यहां हम व्यापक क्षेत्र स्कैनिंग जांच के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान nanolithography जांच arrays के चलने संरेखण द्वारा सक्षम है, साथ ही साथ सेल के लिए lithographic पैटर्न के उपयोग-सतह संपर्क अध्ययन ।
स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी रचनात्मक के लिए तरीकों की एक किस्म के निर्माण को सक्षम किया गया है (‘ additive ‘) नैनोमीटर पैमाने पर सुविधाओं के ऊपर से नीचे निर्माण । ऐतिहासिक, स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी की एक बड़ी खामी एक जांच प्रणालियों के आंतरिक रूप से कम प्रवाह किया गया है । यह कई जांच की arrays के उपयोग से निपटने के लिए वृद्धि हुई nanolithography प्रवाह को सक्षम किया गया है । आदेश में इस तरह के समानांतर nanolithography को लागू करने के लिए, सब्सट्रेट सतह के साथ जांच arrays के सटीक संरेखण महत्वपूर्ण है, ताकि सभी जांच सतह के साथ संपर्क बनाने के एक साथ जब lithographic patterning शुरू होता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन बहुलक कलम लिथोग्राफी के उपयोग के लिए सेंटीमीटर से अधिक नैनोमीटर पैमाने पर सुविधाओं का उत्पादन, क्षेत्रों आकार, तेजी से, सटीक, और जांच arrays के स्वचालित संरेखण के लिए एक एल्गोरिथ्म के उपयोग से मदद की । यहां, सोने के सब्सट्रेट पर thiols के nanolithography उच्च एकरूपता के साथ सुविधाओं की पीढ़ी को दर्शाता है । इन नमूनों तो सतह के संदर्भ में उपयोग के लिए fibronectin के साथ कार्यात्मक सेल आकृति विज्ञान अध्ययन निर्देशित कर रहे हैं ।
नैनो में प्रगति कुशलतापूर्वक और मज़बूती से सतहों पर नेनो सुविधाओं के निर्माण में सक्षम तकनीकों के विकास पर निर्भर है । 1 , 2 हालांकि, बड़े क्षेत्रों (एकाधिक सेमी2) मज़बूती से और अपेक्षाकृत कम लागत पर ऐसी सुविधाओं के सृजन एक गैर तुच्छ प्रयास है । सबसे मौजूदा तकनीक, अर्धचालक उद्योग से व्युत्पंन, पंचमी विभक्ति photolithography पर भरोसा करने के लिए ‘ मुश्किल ‘ सामग्री बनाना । हाल ही में, lithographic स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) से व्युत्पंन तकनीक नेनो डिजाइनों के तेजी से प्रोटोटाइप के लिए एक सुविधाजनक और बहुमुखी दृष्टिकोण के रूप में उभरा है । 3 एसपीएम आधारित तकनीक आसानी से और तेजी से ‘ लिखने ‘ किसी भी उपयोगकर्ता के पैटर्न परिभाषित करने में सक्षम हैं । इनमें से सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है डुबकी कलम nanolithography (DPN), Mirkin एट अलद्वारा बीड़ा उठाया है,4 जहां एक स्कैनिंग जांच एक ‘ कलम ‘ एक लेखन के अनुरूप फैशन में सुविधाओं का उत्पादन सतह के लिए एक आणविक ‘ स्याही ‘ हस्तांतरण करने के लिए के रूप में प्रयोग किया जाता है । परिवेश स्थितियों के तहत, एक जांच के रूप में एक सतह भर में स्कैन ‘ स्याही ‘ अणु एक पानी meniscus के माध्यम से सतह को हस्तांतरित कर रहे है कि जांच और सतह के बीच रूपों (चित्रा 1) । DPN इस प्रकार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के nanolithographic जमाव की अनुमति देता है, जैसे बहुलक और अणुओं के रूप में ‘ नरम सामग्री । 5 तरल पदार्थ वितरण के लिए चैनलों के साथ इंजीनियर जांच का उपयोग कर संबंधित तकनीक, विभिंन ‘ nanopipettes ‘ और ‘ नैनो फव्वारा ‘ कलम के रूप में संदर्भित, भी सूचित किया गया है । 6 , 7 , 8
एसपीएम-व्युत्पंन लिथोग्राफी के व्यापक आवेदन करने के लिए मुख्य बाधा प्रवाह है, के रूप में यह एक एक जांच के साथ एक जरूरत से ज्यादा लंबे समय के पैटर्न सेंटीमीटर पैमाने क्षेत्रों की आवश्यकता है । जल्दी से इस मुद्दे को संबोधित करने के प्रयास ब्रैकट के parallelization पर केंद्रित-आधारित DPN, दोनों ‘ एक आयामी ‘ और ‘ दो आयामी ‘ (2d) जांच arrays के लिथोग्राफी के लिए सूचित किया जा रहा है के साथ-क्षेत्रों आकार । 5 , 9 हालांकि, इन ब्रैकट arrays अपेक्षाकृत जटिल multistep निर्माण विधियों के माध्यम से उत्पादित कर रहे है और अपेक्षाकृत नाजुक हैं । बहुलक कलम लिथोग्राफी (पीपीएल) के आविष्कार नरम siloxane elastomer जांच के एक 2d सरणी के साथ मानक एसपीएम cantilevers की जगह एक गिलास स्लाइड के लिए बंधुआ द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया । 10 यह सरल जांच सेटअप काफी लागत और पैटर्न बड़े क्षेत्रों की जटिलता कम हो जाती है, आवेदनों की एक व्यापक रेंज के लिए खोलने nanolithography । इस ब्रैकट मुक्त वास्तुकला भी मुश्किल टिप नरम करने के लिए विस्तार किया गया है-वसंत लिथोग्राफी,11 जो कठिन सिलिकॉन का उपयोग कर उत्पादित पैटर्न की तुलना में बेहतर संकल्प देने के साथ नरम elastomeric समर्थन के एक संकर प्रदान करता है elastomer टिप्स.
इन 2 डी सरणी प्रौद्योगिकियों के निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि जांच सरणी बिल्कुल सतह सब्सट्रेट करने के लिए समानांतर इतना होना चाहिए कि जब लिथोग्राफी उपयोग किया जाता है, सभी जांच सतह के साथ संपर्क में एक साथ आते हैं । यहां तक कि एक छोटा सा संरेखण सरणी के दूसरे पक्ष से सुविधा के आकार में एक बड़ा अंतर पैदा कर सकता है, क्योंकि कुछ जांच सरणी के वंश के दौरान पहले सतह के साथ संपर्क में आ जाएगा, जबकि अंय संपर्क में बाद में आ जाएगा या बिल्कुल नहीं । 12 सटीक संरेखण नरम elastomer जांच की विकृति के कारण पीपीएल के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जहां पहले सतह से संपर्क की जांच संकुचित हो जाएगा, सतह पर एक बड़ा निशान जा रहा है ।
पर जल्दी काम पीपीएल विशुद्ध रूप से दृश्य निरीक्षण के लिए संरेखण प्रक्रिया गाइड कार्यरत है, एक सरणी के ऊपर घुड़सवार कैमरा का उपयोग करने पिरामिड जांच के विकृति का निरीक्षण के रूप में वे सतह के साथ संपर्क में लाया गया । 10 संरेखण देख कर ंयाय किया गया था जो जांच के पक्ष पहले सतह के साथ संपर्क में आया, तो कोण समायोजन और एक चलने तरीके से प्रक्रिया दोहरा जब तक जांच के प्रत्येक पक्ष पर संपर्क में अंतर था आंख को भेद । के रूप में इस संरेखण प्रक्रिया ऑपरेटर द्वारा व्यक्तिपरक दृश्य निरीक्षण पर निर्भर करता है, reproducibility कम है ।
बाद में, एक और अधिक उद्देश्य दृष्टिकोण विकसित किया गया है, एक शक्ति की सतह पर जांच के संपर्क पर लागू करने के लिए बल सब्सट्रेट नीचे घुड़सवार से मिलकर । 12 संरेखण इस प्रकार झुकाव कोण समायोजित करने के लिए लागू बल, जो संकेत दिया है कि सभी जांच एक साथ संपर्क में थे अधिकतम द्वारा प्राप्त किया गया था । इस विधि से पता चला कि संरेखण के भीतर ०.००४ ° सतह समानांतर संभव था । यह ‘ बल प्रतिक्रिया समतल ‘ अब दो स्वतंत्र रिपोर्टों में पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों में लागू किया गया है । 13 , 14 दोनों का उपयोग करें बल सेंसर की त्रय या तो सब्सट्रेट या ऊपर सरणी के नीचे घुड़सवार और जांच arrays और सतह के बीच संपर्क पर लागू बल की राशि को मापने । इन प्रणालियों उच्च परिशुद्धता दे, एक 1 सेमी लंबाई पैमाने पर,14 या ≤ 0.0003 ° १.४ सेमी से अधिक ≤ ०.००१ ° के ग़लतियों रिपोर्टिंग । इन स्वचालित संरेखण प्रणालियों भी ऑपरेटर समय और समग्र पूरा करने के लिए लिया समय में प्रमुख बचत प्रदान करते हैं लिथोग्राफी प्रक्रिया.
उच्च प्रवाह सतह निर्माण के एक प्रमुख आवेदन इस तकनीक द्वारा सक्षम सेल संस्कृति सब्सट्रेट की पीढ़ी है । अब यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सेल phenotype कोशिकाओं और सतह सुविधाओं के बीच प्रारंभिक संपर्क को नियंत्रित करने से चालाकी से किया जा सकता है, और है कि यह नेनो में बढ़ाया जा सकता है । 15 विशेष रूप से, स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी तरीकों को एक सतही विधि ऐसी कोशिका संस्कृति प्रयोगों के लिए nanofabricated सतहों की एक किस्म का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है । 16 उदाहरण के लिए, स्वयं के नेनो पैटर्न प्रस्तुत सतहों-इकट्ठे monolayers और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन पीपीएल और DPN द्वारा टेंपलेट को नैनो के क्षमता का अध्ययन किया गया है सामग्री प्रेरित भेदभाव में संशोधित सामग्री स्टेम सेल । 17
इस प्रोटोकॉल एक संशोधित परमाणु बल माइक्रोस्कोप (AFM) प्रणाली है कि बड़े क्षेत्र पीपीएल सक्षम बनाता है के उपयोग का वर्णन । हम विस्तार जांच-सतह से संपर्क का निर्धारण करने के साधन के रूप में बल का पता लगाने का उपयोग कर, एक एल्गोरिथ्म है कि चलने संरेखण प्रक्रिया को स्वचालित के साथ साथ । extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन fibronectin और मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSC) की संस्कृति के साथ इन नमूनों के बाद functionalization, पीपीएल के एक प्रदर्शन के रूप में वर्णित-निर्मित सतहों सेल संस्कृति के लिए लागू किया जाता है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सुविधाजनक पद्धति के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करने के लिए तेजी से बड़े (सेमी2) क्षेत्रों पर उच्च एकरूपता और नियंत्रणीय सुविधा के आकार के साथ nanolithographic पैटर्न बाहर ले कार्य करता है । इन बड़े क्षेत्र nanopatterns असर सब्सट्रेट तो आगे अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए सविस्तार कर सकते हैं । इस प्रौद्योगिकी के एक प्रमुख आवेदन सेल सतह संपर्क अध्ययन के लिए nanofabricated सतहों की पीढ़ी में है । इस रिपोर्ट में इन सामग्रियों पर सेल संस्कृति के कुछ उदाहरण दिखाता है, nanofabricated सब्सट्रेट द्वारा hMSC आकृति विज्ञान के नियंत्रण का प्रदर्शन ।
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सक्षमीकरण संरेखण प्रक्रिया (चरण 4) है कि अत्यधिक समान और उच्च प्रवाह के उत्पादन की अनुमति देता है के स्वचालन है सतहों पर नेनो संकल्प है, जो सेल संस्कृति के प्रयोगों के तेजी से कारोबार में सक्षम बनाता है के लिए नीचे । बहुलक कलम इस संरेखण एल्गोरिथ्म का उपयोग किया लिथोग्राफी लगभग 30 मिनट के भीतर नेनो सुविधाओं को उत्पंन करने में सक्षम है । reproducibility और स्वचालित संरेखण की सटीकता, और इस प्रकार पैटर्न सुविधाओं की एकरूपता, लेकिन गंभीर रूप से जांच arrays कि उत्पादित कर रहे है की गुणवत्ता पर निर्भर है (चरण 1 और 2) । उनकी तैयारी में कोई खामियां है कि कुंद, टूट या लापता जांच में परिणाम; इस तरह के रूप में फंस हवाई बुलबुले (चरण १.५) या मास्टर से जांच की अनुचित जुदाई (चरण १.८) गलत संरेखण और गरीब गुणवत्ता लिथोग्राफी में परिणाम कर सकते हैं ।
इस विधि रिपोर्ट बल प्रतिक्रिया पर निर्भर करते हैं जो अन्य संरेखण विधियों के साथ सामान्य में एक सीमा साझा करता है । जब जांच सतह के साथ संपर्क में है का सही निर्धारण परिवेश वातावरण और नमूना चरण के आंदोलन की वजह से पृष्ठभूमि कंपन के लिए खाते की जरूरत से विवश है । । सामान्य में, सेंसर µN शासन में एक बल संवेदनशीलता है (इस मामले में 2 µN), लेकिन संरेखण एल्गोरिथ्म केवल जांच और सतह के बीच निश्चित संपर्क के रूप में कम से ४९० µN के एक बल रजिस्टर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, आदेश में किसी भी ‘ झूठी सकारात्मक ‘ से बचने के लिए रेसुल पृष्ठभूमि शोर से टिंग । 13 इस प्रकार, इस विधि के लिए बड़ी सुविधाओं का उत्पादन (1-2 µm) के बाद से जांच z-धुरी पर एक बड़ी दूरी (एक फलस्वरूप उच्च शक्ति के साथ) विस्तारित करने के लिए संपर्क रजिस्टर करना चाहिए जाता है । क्षतिपूर्ति के लिए, छोटे सुविधाओं z-अक्ष दूरी लिथोग्राफी चरण के दौरान यात्रा को कम करने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता (जैसे, चरण 5.2.3.2 में ‘ ब्लैक ‘ सेटिंग में प्रवेश 5 µm के बजाय 3 µm के रूप में).
फिर भी, यहां तक कि इस सीमा के साथ, स्वचालन एल्गोरिथ्म समानांतर स्कैनिंग जांच लिथोग्राफी तरीकों के आवेदन में एक महत्वपूर्ण पहलू को संबोधित करने में सक्षम है, संरेखण पहले सबसे अधिक समय की मांग की थी और में गलत कदम इन तकनीकों का कार्यांवयन । इस स्वचालन अब दर-संरेखण से निर्माण की प्रक्रिया के कदम सीमित बदलाव lithographic को ही लेखन । हालांकि इस प्रोटोकॉल पीपीएल के लिए इस संरेखण प्रक्रिया के आवेदन को दर्शाता है, फ्रेमवर्क ऐसे लिपिड के रूप में SPL तकनीक की एक संख्या के लिए लागू किया जा सकता है-DPN26 और मैट्रिक्स-लिथोग्राफी27 सहायता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित भविष्य उत्प्रेरक जांच प्रणाली । 28
The authors have nothing to disclose.
लेखक ब्रिटेन के इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान refs सहित स्रोतों की एक किस्म से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । ep/K011685/1, ep/K024485/1) और झारखंड के लिए एक स्नातक की छात्राओं; Leverhulme ट्रस्ट (आरपीजी-2014-292); वेलकम ट्रस्ट संस्थागत रणनीतिक सहायता कोष (105610/जेड/14/ ब्रिटिश परिषद (२१६१९६८३४); और मैनचेस्टर के विश्वविद्यालय के एक विश्वविद्यालय के लिए अनुसंधान संस्थान (ऊमरी पंप भड़काना कोष) और एक राष्ट्रपति डॉक्टर के लिए छात्रवृत्ति SW । डॉ एंड्रियास Lieb (Nanosurf एजी) द्वारा तकनीकी सहायता भी आभार स्वीकार किया है ।
Equipment | |||
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage | NanoSurf | P40008 | |
AFM control software | NanoSurf | C3000 | |
Engraving pen | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
Plasma Cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
Economy Dry Oxygen Service Pump | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
Tube Rotator | Stuart | SB3 | |
Vacuum Desiccator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
Milli-Q Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
Modular Humidity Generator | proUmid | MHG32 | |
Proline Plus Pipette 100-1000 µL | Sartorius | 728070 | |
Silicon masters | NIL Technology | custom-made | |
Upright snapshot fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
Microscope objectives | Olympus | 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
Upright bright field microscope | Leica | DM 2500M | |
Ultrasonicator | Ultrawave Ltd. | U95 | |
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results | Microsoft | Excel | |
Reagent | |||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34863 | FLAMMABLE |
Microscope Sildes, Clear, Ground | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated | Gelest | VDT-731 | |
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane | Gelest | SIT7900.0 | |
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution | Sigma-Aldrich | 479527 | HARMFUL, TOXIC |
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated | Gelest | HMS-301 | |
Weigh Boat 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
Pasteur pipette | Appleton Woods | KS230 | |
Petri dish | SARSTEDT | 82.1473 | |
Razor blade | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
Adhesive Carbon Tape | Agar scientific | AGG3939 | |
16-Mercaptohexadecanoic acid | Sigma-Aldrich | 448303-1G | HARMFUL, TOXIC |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | FLAMMABLE |
Gold coated microscope slide | Sigma-Aldrich | 643203 | Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | HARMFUL, TOXIC |
Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 529303 | HARMFUL, TOXIC |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84415 | HARMFUL, TOXIC |
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 675105 | HARMFUL, TOXIC |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Cobalt(II) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 203106 | HARMFUL, TOXIC |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza UK | PT-3001 | |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza UK | PT-2501 | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
CELLSTAR Centrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | HARMFUL, TOXIC |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "Detergent" in manuscript |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Rabbit anti-fibronectin antibody | Abcam | ab2413 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
12-well plate | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
T75 tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
cantilever | BudgetSensor | ContAl-G |