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Bioengineering

Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule

doi: 10.3791/56967 Published: June 12, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Qui presentiamo un protocollo per wide area scansione sonda nanolitografia attivata per l'allineamento iterativo di sonda matrici, come pure l'utilizzo di modelli litografici per studi di interazione della cellula-superficie.

Abstract

Microscopia a sonda di scansione ha permesso la creazione di una varietà di metodi per la realizzazione di top-down ("additiva") costruttiva delle caratteristiche su scala nanometrica. Un grave inconveniente di scansione sonda Litografia è storicamente il throughput intrinsecamente basso dei sistemi di singola sonda. Questo è stato affrontato mediante l'uso di matrici di sonde multiple per consentire velocità effettiva maggiore nanolitografia. Al fine di attuare tale nanolitografia parallelizzata, l'allineamento preciso delle matrici di sonda con la superficie del substrato è vitale, in modo che tutte le sonde fare contatto con la superficie simultaneamente quando inizia la campitura litografica. Questo protocollo viene descritto l'utilizzo della litografia di penna di polimero per produrre caratteristiche su scala nanometrica su aree di dimensioni centimetro, facilitate mediante l'uso di un algoritmo per l'allineamento rapido, accurato e automatizzato di matrici di sonda. Qui, nanolitografia di tioli su substrati d'oro dimostra la generazione di caratteristiche con elevata uniformità. Questi modelli sono quindi funzionalizzati con fibronectina per uso nel contesto di studi di morfologia di superficie-diretto delle cellule.

Introduction

Progressi nel campo delle nanotecnologie sono dipendenti lo sviluppo di tecniche in grado di fabbricare di efficiente e affidabile caratteristiche su nanoscala su superfici. 1 , 2 tuttavia, generando tale presenta ampie zone (più cm2) in modo affidabile e a costo relativamente basso è uno sforzo non banale. La maggior parte delle tecniche esistenti, derivate dall'industria dei semiconduttori, si basano su ablativa fotolitografia per fabbricare materiali 'hard'. Più recentemente, tecniche litografiche derivati dalla scansione microscopia a sonda (SPM) sono emerse come un approccio conveniente e versatile per la prototipazione rapida di disegni su scala nanometrica. 3 tecniche basate su SPM sono in grado di scrivere comodamente e rapidamente '' qualsiasi modello definito dall'utente. Il più ben noto di questi è la nanolitografia dip-pen (DPN), introdotta da Mirkin et al.,4 dove una sonda di scansione viene utilizzata come una 'penna' per trasferire un molecolare 'inchiostro' a superficie producendo caratteristiche in maniera analoga alla scrittura. Condizioni ambientali, come una sonda è scandita attraverso una superficie le molecole di 'inchiostro' vengono trasferite per la superficie tramite un menisco di acqua che si forma tra la sonda e la superficie (Figura 1). DPN permette così la deposizione di nanolitografiche di una vasta gamma di materiali, tra cui 'soft' materiali come i polimeri e biomolecole. 5 tecniche correlate utilizzando le sonde ingegnerizzati con canali per erogazione di fluidi, variamente denominati 'nanopipettes' e 'nano-stilografiche', inoltre sono stati segnalati. 6 , 7 , 8

Il principale ostacolo all'applicazione più ampia della litografia SPM-derivato è la velocità effettiva, come richiede un tempo eccessivamente lungo per aree di centimetro-scala del modello con una singola sonda. Primi sforzi per affrontare questo problema incentrato sulla parallelizzazione di DPN basati su a sbalzo, con 'one-dimensional' e 'bidimensionale' matrici (2D) sonda viene segnalate per la litografia aree di dimensioni centimetro. 5 , 9 tuttavia, queste matrici a sbalzo sono prodotti attraverso metodi di fabbricazione più fasi relativamente complesso e sono relativamente fragili. L'invenzione della litografia di polimero penna (PPL) affrontato questo problema sostituendo il cantilever SPM standard con una matrice 2D di silossano morbido elastomero sonde accoppiata a una lastra di vetro. 10 questa configurazione sonda semplice riduce significativamente i costi e la complessità di patterning grandi aree, aprendo la pagina di nanolitografia a una vasta gamma di applicazioni. Questa architettura a sbalzo-free è stata ampliata anche alla punta dura soft-primavera Litografia,11 che fornisce un ibrido di morbido appoggio elastomerico con punte di silicone dà risoluzione migliorata rispetto ai modelli prodotti utilizzando morbido consigli di elastomero.

Un fattore cruciale nell'esecuzione di queste tecnologie di matrice 2D è che la matrice della sonda deve essere esattamente parallela al substrato superficiale modo che quando si utilizza una Litografia, tutte le sonde vengono a contatto con la superficie simultaneamente. Anche un piccolo disallineamento può causare una grande differenza nella dimensione caratteristica da un lato della matrice a altra, poiché alcune sonde entrerà in contatto con la superficie precedentemente, durante la discesa della matrice, mentre gli altri entreranno in contatto più tardi o non a tutti. 12 l'allineamento esatto è particolarmente importante con PPL a causa della deformabilità delle sonde elastomero morbido, dove le sonde di contatto con la superficie in precedenza verranno compressi, lasciando un'impronta più grande sulla superficie.

I primi lavori su PPL impiegato controllo puramente visivo per guidare il processo di allineamento, usando una telecamera montata sopra la matrice per osservare la deformazione delle sonde piramidale come ce li hanno portati a contatto con la superficie. 10 allineamento è stata giudicata osservando quale lato delle sonde entra in contatto con la superficie in primo luogo, quindi regolare l'angolo e ripetere la procedura in modo iterativo fino a quando la differenza di contatto su ogni lato della sonda era indistinguibili ad occhio. Questa procedura di allineamento si basa sull'ispezione visiva soggettiva da parte dell'operatore, riproducibilità è basso.

Successivamente, è stato sviluppato un approccio più obiettivo, che consiste di un sensore di forza montato sotto il substrato per misurare la forza applicata al contatto delle sonde sulla superficie. 12 allineamento è stato realizzato così regolando gli angoli di inclinazione per massimizzare la forza esercitata, che ha indicato che tutte le sonde erano contemporaneamente in contatto. Questo metodo ha mostrato che l'allineamento all'interno di 0,004 ° del parallelo di superficie era possibile. Questo 'force feedback livellamento' ora è stato implementato nei sistemi completamente automatizzati in due relazioni indipendenti. 13 , 14 sia utilizzare una triade di sensori di forza montata sotto il substrato o sopra la matrice e misurare la quantità di forza esercitata al contatto tra la sonda matrici e superficie. Questi sistemi offrono alta precisione, segnalazione disallineamenti di ≤0.001 ° sopra una scala di lunghezza di 1 cm,14 o ≤ 0,0003 ° sopra 1,4 cm.13 questi sistemi automatizzati allineamento forniscono anche grandi risparmi in tempo all'operatore e tempo complessivo impiegato per completare il processo di litografia.

Un'applicazione importante di alto-rendimento superficiale fabbricazione abilitati per questa tecnologia è la generazione di substrati di coltura delle cellule. È ormai ben accertato quello fenotipo delle cellule può essere manipolato controllando l'interazione iniziale fra le cellule e le caratteristiche della superficie, e che questo può essere migliorato su nanoscala. 15 in particolare, metodi di scansione sonda Litografia hanno dimostrati di essere un facile metodo per produrre una varietà di superfici nanofabbricate per tali esperimenti della coltura cellulare. 16 ad esempio, superfici che presentano modelli su scala nanometrica di monostrati auto-assemblati e matrice extracellulare proteine basato su modelli di PPL e DPN sono stati usati per studiare il potenziale di materiali nano-modificato in materiale ha indotto la differenziazione di cellule staminali. 17

Questo protocollo descrive l'utilizzo di un sistema di microscopio (AFM) modificate forza atomica che consente grande area PPL. Dettagliamo il rilevamento della forza utilizzando più sensori di forza come il mezzo per determinare contatto sonda-superficie, insieme con un algoritmo che consente di automatizzare il processo di allineamento iterativo. Successiva funzionalizzazione di questi modelli con la fibronectina di proteine della matrice extracellulare e la cultura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono descritti, come una dimostrazione di PPL-fabbricato superfici applicate per la coltura cellulare.

Protocol

1. fabbricazione della matrice penna PPL

  1. Per preparare la miscela di copolimero polidimetilsilossano (PDMS):
    1. Aggiungere 10 µ l del platino (0) - 1,3 - divinil-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane soluzione complessa e µ l 172 del 1,3,5,7-tetrametil-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane-250 g di (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimetilsiloxano co-polimero. Mescolare questi componenti accuratamente su un agitatore per 7 giorni per garantire la miscelazione omogenea.
      Attenzione: platino (0) - 1,3 - divinil-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane è tossico. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
    2. Aggiungere 0,5 g di (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimetilsiloxano co-polimero ad una porzione di 1,7 g di miscela dal punto 1.1.1 una pesatura in barca e mescolare accuratamente con una spatola.
    3. Degassare questa miscela trasferirlo nell'essiccatore sottovuoto ed esponendo la miscela a bassa pressione (200 mTorr, 0,3 mBar) per 20 minuti fino a quando tutte le bolle di gas si sono dissipati.
  2. Luogo pieno di una lastra di vetro di 13 x 13 mm in un flaconcino di plastica vite-condita con 20 mL 2-propanolo, quindi collocare il flaconcino in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti rimuovere eventuali detriti di grandi dimensioni. Lavare i vetrini immergendo i vetrini in fresco 2-propanolo (100 mL) e asciugare sotto un flusso di gas azoto.
  3. Posto un silicio master18 in una capsula di Petri diametro 4cm e aggiungere sufficiente degassato miscela prepolimero PDMS (dal punto 1.1) fino al completamente coperto. In genere, 100 µ l è obbligatorio per un master di 20 x 20 mm. Inserire il master con la miscela del prepolimero in un essiccatore sotto vuoto. Degassare il polimero per ulteriori 5 minuti eliminare eventuali bolle di gas formate durante il trasferimento della miscela. Il trattamento al plasma di2 O le diapositive di vetro (passo 1.4 sotto) deve essere eseguito mentre il degassamento avviene.
  4. Trattare i quadrati di vetro con il plasma di O2 (600 mTorr) alla massima potenza RF per 1 min per rimuovere eventuali contaminazioni organiche e generare uno strato di ossido uniforme sul vetro per adesione dell'elastomero. 19 uso il plasma trattato diapositive immediatamente nel passaggio successivo.
  5. Con attenzione porre il vetrino quadrato in vetro (da passo 1.4) sopra il prepolimero sul master (dal punto 1.3) con il lato pulito del plasma rivolto verso il basso. Premere delicatamente il vetrino sul master silicio per eliminare l'aria intrappolata e garantire che una pellicola uniforme di PDMS è intramezzata fra il Maestro e lo scivolo.
  6. Posto la matrice PDMS intramezzata da sopra passo in una capsula di Petri con il silicio padroneggiare a fondo (cioè, con il dorso della diapositiva vetro rivolta verso l'alto) e mettere la teglia in forno a 70−80 ° C per 24−48 h curare termicamente il PDMS.
  7. Rimuovere la matrice curata dal forno e lasciare raffreddare per 15 minuti, poi con una lama di rasoio accuratamente rimuovere qualsiasi PDMS in eccesso dal retro e i lati del vetro diapositiva e utilizzano un flusso di azoto secco per soffiare via eventuali detriti presenti PDMS.
    Nota: fare attenzione a non zero il maestro di silicio con la lama di rasoio, poiché ciò potrebbe danneggiare il rivestimento antiaderente.
  8. Una lama di rasoio a Cuneo in un angolo della matrice a una profondità di 1 mm e cautamente la matrice eccetto il maestro. Eseguire questa operazione in una singola azione di sollevamento continua; non consentire le matrici a ripiegare sul master.
  9. Accuratamente tagliare e raschiare via 0,5 mm del PDMS ai bordi della matrice con una lama di rasoio. Utilizzare un flusso di azoto secco per soffiare via eventuali detriti presenti PDMS.
    Nota: Potrebbe essere più facile eseguire questo passaggio di rifilatura sotto stereoscopio o una lente di ingrandimento. Fare attenzione a non zero il maestro di silicio con la lama di rasoio, poiché ciò potrebbe danneggiare il rivestimento antiaderente.

2. preparazione e montaggio di substrato di matrice

  1. Generare una superficie idrofila sulla matrice sonda di trattamento al plasma di O2 :
    1. Inserire la matrice di penna PPL in una capsula di Petri in camera al plasma, quindi applicare il vuoto per 600 mTorr. Accendere il generatore di plasma (impostazione massima) per 30 s.
    2. Rilasciare il vuoto, rimuovere la matrice e controllare la sua idrofilia eliminando 20 µ l di acqua deionizzata sulla matrice e osservando se c'è anche diffusione dell'acqua su tutta la superficie. Se ciò non accade, è possibile sottoporre la matrice a un secondo ciclo di trattamento al plasma. Asciugare la matrice accuratamente con un flusso di gas di azoto secco.
  2. Utilizzando nastro biadesivo carbonio, fissare la matrice di metà il portasonda. Montare il supporto sonda sul supporto cinematico del AFM (Figura 2).
  3. Per caricare la matrice PPL con 16-mercaptohexadecanoic acido (MHA) ('input penna'):
    1. Preparare 1 mM 16-mercaptohexadecanoic acido (MHA) soluzione sciogliendo 8,6 mg in 30 mL di etanolo in un tubo e collocandolo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti sciogliere completamente il composto.
      Attenzione: l'acido 16-mercaptohexadecanoic è tossico. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
    2. Con una micropipetta, caduta di deposito 20 µ l della soluzione MHA per l'array. Evitare il contatto delle punte di pipetta con le matrici. Consentire che si diffuse in tutta la matrice, quindi consentire l'etanolo di evaporare in condizioni ambientali.
      Nota: La matrice PPL può essere inchiostrata in alternativa dopo l'allineamento ha avuto luogo. 10
  4. Una volta asciugata la soluzione MHA, montare il supporto sonda con la matrice di PPL l'AFM.

3. preparazione di substrati d'oro per PPL.

  1. Substrati d'oro possono essere acquistati, o fatti in casa da thermal o electron deposizione del fascio e sono costruiti con un strato di adesione in titanio nm 2 seguita da 20 nm d'oro su un wafer di silicio o vetro. 18
  2. Se necessario, pulire i substrati di trattamento al plasma di ossigeno utilizzando i parametri descritti al punto 1.4.
  3. Mettere il substrato oro al centro del palco di campione AFM e fissare con nastro adesivo attorno ai confini del substrato (Figura 2). Regolare la fase all'altezza corretta come indicato nelle istruzioni del produttore, utilizzando la z-controllo assi.

4. automatico allineamento dell'array di penna

  1. Aprire ed eseguire il controller di fase (SetupNSF.exe) del programma di installazione sul computer che possa reimpostare ('zero') tutti gli assi e gli angoli di un pre-tarati punto zero, quindi utilizzare la fase x/y-axis controller console per spostare il substrato per l'allineamento desiderato / posizione di stampa. Per risultati ottimali, il substrato deve essere posizionato vicino al centro del palcoscenico, tra sensori di forza dello stage.
    Nota: In alcuni modelli di computer, il x/y-segnale di asse controller USB può interferire con quello della z-controllo assi. In questo caso, scollegare il x/y-assi controller USB via cavo dopo questo passaggio. Dovrebbe quindi essere riconnesso dopo la procedura di allineamento (punto 4.7).
  2. Passare la leva di rilascio del palco per rilasciare la fase del campione e attivare la triade di sensori di forza, come indicato dalle istruzioni del produttore AFM. Consentire i sensori di forza equilibrare per almeno 15 min. Per risultati ottimali, permettono di 30-50 min.
  3. Aumentare l'altezza dell'asse z per portare la matrice in stretta vicinanza con il substrato osservando visivamente la matrice di sonda e la superficie.
    Nota: Il più vicino la matrice sia alla superficie, le poche iterazioni sono necessarie per il processo di allineamento, risparmiando così tempo.
  4. Apertura/esecuzione il programma di allineamento automatico (Auto allineamento v16.exe) e immettere i parametri pertinenti allineamento nel programma.
    1. Immettere il valore del parametro desiderato 'angolo passo', in genere 0,15 °. Questo parametro è l'angolo di offset dall'angolo 'ottimale' per ciascun asse che è determinato dal programma. Impostare questo parametro compreso tra 0,1 e 0,2 °, come gli angoli inferiori a questo intervallo non provocare una differenza di forza chiaramente rilevabile all'approccio delle sonde sulla superficie.
      Nota: Software accetta valori in millidegrees (cioè, 1 x 10-3 °). Ad esempio, per 0,15 °, gli utenti dovrebbero input '150.'
    2. Entrando il passo desiderato grossolana ' valore del parametro, in genere 0,6 µm. Questo parametro è utilizzata dalla fase che si avvicina le sonde nell'allineamento grezzo iniziale la dimensione del passo asse z. Impostare questo parametro tra 0,2 e 1 µm. Larger passo diminuzione dimensioni il tempo impiegato per il processo di allineamento, ma ridurre la precisione dell'allineamento e aumentare lo stato di usura delle sonde.
      Nota: Il Software accetta valori di grossolani passi in micrometri. Ad esempio, per 0,6 µm utenti dovrebbero input '0.6'.
    3. Immettere il valore di parametro di 'Fine passo' desiderato, in genere 0,2 µm. Questo parametro è utilizzata per la regolazione fine dell'allineamento ottima la dimensione del passo dell'asse z. Per la maggior parte delle applicazioni, impostare questo parametro tra 0,1 e 0,4 µm. valore passo dimensioni maggiori saranno diminuire la quantità di tempo impiegato per il processo di allineamento ma ridurre la qualità dell'allineamento.
      Nota: Il Software accetta valori di passi bene in micrometri. Ad esempio, per 0,2 µm, gli utenti dovrebbero input '0.2.'
    4. Configurare il 'percorso del file Excel' e allegare una copia non modificata del file del modello di foglio di calcolo fornito utilizzando l'icona 'cartella', navigando per il percorso del file e premendo 'OK'. Questo file contiene i dati non elaborati e calcolati che viene utilizzati per determinare gli angoli di inclinazione ottimale fase dello stage.
  5. Apertura/esecuzione il software di controllo AFM. Passare al componente di spettroscopia di questo programma facendo clic sul pulsante 'spettroscopia' (secondo le istruzioni del produttore) e impostare l'asse z testa di scansione AFM ad oscillare da 10 µm oltre 100 ms, con un tempo di pausa di 250 ms, quindi per ritirare 10 µm oltre 100 ms con un tempo di pausa di 250 ms (Figura 3).
  6. Come la testa AFM è oscillante, fare clic sul pulsante 'start' del software di allineamento per iniziare il processo di allineamento automatico. Quando il programma è in esecuzione, il software è di scrittura e lettura dei dati nel file descritto al punto 4.4.4.
    Nota: L'allineamento prende tra 30 minuti e 3 ore a seconda della posizione di fase iniziale impostata al punto 4.3 e configurazione del software che sono state immesse nel passaggio 4.4.
    Attenzione: Le console del controller di fase sono ancora attive durante il processo di allineamento - non utilizzarli durante il processo di allineamento come essa possa interferire con l'allineamento.
  7. Al termine l'allineamento, si accende la luce verde casella 'Allineamento completato' sul software di allineamento (dal punto 4.4). In questo caso, fare clic sul pulsante 'STOP' nell'interfaccia utente per terminare il processo di allineamento.
  8. Ispezionare i grafici nel file del modello di foglio di calcolo per una correlazione tra i dati registrati punti e la linea adatta che viene generato dal software. Vedere risultati rappresentativi per esempi di una buona correlazione con i valori tipici di2 R > 0,99. Se l'allineamento non riesce, sostituire la matrice di sonda con una matrice appena preparata (passaggio 2) e ripetere l'allineamento (punto 4.4).
  9. Spostare verso l'alto il palco nel z-asse utilizzando la console del controller di fase per quell'asse. La fase deve essere spostata in incrementi di 500 nm fino a contatto possa essere osservato dalla fotocamera vista dall'alto dell'AFM. Il contatto tra la matrice ed il substrato può essere osservato come un 'punto bianco' ad alto contrasto all'apice delle piramidi sonda individuali.
  10. A questo punto, fare clic sul pulsante 'stop' il software di controllo AFM per interrompere il programma di spettroscopia dal punto 4.5. Questo si ritrae la matrice di 10 µm, lasciando quindi 10 µm di estensione possibile dell'asse z. Controllare l'immagine dalla fotocamera vista dall'alto del AFM per garantire che le sonde non sono a contatto con il substrato.

5. Litografia di penna polimero (PPL)

  1. Passare il componente Litografia del software di controllo facendo clic sul pulsante 'Litografia' il software di controllo. Scegliere il z-modulazione modalità di funzionamento e importare un raster (bitmap) o immagine che verrà utilizzato come criterio di Litografia di vettore. Al fine di generare le caratteristiche indicate nei risultati rappresentativi, utilizzare una bitmap che consiste di 20 x 20 pixel neri (Vedi materiale supplementare), corrispondente alla litografia di una griglia di 20 x 20 punti per sonda sulla matrice PPL.
  2. Immettere i parametri di Litografia nella finestra 'Importazione grafica Pixel' del software controllore AFM.
    1. Configurare la 'dimensione' del modello deve essere generato, ad esempio, 40 µm in lunghezza e larghezza. Questi parametri indicano la larghezza e la lunghezza su cui verrà ridimensionata l'immagine nella bitmap. Per generare le funzionalità mostrate nei risultati rappresentativi, utilizzare una larghezza e una lunghezza di 40 µm in entrambe le dimensioni.
    2. Impostare l'origine del' ' del modello deve essere generato 25 µm sull'asse x e y . Questi parametri determinano il centro dell'immagine rispetto al centro del AFM x/y-assi. Impostare questi parametri per evitare la regione della superficie dove le sonde erano in contatto durante il processo di allineamento.
    3. Impostare la stampa 'Parametri'. Questi valori determinano come le sonde devono essere esteso (cioè portato a contatto con la superficie) in risposta a ciascun pixel nell'immagine bitmap.
      1. Selezionare dal menu a discesa 'Modulazione Abs Z Pos' e 'Semplificare a' due strati. Questa modalità indica l'AFM per estendere le sonde da una distanza assoluta determinata dal solo due risultati, campi di 'White (1)' o di 'Black (0)'.
      2. Impostare i valori nei campi 'White (1)' e 'Nero (0)' 5 e -5 µm, rispettivamente. Questi valori determinano la distanza le sonde devono essere spostate in risposta a un pixel bianco o nero sull'immagine bitmap e sono in genere impostati tra 3 e 5 µm per 'Black' (cioè, estendere sonde verso il basso a quella distanza rispetto al punto zero di tale asse) e -3 e-5 µm per 'White' (cioè, ritirare le sonde verso l'alto da 3 a 5 µm rispetto al punto zero).
        Nota: Queste distanze rappresentative si supponga che un'estensione di 5 µm provoca le sonde a contatto con la superficie e quindi la generazione di una funzione, mentre un prelievo di 5 µm solleva le sonde lontano dalla superficie con conseguente nessun contatto. Z-estensione influisce sulla dimensione caratteristica di determinare la portata del contatto delle sonde con il risultato di estensioni di superficie, maggiore nelle sonde pressione ulteriore nella superficie, con conseguente più grandi caratteristiche. 10
      3. Fare clic sul pulsante 'OK' per implementare queste impostazioni e chiudere la finestra.
  3. Nella finestra Litografia del software di controllo AFM, in genere 1 immettere la 'pausa' s. Questa impostazione determina la lunghezza di tempo che le sonde rimangono in posizione estesa 'Black', che viene in genere impostata tra 0,1 e 10 s.
    Nota: Tempi più lunghi di pausa causare dimensioni maggiori funzionalità a causa della maggiore quantità di MHA trasportato alla superficie dell'oro. Ulteriori dettagli su come controllare la dimensione delle caratteristiche generato possono essere trovati in altri rapporti. 20
  4. Preparare il recinto di controllo atmosferico.
    1. Abbassare la camera di isolamento atmosferico su AFM e apertura/esecuzione il software di controllo atmosferico fornito dal produttore (MHG_control.exe).
    2. Impostare il software di controllo atmosferico per mantenere un'umidità relativa del 45%, una temperatura di 25 ° C e un cambio di atmosfera 'Portata' di 500 mL inserendo questi valori nel software. Fare clic su 'Utilizza' per implementare le impostazioni. Il modulo di controllo atmosferico inizierà a pompare aria umidificata nella camera.
      Nota: I livelli di umidità elevati causare dimensioni maggiori funzionalità a causa della formazione di un menisco di acqua più grande generata tra superficie e matrici di penna. 21 questo valore è in genere impostato tra il 40 e il 60%. La portata è in genere impostata tra 300 e 500 mL. Più grandi flussi consentono il livello di umidità desiderata essere raggiunto più rapidamente, ma è meno accurati. I risultati rappresentativi utilizzare una portata di 500 mL per generazione iniziale di umidità ed è diminuito a 300 mL dopo aver raggiunto l'umidità desiderata, per mantenere un livello preciso e stabile durante la litografia.
  5. Una volta ottenuta l'umidità desiderata, è possibile avviare la sequenza di litografica premendo il tasto 'start' sul software di interfaccia.
  6. Al completamento della litografia, è possibile utilizzare la console di controller di fase asse z per spostare il substrato dalla matrice ritraendo la fase di 500 µm. Quindi rimuovere la camera di isolamento atmosferico dal suo supporto.
  7. Passa la leva di rilascio del palco per bloccare la fase del campione e disattivare i sensori di forza, come indicato dalle istruzioni del produttore AFM, quindi rimuovere il substrato dal palco.

6. visualizzazione pattern

  1. Modelli possono essere visualizzati utilizzando uno dei seguenti metodi, forza acquaforte di microscopia o chimico di sonda di scansione laterale.
  2. Scansione la superficie modellata su AFM con modalità di forza laterale utilizzando a sbalzo modalità di contatto per esaminare le caratteristiche in modo non distruttivo.
    Nota: Microscopia a forza laterale può essere utilizzata come un metodo non distruttivo per visualizzare le caratteristiche prodotte da Litografia di penna del polimero; Tuttavia, utilizzando questo metodo, solo una zona relativamente piccola può essere visualizzato in quel momento (in genere 100 x 100 µm).
  3. Poiché la MHA depositato possa agire come una resistenza di etch, incisione chimica può essere utilizzato per rimuovere l'oro dalle zone non-fantasia. Le aree metallografici risultante possono essere visualizzate mediante microscopia ottica, significato che una vasta area possa essere visualizzata in una sola volta. 18
    Nota: Substrati che sono impressi in questo modo quindi non possono essere utilizzati per gli esperimenti di coltura successiva delle cellule descritti di seguito.
    1. Separatamente, preparare soluzioni acquose di 40mm tiourea, nitrato di ferro (III) di 27 mM e 100 mM acido cloridrico. Preparare il mordenzante con 5 mL di ciascuna di queste tre soluzioni. Mescolare appena prima di ogni utilizzo. 22
      Attenzione: tiourea, nitrato di ferro (III) e acido cloridrico sono tossici. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
    2. Trasferire il substrato modellato in una capsula di Petri e pipetta sufficiente soluzione mordenzante nel piatto per coprire la superficie del substrato (in genere 10 mL). Mantenere il substrato sommerso per 4-5 min a etch 15 nm di oro (ad un tasso approssimativo di 3 nm/min).
    3. Al termine dell'acquaforte, rimuovere il substrato e sciacquare abbondantemente con acqua e asciugare con un flusso di azoto.
      Nota: Il completamento del processo di incisione è determinato dallo spessore della oro-superficie ottenuta (punto 3.1) associate alla tariffa di acquaforte specificata (punto 6.2.2).
    4. Ispezionare le caratteristiche oro incise sotto microscopia ottica del campo luminoso. Le restanti caratteristiche oro che rimangono dovrebbero apparire corrispondente al modello che è stato stampato (dal punto 5.2). Se tutta la superficie appare omogenea, questo indica che rimane di una notevole quantità di oro e il passaggio di acquaforte (passaggio seguente 6.2.2) deve essere ripetuto per 1-2 min.

7. modello funzionalizzazione con fibronectina

  1. Immergere i substrati in una soluzione di 1 mM (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) soluzione in etanolo per 1 h. lavare il substrato tre volte con etanolo ed asciugare sotto un flusso di azoto. Questo passaggio passiva le aree non nanostrutturate oro.
    Attenzione: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) è tossico. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
  2. Immergere i substrati in una soluzione acquosa di Co (NO3)2 per 5 min da 10 mM. Successivamente, rimuovere i substrati dalla soluzione, lavare tre volte con acqua ultrapura e asciutta sotto un flusso di azoto secco.
    Attenzione: Co (NO3)2 è tossico. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
  3. Immergere il substrato in una soluzione di 50 µ g/mL di fibronectina in tampone fosfato salino (PBS) e incubare a 4 ° C per 16 h. substrato di lavare tre volte con PBS, quindi asciugare il substrato sotto un flusso di azoto secco.
    Nota: Fibronectina è associata alle zone MHA-funzionalizzate attraverso la chelazione di Co(II) dai gruppi terminale carbossilico MHA. Fibronectina associa quindi a Co(II) tramite il dominio di legame al collagene. 23
  4. Se lo si desidera, è possibile visualizzare la fibronectina associato a superficie mediante l'etichettatura con anticorpi fluorescenti:
    1. Applicare una soluzione di 2 mL di anticorpo primario anti-fibronectina di coniglio non coniugata di 1: 100 in 5% (p/v) di albumina di siero bovino (BSA) in PBS sulla superficie e incubare a 4 ° C per 16 h. aspirare il surnatante e lavare tre volte con PBS.
    2. Immergere il substrato in 2 mL di soluzione di anticorpo secondario coniugato fluorescente anti-coniglio (a diluizione specificato dal costruttore, 2 gocce/mL) nel 5% (p/v) di BSA in PBS, copertina in carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 1 h. aspirato il surnatante e lavare tre volte con PBS.
    3. Registrare le immagini di microscopia epifluorescenza delle funzionalità utilizzando un microscopio a fluorescenza secondo le istruzioni del produttore, con un filtro di eccitazione impostata su 594 nm.

8. cella cultura su superfici nanofabbricate

  1. Preparare una sospensione di hMSCs ben caratterizzati sono compresi tra i 4th e 6th passaggio. 24
    1. Sospendere un pallone confluente di cellule di risciacquo una volta con 10 mL di PBS, dissociare le cellule aderite aggiungendo 5 mL di tripsina/EDTA nel pallone di coltura del tessuto T75 e incubare la beuta in una camera umidificata a 37 ° C, completati con 5% CO2 per fino a 5 min fino al 90% o cellule f si staccano dalla superficie.
    2. Successivamente, aggiungere 6 mL di terreni di coltura fresco contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS) nel pallone e sciacquare brevemente la beuta con il supporto aggiunto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 400 g a 25 ° C per 5 min.
    3. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura fresco.
    4. Contare la densità delle cellule usando un emocitometro25 e regolare la densità della sospensione delle cellule a 2 x 104 cellule/mL con l'aggiunta di un volume adeguato di terreni di coltura.
  2. Seme le cellule su substrati ad una densità di 104 cellule/cm2.
    1. Tagliate il substrato 1 x 1 cm2 con scriba di diamante e posizionarlo in un pozzo nella piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti.
    2. Pipettare 2 mL di sospensione cellulare in terreni di coltura (dal punto 8.1.4) nel pozzetto e incubare in una camera umidificata a 37 ° C, completati con 5% CO2 per 24 h.
  3. Dopo la crescita delle cellule sui modelli, analizzare il grado di adesione delle cellule e la diffusione di immunofluorescenza:
    1. Rimuovere i supporti e lavare substrati una volta con PBS. Fissare le cellule con 2 mL di una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS (pre-riscaldato a 37 ° C) per 20 min in cappa e lavare tre volte con PBS.
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Si prega di leggere prima di lavorare con questa soluzione DMS. Dispositivi di sicurezza devono essere indossati durante la manipolazione del prodotto chimico.
    2. Permeabilize le cellule con 2 mL di una soluzione detergente 0,5% (Vedi Tabella materiali) in PBS per 15 minuti, quindi lavare tre volte con PBS.
    3. Immergere il substrato in 2 mL di una soluzione dell'anticorpo primario anti-fibronectina di coniglio non coniugata alla diluizione di 1: 100 con 5% (p/v) BSA in PBS e incubare a 4 ° C per 16 h, quindi lavare tre volte con 0.1% (v/v) Tween 20 in PBS (PBST).
    4. Successivamente immergere il substrato in 2 mL di una soluzione di coniugato fluorescente anticorpo secondario anti-coniglio (diluito con 5% (p/v) BSA in PBS del produttore specificato il fattore di diluizione, 2 gocce/mL), copertina in carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 1 h, poi lavare tre volte con 0,1% PBST.
    5. Per etichettare i filamenti dell'actina, immergere 2 mL di falloidina fluorescente coniugato ad una diluizione di 1: 250 in PBS, copertina in carta stagnola e incubare a 4 ° C per 30 minuti poi lavare tre volte con PBS.
    6. Contemporaneamente macchia nuclei cellulari e montare il substrato applicando una goccia di montaggio medio contenente DAPI e coprire con un vetrino coprioggetti.
  4. Visualizzare le celle utilizzando un microscopio a fluorescenza secondo le istruzioni del produttore, con filtri di eccitazione di 365 nm per nuclei (DAPI), 488 nm per F-actina e 594 nm per fibronectina.

Representative Results

Per verificare se l'allineamento automatico aveva avuto successo, sono stati esaminati i grafici tracciati dai dati di allineamento (nel foglio di calcolo dal punto 4.8). Dove il processo di allineamento aveva avuto successo le due trame, corrispondente all'angolo da cui la fase del campione è stata inclinata lungo gli assi θ, φ ha mostrato una serie di crescente e decrescente i punti dati. In ciascuna delle trame, PF lineare dei punti dati hanno mostrato un intersect ben definito "picco" che indica il massimo z-estensione e l'angolo corrispondente in cui l'allineamento è stato raggiunto (Figura 4A e 4B). Questo processo è ripetuto quattro volte (vale a dire, due volte per ogni asse) e tracciate come un insieme di quattro coordinate. L'intersezione di ogni coppia di coordinate Mostra così gli angoli nel complesso ottimali (Figura 4). 13 in casi dove l'allineamento non è riuscita, si può osservare che loro corrispondente θ e φ angolo appezzamenti non dare buona qualità lineare adatta, oppure non si intersecano (Figura 5). Tali allineamenti non riusciti sono in genere come risultato le matrici viene impropriamente tagliato o montato al titolare della sonda (passaggi 1.7, 1.8 e 2.2). In questi casi, le matrici sono state scartate e uno nuovo preparato e montato (passaggi 1 e 2) e ripetuta il processo di allineamento (passaggio 4).

Al successo allineamento e litografia con MHA di PPL, substrati d'oro poi erano imaged utilizzando la microscopia a forza laterale di esaminare se la deposizione aveva avvenuto. Un esame più grande zona delle superfici stampate è stata condotta anche mediante microscopia ottica dei substrati dopo l'incisione dell'oro non protetto da depositato del tiolo (Figura 6 e Figura 7). Tuttavia, i modelli incisi non possono essere utilizzati per ulteriore funzionalizzazione e devono essere utilizzati solo per confermare la campitura su campioni rappresentativi di un batch di substrati superficie stampate. Se i modelli incisi Visualizza aree vuote corrispondenti ai recinti individuali (Figura 8), questo risultato indica che la produzione di matrici di sonda non è stato fatto con successo, e che alcune sonde sono danneggiati o mancanti. Questa disomogeneità delle sonde può essere dovuto l'uso di un vecchio maestro dove il rivestimento perfluorurati ha usurato (punto 1.3), con conseguente alcune sonde essere strappati via quando la matrice è separata dal master. In questi casi, deve essere utilizzato un nuovo master. Il risultato può anche essere dovuto alla presenza di aria bolle intrappolate tra il vetro di supporto e il master (punto 1.5), o se la matrice di sonda non era correttamente separata dal maestro dopo l'indurimento (passo 1,8).

Immagini di microscopia fluorescente delle superfici funzionalizzata fibronectina incubate hMSCs erano anche raccolti (Figura 9). In generale, tutti i substrati erano stabili all'interno dell'ambiente di coltura in vitro e le cellule hanno aderito e adattato la loro morfologia per i modelli stampati in caso di più piccolo isolato 20x20 serie di caratteristiche.

Figure 1
Figura 1. Rappresentazione schematica della litografia di penna di polimero risultati molecolari inchiostro trasporto tramite un menisco di acqua sulla punta della sonda. (A) vista laterale e (B) superiore vista della matrice polimerica penna indicano che quando la matrice di sonda ed il substrato superficiale sono completamente allineati, tutte le sonde entrano in contatto con la superficie simultaneamente, con conseguente parallelizzata Litografia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Diagramma schematico della litografia di polimero penna set up (A) vista laterale espanso di impostazione sperimentale dove la matrice preparato sonda è collegata alla titolare della sonda e montata a scanner AFM. Il substrato è posizionato sul palco, sotto cui si trovano i tre sensori di forza. (B) una rappresentazione della strumentazione assemblato, mostrando la testa di scansione AFM rispetto allo stage di campione. Vista (C) inferiore mostra l'ubicazione del sensore di forza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Rappresentazione schematica raffigurante il programma di spettroscopia per la procedura di allineamento. Lo scanner AFM è impostato per spostare le sonde verso campione da una distanza di 10 µm entro 100 ms, tenuta in posizione per 250 ms, seguita da una ritrattazione di 10 µm entro 100 ms e poi tenuto per 250 ms in posizione retratta. Il movimento viene quindi ripetuto durante tutto il processo di allineamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Grafici che illustrano un allineamento successo. Grafici di posizione z contro gli angoli di inclinazione (A) θ e φ (B) per un allineamento di successo, dove ● indica i valori effettivi misurati e + indica la migliore vestibilità con il metodo dei minimi quadrati. (C) il grafico di φ contro θ montato gli angoli con i quattro punti dove è stata raggiunta la massima posizione z. Il punto di intersezione contrassegnato è l'angolo di inclinazione ottimale finale attraverso entrambi gli assi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Grafici che illustrano un allineamento infruttuoso. Grafici di posizione z contro gli angoli di inclinazione (A) θ e φ (B) per un allineamento infruttuoso, dove ● indica i valori effettivi misurati e + indica la migliore vestibilità con il metodo dei minimi quadrati. (C) il grafico di φ contro θ montato gli angoli con i quattro punti dove è stata raggiunta la massima posizione z. Nessun chiaro optima o punto di intersezione sono stati osservati e pertanto non vengono risolti gli angoli di allineamento ottimale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Microscopia ottica illustrativa e immagini di microscopia di forza atomica di substrati d'oro che erano modellate con MHA di matrici PPL allineate e poi inciso. (A) e (B) sono immagini di microscopia ottica in sequenza ingrandita di modelli incisi; (C) è un'immagine di topografia AFM di una singola griglia di pattern. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Immagini di microscopia ottica illustrativi di substrati d'oro che erano modellate con MHA di matrici PPL allineate e poi inciso. (A) e (B) sono immagini di microscopia ottica in sequenza ingrandita di modelli incisi e (C) è un'immagine di ingrandimento inferiore che mostra grande area modelli omogenei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Immagine di microscopia ottica illustrativo di un substrato di oro che è stato modellato in modo non uniforme con MHA e poi inciso. I modelli previsti (mostrati nella rientranza) erano ripetere griglie di 20 righe di punti disposti in 20 linee, con ogni due linee prodotti aumentando la z-estensione di asse di 1 µm (che vanno da 5 a-5 µm). Può essere visto che in alcune zone non vengono generati modelli, a causa di mancante sonde in quei luoghi. Nelle aree dove vengono prodotti solo due linee di punti, questo risultato indica che una sonda è presente ma non è della stessa altezza come le sonde pienamente funzionante, così unico deposito dispone quando la matrice viene esteso per il completo z-distanza asse. In questa immagine, il contrasto è stato volontariamente modificato per consentire l'osservazione delle zone parzialmente stampate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Nella figura 9. Immagini di microscopia epifluorescenza delle hMSCs coltivate su matrici fibronectina basato su modelli di PPL. (A) e (B) sono ad alto ingrandimento immagini visualizzando singole celle. (C) Mostra un modello di esempio della fibronectina matrice senza un aderente delle cellule e (D) è un'immagine di campo largo delle cellule coltivate in una disposizione di griglia (un disegno schematico del modello stampato appare anche nell'intarsio). Le cellule sono macchiate per mostrare la fibronectina (rosso), F-actina (verde) e delle cellule di nuclei (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo serve per fornire agli utenti una metodologia conveniente effettuare rapidamente nanolitografiche patterning con elevata uniformità e dimensione caratteristica controllabile sopra grandi aree (cm2). Substrati cuscinetto questi nanopatterns di ampia area possono poi essere ulteriormente elaborati per una varietà di applicazioni. Una importante applicazione di questa tecnologia è la generazione di superfici nanofabbricate per studi di interazione della cellula-superficie. Questo rapporto mostra alcuni esempi illustrativi di coltura cellulare su questi materiali, dimostrando la controllo della morfologia hMSC nanofabbricate substrati.

Il fattore chiave di questo protocollo è l'automazione della procedura di allineamento (passaggio 4) che permette la produzione altamente uniforme e di alto-rendimento delle caratteristiche su superfici, fino a risoluzione nanometrica, che consente la rapida rotazione di esperimenti della coltura cellulare. La litografia di penna di polimero effettuata utilizzando questo algoritmo di allineamento è in grado di generare caratteristiche su nanoscala entro circa 30 min. La riproducibilità e la precisione di allineamento automatico e quindi l'uniformità delle feature, è tuttavia criticamente dipendente sulla qualità delle matrici sonda che vengono prodotte (fase 1 e 2). Eventuali difetti nella loro preparazione che si traducono in sonde smussate, rotte o mancante; come aria intrappolata bolle (passo 1.5) o impropria separazione delle sonde dal master (passo 1,8) può provocare allineamento impreciso e Litografia di scarsa qualità.

Questo segnalato metodo condivide una limitazione in comune con altri metodi di allineamento che si basano sul feedback di forza. La determinazione accurata di quando le sonde sono a contatto con la superficie è vincolata dalla necessità di contabilizzare le vibrazioni di fondo causate dall'ambiente circostante e il movimento della fase del campione. In generale, i sensori hanno una sensibilità di forza in regime di µN (2 µN in questo caso), ma l'algoritmo di allineamento è progettato per registrare solo una forza di almeno 490 µN come definitivo contatto tra le sonde e la superficie, al fine di evitare qualsiasi resul 'falsi positivi' Ting, rumore di fondo. 13 in tal senso, questo metodo tende a produrre grandi caratteristiche (1-2 µm) poiché le sonde devono esteso a grande distanza sul z-asse (con una conseguente maggiore forza) al fine di registrare contatto. Al fine di compensare, caratteristiche minori possono essere generati riducendo l' z-asse distanza percorsa durante il passaggio di Litografia (ad es., entrando l'impostazione 'Nero' al punto 5.2.3.2 come µm 3 invece di 5 µm).

Tuttavia, anche con questa limitazione, l'algoritmo di automazione è in grado di affrontare un aspetto critico nell'applicazione parallelizzata metodi di scansione sonda Litografia, come allineamento era precedentemente più esigenti e imprecisa passo temporale nella implementazione di queste tecniche. Questa automazione ora sposta la tappa limitante del processo di fabbricazione dall'allineamento verso la scrittura litografica stessa. Mentre questo protocollo dimostra l'applicazione di questa procedura di allineamento per PPL, il quadro potrebbe essere applicato a una serie di tecniche SPL come lipido-DPN26 e tabella-aiutato Litografia27 , nonché futuro potenziale catalitico sistemi di sonde. 28

Disclosures

L'algoritmo di allineamento e il software sono stati sviluppati da e sono di proprietà di, l'Università di Manchester. È disponibile per il download su http://www.click2go.umip.com/.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono sostegno finanziario da una varietà di fonti, tra cui l'ingegneria UK e Physical Sciences Research Council (concedere refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) e una borsa di studio laureato per JH; il Leverhulme Trust (RPG-2014-292); il fondo di sostegno istituzionale strategica del Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); il British Council (216196834); e anche l'Università di Manchester per un'Università di Manchester Research Institute (fondo di adescamento pompa UMRI) e una borsa di dottorato presidenziale per assistenza SW. tecnica di Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) si ringraziano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G

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Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule
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Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).More

Lee, I. N., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).

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