伸会导致探头接触到表面, 从而产生一个特征, 而5µm 的退出会将探头从表面上抬起, 从而导致没有接触。Z扩展通过确定与曲面的探针接触范围来影响特征大小, 更大的扩展导致探头被进一步压入表面, 从而产生较大的特征。10
      3. 单击 "确定" 按钮以实现这些设置并关闭窗口。
  3. 在 AFM 控制软件的光刻窗口中输入 "暂停时间", 通常为1秒。此设置确定探测器在扩展的 "黑色" 位置中保持的时间长度, 通常设置在0.1 和十年代之间。
    注: 较长的停顿时间会导致较大的特征尺寸, 原因是 MHA 运输到黄金表面的量较大。有关控制生成的功能大小的进一步详细信息, 可在其他报告中找到。20
  4. 准备大气控制罩。
    1. 将大气隔离室降低到 AFM 上, 打开/运行制造商提供的大气控制软件 (MHG_control)。
    2. 设置大气控制软件, 以保持相对湿度为 45%, 温度为25摄氏度, 大气交换 ' 流量 ' 的500毫升通过输入这些值到软件中。单击 "使用" 以实现设置。然后, 大气控制模块将开始将空气中的湿润气体注入室内。
      注: 由于在笔阵列和曲面之间形成较大的水半月板, 因此较高的湿度水平会导致较大的特征尺寸。21此值通常设置在40和60% 之间。流量通常设置在300和500毫升之间。较大的流量使所需的湿度水平能够更快地到达, 但不太准确。代表结果使用500毫升的流速为初始的湿度, 并减少到300毫升后达到预期的湿度, 以保持准确和稳定的水平, 在光刻。
  5. 一旦获得所需的湿度, 请按软件界面上的 "开始" 按钮启动平版序列。
  6. 在光刻完成后, 使用 z 轴级控制器控制台将基板从阵列中移开, 并将舞台缩回500µm。然后将大气隔离室从其安装中移除。
  7. 切换舞台释放拉杆以锁定采样阶段并停用力传感器, 如 AFM 制造商的说明所示, 然后从舞台上移除基板。

6. 模式可视化

  1. 可以使用以下方法之一可视化模式: 横向力扫描探针显微镜或化学蚀刻。
  2. 用接触模悬臂法对具有侧向力模式的 AFM 上的阵列表面进行扫描, 检查无损检测的特性。
    注: 横向力显微镜可作为一种无损的方法来观察聚合物笔光刻所产生的特征;但是, 使用这种方法, 只有相对较小的区域才能被可视化 (通常为 100 x 100 µm)。
  3. 由于沉积的 MHA 可以作为蚀刻抗蚀剂, 化学蚀刻可用于从非图案化区域中除去黄金。由此产生的 unetched 区域可以通过光学显微术进行可视化, 这意味着可以同时查看一个广阔的区域。18
    注意: 用这种方法蚀刻的基底不能用于随后的细胞培养实验。
    1. 分别制备40毫米硫脲、27毫米铁 (III) 硝酸盐和100毫米盐酸的水溶液。通过混合5毫升的这三解决方案, 准备蚀刻。新的混合之前, 每次使用。22
      注意: 硫脲, 铁 (III) 硝酸盐和盐酸是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
    2. 将图案的基板转移到培养皿中, 并将足够的蚀刻溶液注入盘中, 以覆盖基体表面 (通常为10毫升)。将基底浸入4-5 分钟以蚀刻15纳米金 (以近似 3 nm/分的速度)。
    3. 当蚀刻完成后, 取下基体, 用清水彻底冲洗, 用氮气流干。
      注: 蚀刻过程的完成是由获得的金表面厚度 (步骤 3.1) 与指定的蚀刻速率 (步骤 6.2.2) 决定的。
    4. 在光亮场光学显微镜下检查蚀刻金的特征。剩余的黄金功能应与打印的模式 (从步骤5.2 中) 相应显示。如果整个表面看起来均匀, 这表明有大量的黄金残留, 蚀刻步骤 (以下步骤 6.2.2) 应重复1-2 分钟。

7. 纤维连接蛋白的模式功能化

  1. 将花纹基质浸入乙醇中1毫米 (11-mercaptoundecyl) 六 (乙二醇) 溶液中, 1 小时. 用乙醇洗涤基体三次, 在氮气流下彻底干燥。这一步钝化了 unpatterned 黄金地区。
    注意: (11-mercaptoundecyl) 六 (乙二醇) 是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
  2. 将基体浸入10毫米 (NO3)2水溶液中5分钟。接着, 从溶液中取出基板, 用超纯水清洗三次, 在干氮气流下干燥。
    注意: Co (3)2是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
  3. 将基质浸泡在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的50µg/毫升的纤维连接蛋白溶液中, 在4摄氏度处孵育16小时. 用 PBS 洗涤基体三次, 然后在干氮气流下干燥基体。
    注: 纤维连接蛋白通过 MHA 上的羧酸组螯合 (II.) 与 MHA 功能区结合。纤维连接蛋白然后通过其胶原结合的领域绑定到 Co (II.)。23
  4. 如果需要, 用荧光抗体对表面约束的纤维连接蛋白进行标记:
    1. 应用2毫升溶液1:100 游离兔抗纤连蛋白原抗体 5% (w/v) 的牛血清白蛋白 (BSA) 在 PBS 到表面和孵化4°c 为 16 h. 吸上清液, 用 PBS 洗三次。
    2. 将基质浸泡在2毫升溶液中, 荧光共轭抗兔二级抗体 (在制造商指定的稀释, 2 滴/毫升) 的 5% (瓦特/v) 的 BSA 在 PBS, 覆盖在锡纸, 并在室温孵育1小时. 吸入上清和洗三次与 PBS。
    3. 根据制造商的说明, 使用荧光显微镜记录荧光显微图像的特征, 并将励磁过滤器设置为 594 nm。

8. nanofabricated 表面的细胞培养

  1. 准备悬挂在4和6的通道之间的良好特征的 hMSCs.24
    1. 通过冲洗一次与10毫升 PBS, 离解黏附的细胞, 通过添加5毫升的胰蛋白酶/EDTA 进入 T75 组织培养瓶, 并孵化瓶在一个湿润的房间37°c 补充 5% CO2 , 直到 5 o, 暂停一个汇合瓶f 细胞从表面分离出来。
    2. 随后, 添加6毫升新鲜培养基, 其中含有10% 胎犊牛血清 (FCS) 到烧瓶中, 并通过添加培养基对烧瓶进行简要冲洗。将电池悬浮液转移到15毫升离心管中, 离心机在400克, 25 摄氏度, 5 分钟。
    3. 去除3毫升新鲜培养基中的上清和并用重悬细胞颗粒。
    4. 使用 hemocytometer25计算细胞密度, 并通过添加适当数量的培养基将细胞悬浮密度调整为 2 x 104细胞/毫升。
  2. 将细胞播种到基质上, 密度为 104细胞/厘米2
    1. 将基体切成 1 x 1 厘米2 , 并将其放在12井组织培养板中的井中。
    2. 吸管2毫升细胞悬浮在文化媒介 (从步 8.1.4) 入井和孵化在一个湿化的房间在37°c 补充与 5% CO2为 24 h。
  3. 细胞生长后的模式, 分析细胞附着的程度和传播免疫荧光:
    1. 用 PBS 去除介质并清洗基底。固定细胞与2毫升溶液的4% 多聚甲醛在 pbs (预热到37°c) 20 分钟在油烟机和洗涤三次与 PBS。
      注意: 多聚甲醛是有毒的。在使用此解决方案之前, 请阅读 MSDS。在处理化学品时必须佩戴安全设备。
    2. Permeabilize 细胞与2毫升溶液0.5% 洗涤剂 (参见材料表) 在 pbs 为15分钟, 然后洗涤三次与 pbs。
    3. 将基质浸泡在2毫升的游离兔抗纤连蛋白原抗体稀释1:100 与 5% (瓦特/v) BSA 在 pbs 和孵化在4°c 16 小时, 然后洗三倍 (v/v) 补间0.1% 在 pbs (PBST)。
    4. 随后将基质浸泡在2毫升的溶液中, 荧光共轭抗兔二级抗体 (在 PBS 中稀释 5% (瓦特/v) BSA, 在制造商指定的稀释, 2 滴/毫升), 覆盖在锡纸和孵化在室温下的1小时,然后用 0.1% PBST 洗三次。
    5. 为了标记肌动蛋白花丝, 淹没2毫升的荧光共轭罗丹明在 PBS 稀释 1:250, 盖在锡纸和孵化在4°c 30 分钟然后洗三次与 PBS。
    6. 同时使用含有 DAPI 和盖玻片的安装介质的下落, 同时染色细胞核并安装基体。
  4. 可视化细胞使用荧光显微镜根据制造商的指示, 与励磁过滤器365毫微米为核 (DAPI), 488 毫微米为 F 肌动蛋白和594毫微米为纤维粘连蛋白。

Representative Results

为了检查自动对齐是否成功, 已检查从对齐数据 (在步骤4.8 中的电子表格中) 绘制的图表。如果对齐过程成功, 则两个地块对应于采样阶段沿θ和φ轴倾斜的角度, 显示了一系列上升和下降的数据点。在每个地块中, 两个数据点的线性拟合显示了一个定义良好的相交 "峰值", 表示最大z扩展和实现对齐的相应角度 (图 4A 和 4B)。此过程重复四次 (每轴两次), 并绘制为一组四坐标。因此, 每对坐标的交集都显示出整体最佳角度 (图 4C)。13在对齐不成功的情况下, 可以观察到, 它们对应的θ和φ角图不提供高质量的线性匹配, 或者不相交 (图 5)。这种失败的对齐通常是由于阵列被不正确地修剪或装入探头持有者 (步骤1.7、1.8 和 2.2)。在这些情况下, 数组被丢弃, 一个新的准备和装载 (步骤1和 2), 并重复对齐过程 (步骤 4)。

成功地对齐和 MHA 后, 用侧向力显微镜对花纹金基片进行成像, 检查是否发生了沉积。对印刷表面进行更大面积的检查时, 还通过基体的光学显微镜对未被沉积的硫醇保护的金进行蚀刻 (图 6图 7)。但是, 蚀刻图案不能用于进一步的功能化, 只应用于确认一批印刷表面基板的代表性样品的图案。如果蚀刻图案显示与单个钢笔对应的空白区域 (图 8), 则此结果指示探测阵列的生产未成功完成, 并且某些探头已损坏或丢失。探测器的这种不均匀性可能是由于使用了氟涂层已磨损的老主控形状 (步骤 1.3), 导致在阵列与主控形状分离时, 一些探头被撕掉。在这些情况下, 应使用新的主控形状。结果也可能是由于在玻璃衬底和主 (步骤 1.5) 之间存在气泡, 或者在固化后探头阵列与主控形状没有完全分离 (步骤 1.8)。

荧光灯显微图像的纤维连接蛋白功能性表面孵化 hMSCs 也收集 (图 9)。一般情况下, 所有基质在体外培养环境中都是稳定的, 细胞在被隔离的 20 x 20 组特征的情况下附着并适应了印刷图案的形态。

Figure 1
图1。聚合物笔光刻的示意图表示,通过探针尖端的水半月板显示分子墨水的传输.(a) 侧面视图和 (B) 聚合物笔阵列的顶部视图表明, 当探头阵列和表面基板完全对准时, 所有探头同时与表面接触, 导致并行光刻。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。聚合物笔光刻原理图成立.(A) 扩大了实验装置的侧面视图, 准备好的探头阵列附着在探针支架上, 安装在 AFM 扫描仪上。基板放置在舞台上, 下面是三力传感器的位置。(B) 装配式仪器的表示, 显示 AFM 扫描头相对于样品阶段。(C) 显示力传感器位置的底部视图。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。描述对齐过程的光谱学程序的示意图表示法.AFM 扫描仪被设置为在100毫秒内, 在250毫秒的位置进行10µm 的探针, 然后在100毫秒内收缩10µm, 然后在收回的位置为250毫秒举行。然后在整个对准过程中重复该运动。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。图示成功对齐的图表.z 位置图对倾斜角度 (A) θ和 (B) φ为一个成功的对齐, 在那里表明测量的实际值和+表明最适合用最小二乘法。(C) φ与θ拟合角度的关系图, 达到最大 z 位置的四点。标记的交点是两个轴的最终最佳倾斜角度。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。图示不成功的对齐方式.z 位置图对倾斜角度 (A) θ和 (B) φ为一个不成功的对齐, 在那里指示测量的实际值和+表明最适合用最小二乘法。(C) φ与θ拟合角度的关系图, 达到最大 z 位置的四点。没有明确的最优或相交点, 因此不解决最佳对准角。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。说明光学显微学和原子力显微图像的黄金基质, 被排列的 MHA 阵列, 然后蚀刻.(a) 和 (B) 依次放大蚀刻图案的光学显微图像;(C) 是一个单一模式网格的 AFM 地形图像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图7。MHA 被排列的 PPL 阵列, 然后蚀刻的金色基底的光学显微图像.(a) 和 (B) 依次放大蚀刻图案的光学显微图像, (C) 是一种显示大面积均匀图案的低放大图像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图8。说明了一种金色基体的光学显微图像, 它的 MHA 不均匀, 然后蚀刻.预定的模式 (显示在嵌入) 是重复网格20点线排列在20行, 每两条线产生的z轴延长1µm (范围从5到-5 µm)。可以看到, 在某些区域, 由于在这些位置中缺少探测器, 因此不会生成任何模式。在仅产生两行点的区域中, 此结果表示探测器存在, 但它与完全运行的探头的高度不相同, 因此仅当阵列扩展到完全z轴距离时才会沉积特征。在这个图像中, 对比度被刻意改变, 以使观察部分印刷区域。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图9。荧光显微图像的 hMSCs 培养的纤维粘连蛋白阵列模板的人.(a) 和 (B) 是显示单个细胞的高放大图像。(C) 在没有附着单元的情况下显示纤连阵列的示例模式, (D) 是在网格排列中培养的单元格的广域图像 (在镶嵌图中也显示了印刷图案的示意图)。细胞染色显示纤维粘连蛋白 (红色), F 肌动蛋白 (绿色) 和细胞核 (蓝色)。请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

该协议为用户提供了一种方便的方法, 可以快速地实现高均匀性和可控制的功能大小 (cm2) 区域的 nanolithographic 模式。这些大面积 nanopatterns 的衬底可以为各种应用进一步阐述。这项技术的一个主要应用是在 nanofabricated 表面进行细胞表面相互作用研究。本报告展示了这些材料的细胞培养的一些例子, 展示了 nanofabricated 基质对 hMSC 形态的控制。

此协议的关键启用程序是对齐过程 (步骤 4) 的自动化, 它允许在表面上高度均匀和高通量的功能生产, 降低到纳米尺度分辨率, 从而实现细胞培养实验的快速周转。采用这种对准算法进行的聚合物笔光刻能够在大约30分钟内产生纳米尺度特征。自动对齐的再现性和准确性, 从而使图案化特征的一致性, 但严重依赖于所产生的探针阵列的质量 (步骤1和 2)。在准备过程中产生钝、折断或缺失探针的任何缺陷;如陷气气泡 (步骤 1.5) 或不正确的分离探针从主 (步骤 1.8) 可能导致不准确的对准和质量差光刻。

此报告方法与依赖于强制反馈的其他对齐方法共有一个限制。准确地确定探针与表面接触时, 由于需要考虑环境环境和样品阶段的运动引起的背景振动而受到限制。一般而言, 传感器在µN (本例中为2µN) 中具有强制灵敏度, 但对齐算法的设计目的是只注册至少490µN 的力作为探头和表面之间的最终接触, 以避免任何 "误报" 结果从背景噪音。13因此, 这种方法倾向于产生大的特征 (1-2 µm), 因为探头必须在z轴上扩展一个很大的距离 (随之而来的是更高的力), 以便注册接触。为了补偿, 更小的功能可以通过减少光刻步骤中的z轴距离来生成 (例如, 在步骤5.2.3.2 中输入 "黑色" 设置, 而不是5µm)。

尽管如此, 即使有了这一限制, 自动化算法也能够解决并行扫描探针光刻方法的应用中的一个关键方面, 因为对齐以前是最需要时间和不精确的步骤。这些技术的实施。这种自动化现在将制造过程的速率限制步骤从对齐到平版书写本身。虽然本协议演示了这种对齐程序在 PPL 中的应用, 但该框架可以应用于一些 SPL 技术, 如脂质 DPN26和矩阵辅助光刻27以及未来潜在的催化探头系统。28

Disclosures

对齐算法和软件由曼彻斯特大学开发, 并且是专有的。可在 http://www.click2go.umip.com/下载。

Acknowledgments

作者承认包括英国工程和自然科学研究理事会在内的各种来源提供的财政支持 (赠款裁判。EP/K011685/1, EP/K024485/1) 和奖学金毕业生;Leverhulme 信托基金 (RPG-2014-292);威康信托机构战略支助基金 (105610/z/14/z);英国的理事会 (216196834);和曼彻斯特大学曼彻斯特大学研究所 (UMRI 泵启动基金) 和总统博士奖学金的 SW. 李博士 (Nanosurf AG) 的技术援助也得到了赞赏。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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References

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基于自动对准的大面积扫描探针光刻及其在细胞培养研究中的应用
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Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

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