Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En metode til målrettede 16S sekvensering af modermælk prøver

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

En semi-automatiseret arbejdsproces præsenteres for målrettede sekventering af 16S rRNA fra modermælk og andre lav-biomasse prøve typer.

Abstract

Undersøgelser af mikrobielle samfund er blevet udbredt med udviklingen af relativt billig, hurtig og høj overførselshastighed sekvensering. Men som med alle disse teknologier, reproducerbare resultater afhænger en laboratorium arbejdsproces, der omfatter passende forholdsregler og kontrol. Dette er især vigtigt med lav-biomasse prøver, hvor forurener bakteriel DNA kan genererer vildledende resultater. I denne artikel beskrives en semi-automatiseret arbejdsproces til at identificere mikrober fra menneskelige bryst mælkeprøver ved hjælp af målrettede sekventering af 16S ribosomale RNA (rRNA) V4 region på en lav og midten af throughput skala. Protokollen beskriver prøveforberedelse fra sødmælk herunder: prøve lysis, nukleinsyre udvinding, forstærkning af regionen V4 af 16S rRNA gen, og biblioteket forberedelse med foranstaltninger til kvalitetskontrol. Vigtigere, protokol og diskussion overveje spørgsmål, der er iøjnefaldende udarbejdelse og analyse af lav-biomasse prøver herunder passende positive og negative kontroller, PCR hæmmer fjernelse, prøve forurening af miljøet, reagens, eller eksperimentelle kilder, og eksperimenterende bedste praksis skal sikre reproducerbarhed. Mens protokollen som beskrevet er specifikt for humant mælkeprøver, er det kan tilpasses til mange lav - og høj-biomasse prøve typer, herunder prøver, der opsamlet på podninger, frosne pæn eller stabiliseret i en buffer, konservering.

Introduction

De mikrobielle samfund, at kolonisere mennesker menes at være afgørende betydning for menneskers sundhed og sygdom påvirker stofskiftet, immun udvikling, modtagelighed over for sygdom, og svar til vaccination og stofmisbrug behandling1, 2. bestræbelser på at forstå mikrobiota indflydelse på menneskers sundhed i øjeblikket understrege identifikation af mikrober tilknyttet defineret anatomisk rum (dvs., hud, gut, oral, etc.), samt lokaliserede sites inden for disse rum3,4. Understøttelse af disse efterforskningsmæssige indsats er den hurtige fremkomst og øget tilgængelighed af næste generation sequencing (NGS) teknologier, der giver et massivt parallel platform til analyse af de mikrobielle genetiske indhold (microbiome) af en stikprøve. For mange fysiologiske prøver, den tilknyttede microbiome er både komplekse og rigelige (dvs., fæces), men for nogle prøver, microbiome er repræsenteret ved lav mikrobielle biomasse (dvs., modermælk, nedre luftveje) hvor følsomhed, eksperimentelle artefakter og eventuel forurening bliver store spørgsmål. De fælles udfordringer microbiome undersøgelser og relevante eksperimentelle design har været genstand for flere review artikler5,6,7,8.

Præsenteres heri er en robust NGS eksperimentelle pipeline baseret på målrettede sekventering af rRNA 16S V4 region9 at karakterisere microbiome af modermælk. Microbiome analyse af modermælk er kompliceret, ikke kun ved en ifølge sagens natur lav mikrobielle biomasse10, men derudover ved høj niveauer af menneskelig DNA baggrund11,12,13,14 , og potentielle fremførsel af PCR-hæmmere15,16 i uddraget nukleinsyre. Denne protokol er afhængig af kommercielt tilgængelige udvinding kits og semi-automatiske platforme, der kan hjælpe med at minimere variation på tværs af prøven forberedelse partier. Sig indlemmer en veldefineret bakteriel mock Fællesskabets, behandles sideløbende med prøver som en kvalitetskontrol til at validere hvert trin i protokollen og give en uafhængig måling af rørledningen robusthed. Selv om protokollen som beskrevet er specifikke for de menneskelige mælkeprøver, det er let at tilpasse til andre prøve typer herunder taburet, rektal, vaginal, hud, areolar, og mundtlige svaberprøver10,17, og kan tjene som udgangspunkt for forskere, der ønsker at udføre microbiome analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trin, protokol, passende personlige værnemidler (PPE) skal bæres, og strenge forurening forebyggelse tilgange skal tages. Observere strøm af arbejde fra før forstærkning arbejdsområder til efter forstærkning arbejdsområder for at minimere forurening af prøver. Alle leverancer bruges er sterile, fri for RNase, DNase, DNA og pyrogen. Alle pipette tips er filtreret. Et rutediagram i protokollen trin er fastsat (figur 1).

1. sample Lysis

Bemærk: Prøve lysis og nukleinsyre udvinding er udført ved hjælp af en DNA/RNA udvinding kit i et rent værelse miljø hvor både tekniske og proceduremæssige kontrol er på plads for at minimere indførelsen af miljømæssige bakterier til prøverne.

  1. Arbejde område forberedelse
    1. Ren arbejde biosikkerhed kabinet (BSC) område med passende overflade renere at fjerne kontaminering nukleinsyre.
    2. Tænd den temperatur-kontrolleret vortexer, og Indstil det til 37 ° C.
  2. Forberede guanidinium kaliumthiocyanat lysisbuffer (se tabel af materialer)
    1. Kontrollere lysisbuffer for bundfald. Re opløses bundfald af opvarmning ved 37 ° C.
    2. Forberede 600 µL af lysisbuffer med 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) for hver prøve. Overvej en ekstra 20% volumen pr. prøve.
  3. Forberedelse af prøver
    1. Hvis sødmælk er frosset, tø det op på isen. Alikvot 5 mL af hele mælk i en 15 mL eller et 5 mL sterilt rør i BSC og holde det på is.
    2. Spin 5 mL mælk alikvot i 10 min på 5.000 x g ved 4 ° C at sammenpresse cellerne.
    3. Fjern det fedtlag, nu det øverste lag i rør, med en plastik spatel eller store bore pipette tip.
    4. Uden at forstyrre pelleten, fjerne alle supernatanten bortset fra 100 µL.
    5. Afvaske pelleten ved resuspending i 1 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    6. Forberede 1 negativ kontrol ved tilsætning af 1 mL steril PBS til en 5-mL tube.
    7. Overføre suspension til en ren 1,5 mL centrifugeglas, og spin i en microcentrifuge for 1 min (5.000 x g ved stuetemperatur (RT)).
    8. Brug en 1.000 µL sterilt filtrerede pipette tip til at kassere hele supernatanten/fede lag.
    9. Hvis ikke uddrager den samme dag, snap fryse cellen pellet ved at sætte det i en ethanol/tør is gylle, og straks overføre det til-80 ° C fryser.
  4. Prøven forstyrrelser og homogenisering (perle-slå)
    1. Tilføje 600 µL af lysisbuffer indeholdende β-ME til pellet, og overføre suspension til en perle tube.
    2. Hver udvinding batch af 12 indeholder 10 prøver, 1 negative kontrol (udarbejdet i trin 3.7 ovenfor) og 1 positiv kontrol (udarbejdet i det næste trin).
      1. Forberede 1 positiv kontrol med lysisbuffer og 20 µL af bakteriel mock prøven (mock Fællesskabets brugt har en koncentration, engang udvundet af cirka 0,2 ng/µL DNA).
    3. Vortex alle perle rør kraftigt i 15 s.
    4. Varme prøver på den temperatur-kontrolleret vortexer ved 37 ° C i 10 min, med rysten på 700-800 rpm.
    5. Indlæse rør i automatiserede prøve disruptor adapter sæt.
    6. Perle slå for 1 min på 30 Hz.
    7. Skil adapter sæt og manuelt skifte adapter sæt med prøve pladerne fra venstre robotarmen til lige robotarmen af instrumentet.
    8. Perle beat i en anden 1 min på 30 Hz.
    9. Centrifugeglas på 17,200 x g i 3 min. ved 25 ° C.
    10. Fjerne alle supernatanten med 200 µL pipette, være omhyggelig med ikke at få nogen af de fede lag på toppen af prøven eller perle resterende nederst i prøven, og gælder for en homogeniseringsapparat kolonne.
    11. Centrifuge homogeniseringsapparat kolonner ved maksimal hastighed, 17,200 x g i 3 min. ved 25 ° C.
    12. Overføre 350 µL af eluatet til en 2-mL producentens microcentrifuge rør til brug med den automatiserede instrument til oprensning af DNA og RNA (ikke brug nogen andre tube). Vær omhyggelig med ikke at overføre eventuelle resterende fede lag.
    13. Hvis gennemstrømnings-diskenheden er mindre end 350 µL, tilføjes en endelige mængden af 350 µL lysisbuffer med β-ME.
    14. Forlade prøverne på RT for op til 2 timer før man går videre til nukleinsyre isolation ved hjælp af automatiserede DNA oprensning instrument, eller fryse ved-80 ° C.
  5. Rengøring arbejdsområde
    1. Ren alle overflader i brug med en ikke-enzymatiske dekontaminering løsning, forlader i 10 min, så spray med 70% ethanol og tørre ned i overfladen.

2. Isoler DNA/RNA

  1. Arbejde område forberedelse
    1. Tænd for varmen blok og Indstil temperaturen til 70 ° C.
    2. Tænd den temperatur-kontrolleret vortexer og Indstil temperaturen til 37 ° C.
    3. Varm op eluering buffer (EB) indeholdende 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, i en 50 mL tube til 70 ° C.
    4. Varm op 350 µL af frosne prøve lysates i 2 mL rør ved 37 ° C indtil helt optøet uden nogen bundfald (ca 10 min).
  2. DNA oprensning
    1. Vortex og centrifugeres 2-mL-rør med prøve kort (3000 x g i 10 s).
    2. Indsæt 2 mL rør i shaker efter automatiseret DNA/RNA oprensning instrumentets ladning diagram, pr fabrikantens anvisninger.
    3. Få rotoren adaptere og sæt dem på den bakke, baseret på antallet af prøver.
    4. Label hver rotor adapter baseret på den prøve identifikation (ID).
    5. Cut off låg og udjævne kanter af enkelte spin kolonner for DNA og RNA.
    6. Indsætte kolonnen DNA spin uden samling røret ind i rotoren adapteren. Kassér collection tube.
    7. Etiket 1,5 mL indsamling rør, og Indsæt i rotoren adaptere.
    8. Sæt rotor adaptere i centrifugen efter automatiseret DNA/RNA oprensning instrumentets ladning diagram.
    9. Indsæt producentens 1.000 µL filter-tips i tip stativer.
    10. Tilføje RNase-fri vand til en 2-mL producentens microcentrifuge tube baseret på antallet af prøver (pr. specifikke maskininstruktioner protokol).
    11. Indsæt røret ind i microcentrifuge tube slots tube slot, "A".
    12. Kassere et reagens, der er tilovers i reagensflaskerne og fyld med et mindsterumfang på 10 mL.
    13. Indsæt reagensflaskerne i reagens flaske rack (undtagen EB flaske).
    14. Tilføje varm EB fra en 50 mL tube til reagens flaske position 6.
    15. Check 1,5 mL rør er placeret tæt på rotoren adaptere.
    16. Luk instrumentets låg og vælg: "RNA" → "udvinding kit" → "Dyr, væv og celler" → "kit's navn 350 µL del A Custom DNA" → Rediger eluering volumen til 100 µL (standard) eller 50 µL for lav biomasse prøver → "Start."
    17. Når du er færdig, Fjern rotor adaptere ud af centrifugen og placere dem i bakken.
    18. Kassér kolonnen DNA spin fra rotoren adapter position 3.
    19. Smid ikke rotoren adaptere, RNA er i position 2.
    20. Fjerne 1,5 mL indsamling rør indeholdende elueret DNA på position 3, og gemme i −20 ° C.
    21. Indsamle prøve-holdige rør fra shaker og butik i −20 ° C, hvis enhver proeve er tilovers, ellers udsmid.
    22. Fortsæt med "kit's navn 350 µL del B RNA" for yderligere oprensning af RNA-protokollen.
    23. RNA Oprensning sker fra de cirka 350 µL gennemstrømnings-dvs i den midterste position af rotoren adaptere.
  3. RNA oprensning
    1. Indsætte kolonnen RNA spin uden sin indsamling rør og låg ind i rotoren adapteren.
    2. Mærke nye 1,5 mL indsamling rør og indsætte dem i rotoren adapter som angivet i manualen.
    3. Sæt rotor adaptere i centrifugen efter automatiseret DNA/RNA oprensning instrumentets ladning diagram.
    4. Luk instrumentets låg og vælg: "RNA" → "Producentens Kit" → "Dyr, væv og celler" → "Standard del B RNA" → "Start."
    5. Når afsluttet, fjerne rotor adaptere ud af centrifugen og placere dem i bakken.
    6. Kassér RNA spin kolonne fra position 3.
    7. Fjerne 1,5 mL indsamling rør indeholdende 30 µL elueret RNA på position 3, og opbevares ved −80 ° C.
    8. Fjerne reagensflaskerne.
    9. Bortskaffe rotor adapter indhold gennem passende farligt affald kanaler.
  4. Rent arbejde station
    1. Spray alle automatiserede DNA/RNA oprensning instrumentets tilbehør, såsom reagens stativer, bakke, og alle andre overflader i brug med en ikke-enzymatiske dekontaminering løsning, lad i 10 min. og skyl med deioniseret vand (DI) vand, så lad dem tørre.
    2. Spray den automatiserede instrument med kun fabrikanten godkendte ikke-enzymatiske dekontaminering løsning, tørre indersiden af centrifuge sammen med alle overflader i brug, forlader i 10 min og derefter tørre med 70% ethanol. Brug ikke andre typer af dekontaminering løsninger, da de kan beskadige apparatet.

3. målrettet 16S PCR Set-up

Bemærk: Set-up for 16S PCR er foretaget i en udpeget før forstærkning arbejdsområde ligger inden for den rene værelse. Reagenser og prøver er forberedt og derefter læsset på en flydende handleren til at udføre PCR for hver prøve i tre eksemplarer (30 prøver, som omfatter sande prøver og udvinding positive og negative kontroller, plus 2 PCR vand kontrolelementer i tre eksemplarer, for i alt 96 kombinerede prøver og kontroller). Når PCR-reaktionerne er samlet og forseglet, er prøve plade overført til en termisk cycler placeret i en post forstærkning område for cykling.

  1. Arbejde område forberedelse
    1. Ren PCR-arbejdsstation. Spray alle overflader i brug med en RNase, DNase, DNA decontaminant, efterfulgt af DI vand to gange, og til sidst 70% ethanol.
    2. Forberede 16S PCR regneark (Se målrettet 16S PCR regneark) med en nøjagtig udsnit liste, og Tildel forskellige barcoded primere til hver prøve9. Udskrive regnearket og plade kort (Se pladen 1).
  2. PCR master mix forberedelse
    Bemærk: 16S primer udvælgelse er baseret på regionen af interesse for den særlige undersøgelse, og kan ændre ved undersøgelse eller prøve type. Før du bestiller primere, er det derfor vigtigt at bekræfte, hvad angår 16S rRNA bedste forstærker mikrober af interesse for den pågældende undersøgelse. Denne protokol som skrevet er for forstærkning af 16S V4 region. Hvis forskellige primere/region er valgt, kan så den udgloedning temperatur i den termiske cykling kræve justering.
    1. Arbejde i PCR arbejdsstation at forberede alt.
    2. Tag 50-100 µL af DNA-prøver fra-20 ° C, og alle de reagenser, der er nødvendige, og tø dem på is. Vortex og kortvarigt spin ned.
    3. Primere er forud fortyndet til arbejde koncentration på 5 µM i en mindstemængde af 20 µL.
    4. Forberede PCR master mix i specifikke 5 mL tube med kun den forreste primer ifølge beregningen i regnearket.
  3. Forberede automatiseret PCR setup robot flydende handleren
    1. For prøver, tegne en 32-godt instrument prøve adapter og indlæse 50-100 µL af DNA-prøver efter 96-brønd plade kort efter fabrikantens anvisninger.
      1. For hver PCR plade, skal du oprette 2 negative kontroller ved at placere 30 µL PCR vand i en ren prøveglas.
      2. Placere alle prøver på 32-godt instrument prøve adapter med caps låses i åben position.
    2. For omvendte primere9
      1. Fjern hætten af hver omvendte primer med specifikke stregkode # 's én ad gangen (Skift handsker mellem at undgå krydskontaminering).
      2. Placere et maksimum på 32 primere på instrumentets reagens adapter.
    3. Tag en 96-brønd PCR plade og mærke det med undersøgelse navn, sample nummer, dato og teknikers initialer.
    4. Indlæsning af robot flydende handleren
      1. Placer Overgangsstikket reagens i position B1. For at undgå en kant effekt, omhyggeligt placere en kant af adapteren mod siden, greb, og langsomt bringe andre kanten ned. Sørg for at skubbe på alle hjørner af adaptere.
      2. Sted prøve adapteren i Position C1. Sørg for at skubbe på alle hjørner af adaptere.
      3. Vortex 5 mL master mix, åbner fælles landbrugspolitik, og Placer den i position A på instrumentets master mix og reagens blok.
      4. PCR-pladen anbringes på 96-godt instrument-adapter, der er beregnet til at holde halvt med nederdel PCR plader.
      5. Start Kør og gemme som en ny fil.
      6. Følg anvisningerne og check mark hver prompt: one, tips er tilgængelige, to, affald boks er tilgængelige, og tre, starter.
    5. Når kørslen er udført, Kontroller, der var ingen fejl ved at kontrollere maskinen til fejlmeddelelser.
    6. Forsegle pladen med 12 eller 8 strip caps, vortex kraftigt, og spin ned i 1 minut ved hjælp af en 96-brønd plate spinner, og placere den på is eller i køleskab.
    7. Fjerne rør, der indeholder omvendte primere og prøver.
    8. Tage den 96-brønd plade til det efter forstærkning rum og indlæse plade på termisk cycler og cyklus overensstemmelse med tabellen af termisk-cykling betingelser (Se tabel 1).

4. målrettet 16S Post-PCR kvalitetskontrol ved hjælp af Tape-baseret Platform for gelelektroforese

Bemærk: Post-PCR kvalitetskontrol (QC) og alle efterfølgende trin udføres i et udpeget efter forstærkning i laboratoriet. DNA er analyseret i en automatiseret DNA/RNA fragmenter analyzer.

  1. Arbejde område forberedelse
    1. Ren arbejdsstationen ved sprøjtning alle overflader i brug med en RNase, DNase, DNA decontaminant, efterfulgt af DI vand to gange, og til sidst 70% ethanol.
    2. Samle alle forsyninger og nødvendigt udstyr.
  2. Forberede reagenser
    1. Placer prøvebuffer og stigen i den temperatur-kontrolleret vortexer ved 25 ° C i mindst 30 min.
  3. Mens reagenserne varmer op, forberede PCR prøver ved at samle de 3 PCR flergangsbestemmelser for hver prøve ind i et enkelt rør
  4. Indlæse prøver på instrumentet.
  5. Kort vortex og spin-ned rør med poolede PCR produkt.
  6. Placer instrumentets 96-brønd plade på en rist på RT og navngiv den.
  7. Kort vortex og spin ned prøvebuffer og stigen.
  8. Tilsæt 3 µL prøvebuffer til hver brønd af 96 godt plade (behov mindst 53 µL/skærm tape).
  9. Køre et lige antal prøver; Hvis der er ulige antal prøver, tilføje 4 µL af prøvebuffer til en tom godt.
  10. Tilføje 1 µL af stigen til en stige nå.
  11. Efter kort, tilføje 1 µL af poolede PCR produkt til dets udpegede godt.
  12. Dækplade med folie sæl
  13. Vortex pladen ved hjælp af instrumentets vortexer og adapter på 2.000 rpm i 1 minut.
  14. Spin ned til holdning prøven i bunden af røret, hvis der er bobler spin ned igen.
  15. Start softwaren.
  16. Læg båndet og lastning skærmtip i instrumentet.
  17. Indlæse prøver i fragment analyzer med en 96-brønd adapter.
  18. Oprette en køre med kontrolsoftwaren.
  19. Sørg for at vælge selv nummererede brønde.
  20. Skrive prøve-id'er.
  21. Kontroller, at alle brønde skærmen tape er fremhævet i grå.
  22. Sørg for analysatoren genkender alle pipette tips.
  23. Vælg start og angive et filnavn for at gemme resultaterne (studere navn, prøve tal og dato).
  24. Henvise til fabrikantens anvisninger for flere detaljer.
  25. Når kørslen er udført, kassere tip, skærmen tape og rør.
  26. Analysere data for 16S peak nM (mellem 315-450 bp for V4). Denne peak vil variere afhængigt af primere valgt.

5. bibliotek beregning, Pooling, oprydning, og QC

  1. Efter bestemmelse af amplikon størrelse og molariteten af alle prøver, pool biblioteker for at opnå den endelige ønskede volumen og nM for poolede biblioteket (Se Sample beregning).
  2. Oprydning og koncentrat poolede biblioteket ved hjælp af en silica-membran-baserede rensning kit til PCR produkter, ifølge producentens protokol (Se Tabel af materialer).
    1. Elueres DNA endelige mængden af 50 µL.
  3. Måle koncentrationen af de rensede bibliotek straks ved hjælp af en dobbelt strandede DNA høj følsomhed kit til en fluorometer, efter producentens protokol.
    1. Fortyndes 2 µL af biblioteket samlet og renset med 198 µL af fortynding buffer plus farvestof (1: 100 fortynding).
    2. Optage den målte værdi fra fluorometriske enheden og konvertere det ifølge fortyndingsfaktoren.
  4. Brug koncentrationen læsning (ng/µL) for poolede biblioteket, beregne bibliotek molariteten i nM. Brug 1 µL ufortyndet bibliotek til at måle OD260/280 på Spektrofotometer microvolume.
    Bemærk: En værdi af 1,8-2,0 viser tilstrækkelig renhed af biblioteket.
  5. Gemme den endelige bibliotek ved-20 ° C indtil klar til næste generation sequencing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen præsenteres her indeholder vigtige kvalitetskontrol (QC) trin for at sikre, at data genereret mødes benchmarks for protokollens følsomhed, specificitet og forurening kontrol. Protokollens første QC skridt følger PCR-amplifikation af regionen 16S V4 (figur 2). Én µL PCR produkt fra hver prøve blev analyseret af elektroforese at bekræfte at det var inden for det forventede størrelse 315-450 bp (figur 2, rød pil). Nogle menneskelige mælkeprøver genereret lavere mængder af specifikke produkt (figur 2A, Sammenlign baner 3 og 9-11 med vejbaner 4-8), foreslår enten lave niveauer af udvundet mikrobielle DNA i disse prøver, eller carry-over af PCR hæmmere under udvinding. For prøver, der producerer mindre end 2,0 nM af produktet i 315-450 bp rækkevidde (figur 2A, lane 7), PCR hæmmer oprydning er gennemført ud ved hjælp af et enkelt skridt kit og prøven er igen forstærkes. Succesrate for inddrivelse af prøven forstærkning efter oprydning er ca. 40%. Kvantitering af specifikke produkt for hver prøve (figur 2B) er af afgørende betydning for bestemmelse af sin nødvendige volumen for lig kindtand pooling af prøver til sekvensering. En samlet bibliotek til målrettede sekvensering er normalt domineret af en specifik PCR produkt (figur 3). Hvis der er en betydelig mængde af ikke-specifik vare i biblioteket, tilføjes en gel-rensning skridt til arbejdsprocessen.

I eksemplet præsenteres i figur 2A, svag bands er observeret for buffer kontrolelementer (BC; baner 2 og 12) og PCR vand negativ kontrol (PC, lane 1), med angivelse af mulig forurening af miljøet eller reagens. Bands er ikke ualmindelige og repræsenterer typisk lavt beløb af PCR produkt (dvs.< 1 nM) og producere par Læs tæller under sekventering (< 1000). Repræsentative sekventering resultater (figur 4) bekræfter, at disse prøver virkelig har meget lav sekventering læse tæller (figur 4A, baner 1 og 11; Figur 4B, Buffer og PCR vand baner) og vigtigere, taxa sammensætning for kontrolprøverne adskiller sig fra de menneskelige mælkeprøver (figur 4A; Sammenlign baner 1 og 11 med baner 2-10). Høj Læs tæller i den negative kontrol, sammen med betydelig overlapning i taxa sammensætning mellem kontrol og prøver, antyder krydskontaminering og behovet for forbedret forurening kontrol.

Sekventering resultater (figur 4) viser høj diversitet i taxa forbundet med modermælk microbiome og variation i antallet af sekventering læse tæller for hver prøve (figur 4A, baner 2-10). Derimod sekventering resultaterne for bakteriel mock, blev behandlet sammen med de menneskelige mælkeprøver demonstreret taxa sammensætning og læse tæller, der kunne sammenlignes med resultater opnået for mock i tidligere arbejdsproces kører (Sammenlign figur 4A , lane 12 med figur 4B, mock baner). De ensartede resultater til mock baner tyder på, at den observerede variation for de menneskelige mælkeprøver er en autentisk eksperimentelle resultat, og ikke en funktion af iboende arbejdsproces variabilitet.

Figure 1
Figur 1: Flow chart målrettet 16S sekventering rørledning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontrol analyse af 16S V4 amplikoner. (A) Gel billede af 16S V4 amplikoner løst ved elektroforese ved hjælp af en automatiseret DNA/RNA fragmenter analyzer. 16s V4 amplikoner blev genereret ifølge Caporaso et al. 9, og én µL af hver PCR produkt blev analyseret ved hjælp af høj følsomhed DNA reagenser ifølge producentens retningslinjer. De fleste menneskelige mælkeprøver (baner 3-6 og 8-11) og bakteriel mock (lane 13) produceret en primær PCR produkt på den forventede størrelse på ca. 400 bp (rød pil). Den menneskelige mælkeprøven i lane 7 undladt at producere en betydelig mængde af specifikke produkt og var genstand for oprydning og re forstærkning. Minimal produkt blev opdaget for PCR negativ kontrol (PC, lane 1), og lysis buffer negative kontroller (BC, baner 2 og 12) angivet minimal kontaminering til stede i de analyserede prøver. MW, molekylvægt markører: øverste røde og lavere grønne barer identificere 1.500 bp og 25 bp størrelse markører, henholdsvis i hver bane. (B) Top elektroferogrammet Lane 3 fra gel i (A). Den primære PCR produkt falder inden for regionen peak defineret af de røde lodrette bjælker og består af fragmenter spænder i størrelse fra 299-497 bp resulterer i en gennemsnitlig PCR produktstørrelse på 396 bp. Gating sker på et lidt bredere udvalg end de forventede amplikon størrelse (i n denne sag 315-450 bp) at være sikker på at inkludere hele prøven peak. De øvre og nedre toppe korrelerer med fragment størrelser 25 bp og 1.500 bp, henholdsvis. Bunden: diagrammet opsummerer størrelse parametre for regionen peak, koncentrationen i ng/µL PCR produktet inden for regionen peak og molariteten i nM for specifikke PCR produktet. Denne information bliver derefter brugt til at beregne, hvor meget af hver prøve samles i en lige kindtand bibliotek til sekvensering (Se Sample beregning). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: elektroferogrammet af en fælles og koncentreret sekventering bibliotek. Lige store kindtand mængder af individuelle prøver at blive sekventeret blev kombineret i en samlet bibliotek. Biblioteket blev derefter rengøres og koncentreret til en samlet maengde paa 50 µL ved hjælp af en silica-membran-baserede PCR rense kit. Endelig forberedelse af biblioteket til sekvensering på den næste generation sequencer blev gennemført efter producentens protokol. Dette bibliotek var med held sekventeret trods tilstedeværelsen af yderligere bånd. Hvis der er en bekymring om PCR produkter uden for det forventede størrelsesområde, antyder producentens protokol tilføjelsen af en gel størrelse udvælgelse trin. Dette QC trin udføres ikke normalt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: evaluering af negative og positive kontroller. (A) Relative mængder af bakteriel taxa en udvinding parti med kontroller og menneskelige mælkeprøver. Som en foranstaltning til QC genereres kompositioner af hver udvinding batch som indlæst på automatiseret DNA/RNA oprensning instrument umiddelbart efter en sekventering køre. Tallene under hver prøve bar angiver antallet af filtrerede læser for den pågældende prøve. Kompositioner af kontrolelementerne buffer er adskiller sig fra de menneskelige mælkeprøver. (B) Relative mængder af bakteriel taxa i buffer, mock og PCR kontrol. Antal læsninger og sammensætning er evalueret for alle negative (buffer og PCR vand) og positivt (bakteriel mock) kontrol. Kompositioner af buffer og vand varierer, men mock Fællesskabets forbliver helt stabil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målrettet næste generations sekventering af 16S rRNA er en udbredt, hurtig teknik til microbiome karakterisering18. Men mange faktorer, herunder batch effekter, miljøforurening, prøve krydskontaminering, følsomhed og reproducerbarhed negativt kan påvirke eksperimentelle resultater og forvirre deres fortolkning7,19 , 20. bedst lette robust 16S analyser, microbiome arbejdsprocesser skal indarbejde gode eksperimentelle design, anvendelsen af passende kontrol, rumlige segregation arbejdsgangstrin, og anvendelsen af bedste praksis. Protokollen beskrevet her indeholder hver af disse parametre og giver vigtige eksperimentelle værktøjer til at tackle de ovennævnte udfordringer og gennemføre en 16S arbejdsproces for forskellige prøver.

God eksperimentelle design er afgørende for 16S microbiome analyser. Dette omfatter korrekt indsamling og opbevaring af prøver samt udvalg af 16S primere passende for det pågældende område. F.eks er V4-regionen (515F/806R) valgt for modermælk, fordi det har god forstærkning af Bifidobacterium, som spiller en vigtig rolle i udviklingen af neonatal gut microbiome21. Andre primer sæt (fx, 27F/338R, 515F/926R) kan være mere hensigtsmæssigt for undersøgelser af andre mikrobielle samfund. En vigtig bemærkning er, at den udglødning temperatur for den målrettede 16S PCR og forventede amplikon kan variere baseret på primer udvalg.

Andre steder i protokollen kan ændres er baseret på resultaterne af QC trin indarbejdes i arbejdsgangen. Et par muligheder eksisterer for fejlfinding når enten ingen eller lille DNA registreres følgende målrettede 16S PCR forstærkning trin. 1) Prøveeksemplaret kan sættes igennem en PCR-hæmmer fjernelse trin. Forstærkning følgende PCR hæmmer fjernelse ved hjælp af et enkelt skridt kit udføres pr. producentens protokol er vellykket ca fyrre procent af tiden, 2) mere ekstraherede DNA kan føjes til den målrettede 16S PCR, eller 3) en ny og potentielt større alikvot af mælk kan behandles, hvis den er tilgængelig. Hvis der er en bekymring om PCR produkter uden for det forventede størrelsesområde efter silica-membran-baserede rensning af biblioteket, kan en gel rensning trin tilføjes. Endelig er QC trin afgørende for at afgøre, om der er tegn på forurening, der er beskrevet i detaljer nedenfor. Påvises der betydelig forurening, så afhængigt af hvor forureningen er indført, enten PCR kan gentages eller eventuelt prøven kan være re uddraget. Heldigvis, med god laboratorie praksis, disse er sjældne begivenheder. Endelig, mens denne protokol er skrevet at fremhæve forbehold i forstærkningen af lav biomasse prøver og specifikt modermælk, protokollen kan let ændres til forstærkning af mundtlige, rektal, vaginal og hud svaberprøver eller svampe samt skammel. Hvis andre prøve typer er valgt, derefter tages som udvinding kits er optimal for den specifikke prøve.

Batch virkninger på grund af kits, reagenser eller sekventering løber er vigtige kilder til variation i microbiome undersøgelser. DNA udvinding kits, sammen med andre reagenser, besidder lave niveauer af bakteriel DNA, som kan variere betydeligt efter masse20,22,23,24. For et stort projekt, ved hjælp af en enkelt masse kits, reagenser, kan vælge kits designet til at minimere kit forurening forenkle analyse7. Prøver af både fag og kontrol behandles side om side. Det er bedst hvis alle prøver i en enkelt undersøgelse, både emne og kontrol, kan indarbejdes i en enkelt sekventering køre. Hvis et stort antal prøver skal behandles i batches, er prøver, der er repræsentative for både fag og kontrol indeholdt i hvert parti og behandles sammen. Det er også vigtigt at organisere batchbehandling for at minimere forurening af lav-biomasse prøver (dvs., human mælk) af prøver, der er høje biomasse (dvs., afføring). I sådanne tilfælde behandle lav biomasse prøve typer første, og derefter høj biomasse prøver for den samme undersøgelse.

Lav biomasse prøver udgør unikke udfordringer for microbiome undersøgelser, som kontaminering fra miljøet, reagenser, instrumenter, og forskeren kan gøre det vanskeligt at skelne mellem autentisk community-medlemmer til stede i lav overflod7 , 25 , 26 og de, der er kunstigt introduceret til prøven gennem eksperimenterende proces19. Arbejdsgangen beskrives her inkorporerer vigtige eksperimentelle negative kontroller på både prøve forberedelse trin (kun bufferen-lysis kontrol), og PCR trin (PCR vandkontrol) (Se figur 4). Disse kontroller at identificere forurening kilder og fremme effektive korrigerende foranstaltninger på bænk eller i siliciummangan27,28,29,30. Negative kontroller omhyggeligt vurderes og rapporteres med undersøgelse resultater7.

For at minimere forurening, er rumlige segregation af eksperimentelle aktiviteter til en ren pre-PCR forstærkning område og efter forstærkning område vigtigt. Optimalt, rene rum har både et område for PCR master mix forberedelse og en prøve forberedelse/tilføjelse af master mix område, og kan indeholde en separat død luft boks eller et biologisk sikkerhed kabinet boliger dedikeret forbrugsvarer og mindre udstyr behov for det Master mix forberedelse. Clean room design inkorporerer en positiv luftgennemstrømningssystem med højeffektiv partikler luft (HEPA) filtrering. Brug af personlige værnemidler er afgørende for at opretholde en kontrolleret, lav-mikrobielle miljø, og omfatter hårnet, lab frakker, handsker, og skoovertræk. Kits/reagenser og prøver er ideelt gemt i separate dedikerede køleskabe/frysere. PCR opsætning foregår også i renrums i udpegede arbejdsstationer; klar adskillelse af primer bestande og reagenser fra ekstraherede DNA opretholdes indtil prøver er lagt på de automatiserede pipettering platform. Når en PCR installationen er fuldført, er pladen overført til området efter forstærkning og læsset på en termisk cycler.

Det er vigtigt at begrænse strømmen af arbejdsaktivitet fra rene områder efter forstærkning områder; der er ingen retrograd bevægelse af reagenser, instrumenter eller forsyninger fra efter forstærkning områder til det rene område. Personale, der har indtastet de efter forstærkning områder er udelukket fra indrejse til det rene område i 24 timer (indtil den næste dag). Ud over ovenstående arbejdsgang skal rengøring protokoller gennemføres i både ren og efter forstærkning områder at minimere nukleinsyre forurening af arbejdsflader og instrumentation. Hvis fysiske barrierer eller separate værelser ikke er muligt, tages alle bestræbelser på at etablere arbejde i områder så langt fra hinanden som muligt.

Ud over forurening, er microbiome undersøgelser udfordret af følsomhed, variation og reproducerbarhed31. Denne protokoladresser disse spørgsmål ved at indarbejde en defineret bakteriel mock Fællesskabets, der er udvundet, forstærkes og sekventeret sammen med hver batch af prøver (Se figur 4b). Denne kontrol giver en konstant intern reference, der evaluerer reproducerbarhed af de eksperimentelle resultater, der genereres, og kan bruges til fejlfinding af problemer, der opstår. For eksempel, kan kvalitet uddraget mock DNA give en metrikværdi for effektiv prøve lysis og DNA-ekstraktion, hvilke genomisk DNA kontrolelementer gå glip af. Kvalitetskontrol af PCR-amplikoner for mock prøven kan også angive PCR effektivitet og specificitet. Desuden, fordi mock omfatter flere bakterier typer, den relative følsomhed for et forarbejdet batch af prøver kan udledes af repræsentation af taxa i sekventering resultater for mock prøven. En ideel mock Fællesskabets vil vurdere evnen til at opdage centrale bakteriearter i rum ved at blive analyseret, og derfor sammensætningen af mock Fællesskabets kan være nødvendigt at variere efter undersøgelse. Som vist i figur 4a, der er betydelig variation blandt sekventering prøveresultater, men sekvensen resultater for bakteriel mock Fællesskabets er yderst reproducerbare (Se figur 4b).

Mens mock Fællesskabets i figur 4 er en unik blanding af 33 stammer fra en kombination af kommercielt tilgængelige og lokale kliniske isolater, er et kommercielt tilgængelige mock Fællesskabets for nylig blevet udviklet32.

Selvom arbejdsprocessen beskrevet her er begrænset i sin evne til bredt adresse reproducerbarhed på tværs af forskellige microbiome undersøgelser, indeholder det en vigtig eksperimenterende tilgang, der giver forskere til at indarbejde relevante eksperimentelle kontrol og monitor reproducerbarhed inden for deres egne resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Helty Adisetiyo, ph.d.- og Shangxin Yang, ph.d. for udviklingen af protokollen. Samlede støtte til den internationale maternel Pediatric Adolescent AIDS kliniske forsøg gruppe (IMPAACT) blev leveret fra National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID) af National Institutes of Health (NIH) under Award numre UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) og UM1AI106716 (IMPAACT LC), med samfinansiering fra Eunice Kennedy Shriver nationale Institut for børns sundhed og menneskelige udvikling (NICHD) og National Institute of Mental Health (NIMH). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Immunologi og infektion sag 133 16S ribosomale RNA Microbiome næste Generation Sequencing modermælk modermælk lav biomasse
En metode til målrettede 16S sekvensering af modermælk prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter