Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En metod för riktade 16S sekvensering av bröstmjölk prover

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

För riktade sekvensering av 16S rRNA från modersmjölk och andra typer av låg-biomassa prov presenteras ett halvautomatiskt arbetsflöde.

Abstract

Studier av mikrobiella samhällen har blivit vanligt med utvecklingen av relativt billig, snabb och hög genomströmning sekvensering. Men som med alla dessa tekniker, beror reproducerbara resultat på ett laboratorium arbetsflöde som innehåller lämpliga försiktighetsåtgärder och kontroller. Detta är särskilt viktigt med låg-biomassa prover där kontaminerande bakteriell DNA kan generera missvisande resultat. Den här artikeln beskriver en halvautomatisk arbetsflödet för att identifiera mikrober från bröstmjölk mjölkprover med riktade sekvensering av 16S ribosomalt RNA (rRNA) V4 regionen på en låg - till mitten av - throughput skala. Protokollet beskrivs provberedning från helmjölk inklusive: prov lysis, nukleinsyra utvinning, förstärkning av regionen V4 av 16S rRNA-genen, och biblioteket förberedelser med åtgärder för kvalitetskontroll. Ännu viktigare, protokoll och diskussion överväga frågor som är framträdande för förberedelserna och analysen av låg-biomassa prover inklusive lämpliga positiva och negativa kontroller, PCR-hämmare borttagning, prov kontaminering av miljön, reagens, eller experimentell källor och experimentella bästa praxis för att säkerställa reproducerbarhet. Protokollet som beskrivs är specifika för bröstmjölk prover, är det anpassningsbar till ett flertal typer av låg - och hög-biomassa prov, inklusive prover som tagits på bomullstops, fryst snyggt, eller stabiliserad i en bevarande buffert.

Introduction

De mikrobiella samhällen att kolonisera människor tros vara kritiskt viktigt för människors hälsa och sjukdom som påverkar metabolismen, immun utveckling, känslighet för sjukdomar, och Svaren till vaccination och drogen terapi1, 2. insatser för att förstå bakterieflora inverkan på människors hälsa för närvarande betona identifiering av mikrober som är associerad med definierade anatomiska fack (dvs, hud, tarm, oralt, etc.), samt lokaliserade platser inom dessa fack3,4. Som underbygger dessa utredningsinsatser är den snabba uppkomsten och ökad tillgänglighet av nästa generations sekvensering (NGS) teknik som ger ett massivt parallella plattform för analys av mikrobiella genetiska innehållet (microbiom) ett varuprov. För många fysiologiska prover, de associerade mikrobiomet är både komplex och riklig (dvs, avföring), men, för vissa prover i mikrobiomet representeras av låg mikrobiella biomassan (dvs, bröstmjölk, nedre luftvägarna) där känslighet, experimentell artefakter och eventuell förorening blivit viktiga frågor. De gemensamma utmaningarna som mikrobiomet studier och lämplig experimentell design har varit föremål för flera granskning artiklarna5,6,7,8.

Presenteras häri är en robust NGS experimentella pipeline baserat på riktade sekvensering av rRNA 16S V4 region9 att karakterisera mikrobiomet av bröstmjölk. Mikrobiomet analys av bröstmjölk är komplicerade inte endast av en inneboende låg mikrobiella biomassan10, men dessutom av höga nivåer av mänskligt DNA bakgrund11,12,13,14 och potentiell överföring av PCR-hämmare15,16 i extraherade nukleinsyra. Protokollet bygger på kommersiellt tillgängliga utvinning Kit och halvautomatisk plattformar som kan hjälpa till att minimera variabiliteten över prov förberedelse batchar. Den inlemmar en väldefinierad bakteriell håna gemenskap som bearbetas tillsammans med prover som en kvalitetskontroll för att verifiera varje steg i protokollet och ge en oberoende metriska av rörledning robusthet. Även om protokollet som beskrivs är specifika för de bröstmjölk proverna, det är lätt att anpassa till andra provtyper inklusive pall, rektal, vaginalt, hud, areolar och muntliga kompresser10,17, och kan fungera som en utgångspunkt för forskare som vill utföra mikrobiomet analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

För alla protokollstegen, måste bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) och stränga kontaminering förebyggande metoder behöver tas. Följa flödet av arbete från före förstärkning arbetsområden till efter förstärkning arbetsområden att minimera kontaminering av proverna. Alla varor är steril, gratis RNase, DNase, DNA och pyrogenfri. Alla pipettspetsar filtreras. Ett flödesschema över protokollstegen tillhandahålls (figur 1).

1. prov Lysis

Obs: Urvalet lysis och nukleinsyra extraktion utförs med ett DNA/RNA extraktion kit i ett renrum miljö där både tekniska och procedurmässiga kontroller finns för att minimera införandet av miljömässiga bakterier till proverna.

  1. Arbete området förberedelse
    1. Rengör arbetsområdet skåpet biosäkerhet (BSC) med lämplig yta renare att eliminera nukleinsyra kontaminering.
    2. Slå på den tempererade vortexer, och ange det till 37 ° C.
  2. Förbereda guanidinium kaliumtiocyanat lyseringsbuffert (se tabell för material)
    1. Kontrollera lyseringsbuffert för fällningar. Lös åter fällningar av uppvärmningen vid 37 ° C.
    2. Förbereda 600 μl lyseringsbuffert med 6 µL β-merkaptoetanol (β-ME) för varje prov. Överväga en extra 20% volym per prov.
  3. Provberedning
    1. Om helmjölk är frysta, Tina den på is. Alikvotens 5 mL av hela mjölk i en 15 mL eller en 5 mL sterilt rör i BSC och hålla det på is.
    2. Snurra den 5-mL mjölken alikvotens i 10 min på 5 000 x g vid 4 ° C till pellet celler.
    3. Ta bort fett lager, nu det översta lagret i röret, med en plast spatel eller stora bar pipettspetsen.
    4. Utan att störa pelleten, avlägsna alla supernatanten utom 100 µL.
    5. Tvätta pelleten genom omblandning i 1 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    6. Förbereda 1 negativ kontroll genom att tillsätta 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i en 5 mL tub.
    7. Överför till en ren 1,5 mL centrifugrör och snurra i en mikrocentrifug för 1 min (5 000 x g i rumstemperatur (RT)).
    8. Använd en 1000 µL sterilt filtrerade pipettspetsen för att Kassera supernatanten/fettsyror hela lagret.
    9. Om inte utvinna samma dag, knäpp frysa cellen pellet genom att sätta det i en etanol/torr is flytgödsel och omedelbart överföra det till-80 ° C frysen.
  4. Störningar i provet och homogenisering (pärla-slog)
    1. Lägga till 600 μl lyseringsbuffert innehållande β-ME att pelleten och överför till en pärla-röret.
    2. Varje utvinning omgång 12 innehåller 10 prover, 1 negativ kontroll (förberedd i steg 3,7 ovan) och 1 positiv kontroll (förberedd i nästa steg).
      1. Laga 1 positiv kontroll med lyseringsbuffert och 20 µL av bakteriell håna provet (mock gemenskapen används har en koncentration, en gång utdraget, på cirka 0,2 ng/µL av DNA).
    3. Vortex alla bead rör kraftigt i 15 s.
    4. Värm prover på den tempererade vortexer vid 37 ° C i 10 minuter med skakningar vid 700-800 rpm.
    5. Fyll rören i den automatiserade provuppsättning disruptor adapter.
    6. Bead beat för 1 min vid 30 Hz.
    7. Demontera adapter uppsättningen och manuellt växla adaptern set med prov plattorna från vänster robotarmen till höger robotarmen av instrumentet.
    8. Bead beat för en annan 1 min vid 30 Hz.
    9. Centrifugrör 17,200 x g under 3 minuter vid 25 ° C.
    10. Ta bort alla av supernatanten med 200 µL pipett, vara noga med att inte få någon av det feta lagret överst på provet eller pärla kvarstående längst ned på provet, och gälla en Homogenisatorer kolumn.
    11. Centrifugera Homogenisatorer kolumner på maxhastighet, 17,200 x g, för 3 min vid 25 ° C.
    12. Över 350 µL av eluatet till en 2-mL tillverkarens mikrocentrifug rör för användning med automatiserade instrument för rening av DNA och RNA (inte Använd någon annan tube). Var noga med att inte överföra någon kvarstående fettlagret.
    13. Om genomströmning volymen är mindre än 350 µL, lägga till en slutlig volym av 350 μl lyseringsbuffert med β-ME.
    14. Lämna prover på RT för upp till 2 h innan du fortsätter till nukleinsyra isolering med hjälp av automatiserad DNA rening instrumentet, eller frysa vid-80 ° C.
  5. Rengöring av arbetsområdet
    1. Ren alla ytor i använda med en icke-enzymatiska sanering lösning, låt verka i 10 min, sedan spraya med 70% etanol och torka av ytan.

2. isolera DNA/RNA

  1. Arbete området förberedelse
    1. Slå på värmen blocket och Ställ in temperaturen till 70 ° C.
    2. Slå på den tempererade vortexer och Ställ in temperaturen till 37 ° C.
    3. Värm upp eluering bufferten (EB) innehållande 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, i en 50 mL tub till 70 ° C.
    4. Värm upp 350 µL av frusna provet lysates i 2 mL rör vid 37 ° C tills helt tinade utan eventuell fällning (ca 10 min).
  2. DNA-rening
    1. Vortex och centrifugera 2 mL tuberna med prov kort (3000 x g för 10 s).
    2. Sätt 2 mL rör i shaker efter automatiserad DNA/RNA rening instrumentets lastning diagram, enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Få rotorn adaptrar och ställa upp dem på brickan baserat på antalet prover.
    4. Märk varje rotor adapter baserat på provets identifiering (ID).
    5. Skär av locken och jämna ut kanterna på enskilda spin kolumner för DNA och RNA.
    6. Infoga kolumnen DNA spin utan samling röret i rotorn adaptern. Kassera samling röret.
    7. Etikett 1,5 mL samling rör och för in i rotorn adaptrar.
    8. Ställa in rotorn adaptrar i centrifugen efter automatiserad DNA/RNA rening instrumentets lastning diagram.
    9. Tillverkarens 1000 µL filter-tips för in spetsen rack.
    10. Tillsätt RNase-fritt vatten i en 2 mL tillverkarens mikrocentrifug rör baserat på antalet prover (per specifika maskin protokoll instruktioner).
    11. För in röret i tube slot ”A” mikrocentrifug rör slots.
    12. Kassera någon reagens som är kvar i reagensflaskorna och fylla med en minsta volym på 10 mL.
    13. Infoga reagensflaskorna i reagens flaska racket (utom EB flaska).
    14. Lägga till varma EB från en 50 mL tub till reagens flaska position 6.
    15. Kontrollera 1,5 mL rör är placerade tätt i rotorn adaptrar.
    16. Stäng locket till instrumentets och välj: ”RNA” → ”extraction kit” → ”djur, vävnader och celler” → ”kit's namn 350 µL del A Custom DNA” → redigera elutionsvolymen 100 µL (standard) eller 50 µL för låg biomassa prover → ”Start”.
    17. När du är klar, ta bort rotorn adaptrar ur centrifugen och placera dem på brickan.
    18. Kassera kolumnen DNA spin från rotor adapter position 3.
    19. Kasta inte bort rotorn adaptrar, RNA är i position 2.
    20. Ta bort 1,5 mL samling rör som innehåller eluerade DNA på position 3 och lagra i −20 ° C.
    21. Samlar in prov-innehållande rör från shaker och store i −20 ° C, om varje prov lämnas över, annars ignorera.
    22. Fortsätta med protokollet ”kit's namn 350 µL del B RNA” för ytterligare rening av RNA.
    23. RNA rening kommer att ske från de cirka 350 µL genomflöde i mittläget av rotorn adaptrar.
  3. RNA rening
    1. Infoga kolumnen RNA spin utan dess insamling tube och locket i rotorn adaptern.
    2. Märk nya 1,5 mL samling rör och infoga dem i rotorn adapter som anges i manualen.
    3. Ställa in rotorn adaptrar i centrifugen efter automatiserad DNA/RNA rening instrumentets lastning diagram.
    4. Stäng locket till instrumentets och välj: ”RNA” → ”tillverkarens Kit” → ”djur, vävnader och celler” → ”Standard del B RNA” → ”Start”.
    5. När klar, ta bort rotorn adaptrar ur centrifugen och placera dem på brickan.
    6. Kassera RNA spin kolumn från position 3.
    7. Ta bort 1,5 mL samling rör som innehåller 30 µL elueras RNA på position 3 och lagra vid −80 ° C.
    8. Ta bort reagensflaskorna.
    9. Avfallshantera rotor adapter innehåll genom lämpliga farligt avfall kanaler.
  4. Ren arbetsplats
    1. Spraya alla automatiserade DNA/RNA rening instrumentets tillbehör, såsom reagens rack, fack och annan yta i använda med en icke-enzymatiska sanering lösning, låt verka i 10 min och skölj med avjoniserat vatten (DI), så låt dem torka.
    2. Spray det automatisera instrumentet med endast tillverkaren godkända icke-enzymatiska sanering lösning, torka insidan av centrifugen tillsammans med alla ytor i användning, låt verka i 10 min och torka sedan med 70% etanol. Använd inte andra typer av sanering lösningar eftersom de kan skada instrumentet.

3. riktade 16S PCR Set-up

Obs: Upplägget för 16S PCR utförs i en utsedda före förstärkning-arbetsyta som ligger inom renrum. Reagenser och prover bereds och sedan lastas på en flytande hanteraren att utföra PCR för varje prov i tre exemplar (30 prover, som inkluderar sant prover och utvinning positiva och negativa kontroller, plus 2 PCR vatten kontroller i tre exemplar, för sammanlagt 96 kombinerade prover och kontroller). När PCR-reaktioner är monterade och förseglade, överförs prov plattan till en termocykel ligger i ett område efter förstärkning för cykling.

  1. Arbete området förberedelse
    1. Ren den PCR-arbetsstationen. Spraya alla ytor med en RNase, DNase, DNA decontaminant, följt av DI vatten två gånger, och slutligen 70% etanol.
    2. Förbereda kalkylbladet 16S PCR (se riktade 16S PCR kalkylblad) med en lista med korrekt exempel och tilldela olika barcoded grundfärger till varje prov9. Skriva ut kalkylbladet och plattan kartor (se plåt 1).
  2. PCR-master mix förberedelse
    Obs: 16S primer urval baseras på regionen av intresse för särskilda studier, och kan ändras av studie- eller prov typ. Därför, innan du beställer primers, det är viktigt att bekräfta vilket område av den 16S rRNA bästa förstärker mikrober av intresse för den särskilda studien. Detta protokoll som skrivet är för amplifiering av regionen 16S V4. Om olika primers och regioner väljs, kan därefter glödgning temperaturen i den termisk cykling behöva justeras.
    1. Arbeta i den PCR-arbetsstationen att förbereda allt.
    2. Ta ut 50-100 µL av DNA-prover från-20 ° C, och alla de reagenser som är nödvändiga, och Tina dem på isen. Vortex och kort snurra ner.
    3. Primers är pre spädas till arbetande koncentrationen av 5 µM i en minsta volym på 20 µL.
    4. Förbered PCR huvudmixen i specifika 5 mL röret med endast framåt primern enligt beräkningen på kalkylbladet.
  3. Förbereda den robotic flytande hanteraren för automatiserad PCR-installation
    1. För prover, ta ut en 32-väl instrumentets prov adapter och ladda 50-100 µL av DNA-prover enligt plattan med 96 brunnar kartan enligt tillverkarens anvisningar.
      1. För varje PCR-plattan, ställa in 2 negativa kontroller genom att placera 30 µL av PCR-vatten i en ren prov tub.
      2. Placera alla prover på 32-väl instrumentets prov adapter med caps låst i öppet läge.
    2. För omvänd primers9
      1. Ta bort locket på varje reverse primer med specifika streckkod # 's en i taget (ändra handskar emellan för att undvika korskontaminering).
      2. Placera högst 32 grundfärger på instrumentets reagens adapter.
    3. Ta ut en PCR-plattan med 96 brunnar och etikett med studien namn, antalet stickprov, datum och teknikerns initialer.
    4. Laddar den robotic flytande handler
      1. Placera reagens adaptern på plats B1. För att undvika en kant effekt, noggrant placera ena sidan av adaptern mot grepp sida, och långsamt sänka andra kanten. Se till att driva på alla hörn av adaptrar.
      2. Placera provet adaptern i Position C1. Se till att driva på alla hörn av adaptrar.
      3. Vortex 5 mL master mix, öppna locket och placera den i position A på instrumentets master mix och reagens block.
      4. Placera PCR-plattan på 96 brunnar instrumentets adapter som är avsedd att hålla halv kjolar PCR-plattor.
      5. Börja kör och Spara som en ny fil.
      6. Följ anvisningarna och markera varje fråga: en, tips finns, två, avfall kryssrutan är tillgänglig, och tre, börja.
    5. När körningen är klar, kontrollera fanns inga fel genom att kontrollera maskinen för felmeddelanden.
    6. Försegla plattan med 12 eller 8 strip mössor, vortex kraftigt, och snurra ner för 1 min med en plattan med 96 brunnar spinner, och placera den på is eller i kylskåp.
    7. Ta bort rör som innehåller omvänd primers och prover.
    8. Ta plattan med 96 brunnar till rummet efter förstärkning och ladda plattan på termocykel och cykel enligt tabellen thermal-cykling villkor (se tabell 1).

4. riktade 16S Post-PCR kvalitetskontroll använder tejp-baserad plattform för gelelektrofores

Obs: Post-PCR kvalitetskontroll (QC) och alla efterföljande steg utförs i ett utsedda efter förstärkning område i labbet. DNA analyseras i en automatiserad DNA/RNA fragment analyzer.

  1. Arbete området förberedelse
    1. Rengöra arbetsstationen genom sprutning alla ytor med en RNase, DNase, DNA decontaminant, följt av DI vatten två gånger, och slutligen 70% etanol.
    2. Samla alla förnödenheter och utrustning som behövs.
  2. Förbereda reagenser
    1. Placera provet buffert och stege i den tempererade vortexer vid 25 ° C i minst 30 min.
  3. Medan reagenserna som värmer upp, förbereda PCR prov genom att samla de 3 PCR-replikat för varje prov till ett enda rör
  4. Läsa in prover på instrumentet.
  5. Kort vortex och snurra ner rören med poolade PCR-produkten.
  6. Placera plattan med 96 brunnar instrumentets på ett rack på RT och etiketten.
  7. Kort vortex och spinn ner de prov buffert och stege.
  8. Tillsätt 3 µL prov buffert till varje brunn av 96 väl plattan (behovet minst 53 µL/skärm band).
  9. Kör ett jämnt antal prover. om det finns udda antal prover, tillsätt 4 µL prov buffert i en tom brunn.
  10. Tillsätt 1 µL av stege till en stege väl.
  11. Efter kartan, tillsätt 1 µL poolade PCR-produkten i dess utsedda väl.
  12. Täckplåt med folie tätning
  13. Vortex plattan med instrumentets vortexer och adapter vid 2.000 rpm för 1 min.
  14. Snurra ner till position provet vid botten av röret, om det finns bubblor spinn ner igen.
  15. Starta programvaran.
  16. Fyll skärmen tejp och lastning tips i instrumentet.
  17. Ladda prover i fragment analyzer med en 96 brunnar adapter.
  18. Ställa in en kör med programvaran för handkontrollen.
  19. Se till att välja jämnt numrerade brunnar.
  20. Skriva prov-ID.
  21. Kontrollera att alla brunnarna av skärmen bandet markeras i grått.
  22. Kontrollera att analysatorn erkänner alla pipett tips.
  23. Välj start och ange ett filnamn för att spara resultaten (studie namn, prov nummer och datum).
  24. Se tillverkarens anvisning för mer detaljer.
  25. När körningen är klar, kassera tip, skärmen band och rör.
  26. Analysera data för 16S peak nM (mellan 315-450 bp för V4). Denna topp varierar beroende på primers valt.

5. bibliotek beräkning, Pooling, sanering, och QC

  1. Efter fastställer kopiestorlek och molarity av alla prover, pool biblioteken för att uppnå den slutliga önskad volym och nM för sammanslagna biblioteket (se prov beräkningen).
  2. Sanering och koncentrat sammanslagna biblioteket använder en kvarts-membran-baserade rening kit för PCR-produkter, enligt tillverkarens protokollet (se Tabell för material).
    1. Eluera DNA med en slutlig volym av 50 µL.
  3. Mätning av koncentrationen av rengjorda biblioteket omedelbart genom att använda en dubbel stranded DNA hög känslighet kit för en fluorometer, enligt tillverkarens protokollet.
    1. Späd 2 µL av poolbaserade och rengjorda biblioteket med 198 µL förtunningsbuffert plus färgämne (spädning 1: 100).
    2. Registrera mätvärdet från fluorometric enheten och konvertera det enligt utspädningsfaktorn.
  4. Med hjälp av koncentrationen läsning (ng/µL) för sammanslagna biblioteket, beräkna den bibliotek molariteten i nM. Använd 1 µL outspädd bibliotek för att mäta den OD260/280 på en microvolume spektrofotometer.
    Obs: Ett värde på 1,8-2,0 indikerar tillräcklig renhet av biblioteket.
  5. Lagra det slutliga biblioteket vid-20 ° C tills redo för nästa generations sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det protokoll som presenteras här omfattar viktiga kvalitetskontroll (QC) steg för att säkerställa att data som genereras möter riktmärken för protokollet känslighet, specificitet och kontaminering kontroll. Protokollets första QC steg följer PCR-amplifiering av regionen 16S V4 (figur 2). En µL av PCR-produkten från varje prov analyserades av elektrofores att bekräfta att det var inom förväntad storlek 315-450 bp (figur 2, röd pil). Några bröstmjölk prover genererat lägre mängder av specifik produkt (figur 2A, jämför körfält 3 och 9-11 med körfält 4-8), vilket tyder på antingen låga nivåer av extraherade mikrobiell DNA i dessa prover eller överföring av PCR-hämmare under extraktionen. För prover som producerar mindre än 2,0 nM av produkten i 315-450 bp intervallet (figur 2A, lane 7), PCR-inhibitor rensning är buret ut med ett enda steg-kit och provet är åter förstärkt. Svarsfrekvenser för återvinning av provet förstärkning efter rensning är cirka 40%. Kvantitering av specifik produkt för varje prov (figur 2B) är nödvändigt för att fastställa dess volym som krävs för lika molar poolning av prover för sekvensering. En poolad bibliotek för riktade sekvensering är oftast domineras av en specifik PCR-produkt (figur 3). Om det finns en betydande mängd icke-specifik produkt i biblioteket, bör en gel-reningssteg läggas till arbetsflödet.

I exemplet presenteras i figur 2A, svag band observeras för buffert kontroller (BC; körfält 2 och 12) och PCR vatten negativ kontroll (PC, lane 1), som anger möjliga miljömässiga eller reagens kontaminering. Sådana band är inte ovanliga och representerar vanligtvis låg mängder av PCR-produkten (dvs.< 1 nM) och producera några Läs räknas under sekvensering (< 1 000). Representativa sekvensering resultat (figur 4) bekräftar att dessa prover har verkligen mycket låg sekvensering Läs räknas (figur 4A, körfält 1 och 11. Figur 4B, buffert och PCR vatten körfält) och, ännu viktigare, taxa sammansättningen för kontrollproverna är skiljt från bröstmjölk prover (figur 4A; jämför körfält 1 och 11 med körfält 2-10). Hög Läs räknas i de negativa kontrollerna, tillsammans med betydande överlappning i taxa sammansättning mellan kontroller och prover, föreslår korskontaminering och behovet av förbättrad kontaminering.

Sekvensering resultat (figur 4) visar hög mångfald i de taxa som är associerad med den bröstmjölk mikrobiomet och variation i antalet sekvensering Läs räknas för varje prov (figur 4A, körfält 2-10). Däremot sekvensering resultat för bakteriella håna som bearbetades tillsammans med bröstmjölk prover visat taxa sammansättning och läsa räknas som var jämförbara med resultat som erhålls för mock i tidigare arbetsflödet körs (jämför figur 4A , lane 12 med figur 4B, håna körfält). De konsekventa resultat för de håna köer tyder på att den observerade variationen för bröstmjölk prover är en autentisk experimentella resultat, och inte en funktion av inneboende arbetsflöde variabilitet.

Figure 1
Figur 1: flödesschema riktade 16S sekvensering rörledningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll analys av 16S V4 amplikoner. (A) Gel bild av 16S V4 amplikoner lösas genom elektrofores med hjälp av en automatiserad DNA/RNA fragment analysator. 16s V4 amplikoner genererades enligt Caporaso et al. 9och en µL av varje PCR-produkten analyserades med högkänslig DNA reagens enligt tillverkarens riktlinjer. De flesta mänskliga mjölkprover (körfält 3-6 och 8-11) och den bakteriella mock (lane 13) producerade en primär PCR-produkt på den förväntade storleken på cirka 400 bp (röd pil). Bröstmjölk provet i lane 7 misslyckades att producera en betydande mängd specifika produkt och var föremål för rensning och ny förstärkning. Minimala produkt upptäcktes för PCR negativ kontroll (PC, lane 1) och lysis buffert negativa kontroller (BC, körfält 2 och 12) anges minimal förorening förekommer i de analyserade proverna. MW, molekylvikt markörer: övre röda och lägre gröna staplar identifiera 1,500 bp och 25 bp storlek markörer, respektive i varje körfält. (B) Top elektroferogram Lane 3 från gel (a). Den primära PCR-produkten faller inom regionen peak definieras av de röda lodräta staplarna och består av fragment som varierar i storlek från 299-497 bp vilket resulterar i en PCR produkt medelstorlek på 396 bp. Gating görs på ett något bredare utbud än de förväntade kopiestorlek (jag n detta fall 315-450 bp) att se till att inkludera hela provet toppen. De övre och nedre topparna korrelerar med fragment storlekar 25 bp och 1.500 bp, respektive. Botten: diagrammet sammanfattar storlek parametrarna för regionen peak, koncentrationen i ng/µL av PCR-produkten inom regionen peak och molariteten i nM för PCR-produkten. Denna information används sedan för att beräkna hur mycket av varje prov kommer att slås samman i ett lika molar bibliotek för sekvensering (se prov beräkningen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: elektroferogram av poolbaserade och koncentrerad sekvensering bibliotek. Lika molar mängder enskilda prover som sekvenseras kombinerades in i en poolad bibliotek. Biblioteket var då rengöras och koncentrerade till en total volym på 50 µL med en kvarts-membran-baserade PCR städa upp kit. Slutliga förberedelserna av biblioteket för sekvensering på nästa generation sequencer genomfördes enligt tillverkarens protokollet. Detta bibliotek sekvenserades framgångsrikt trots närvaron av extra band. Om det finns en oro för PCR-produkter utanför intervallet beräknade storlek, antyder tillverkarens protokollet tillägg av en gel storlek selektionssteget. Detta QC steg utförs inte vanligtvis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: utvärdering av negativa och positiva kontrollerna. (A) relativa förekomsten av bakteriell taxa av en extraktion batch med kontroller och bröstmjölk prover. Som en åtgärd för QC genereras kompositioner av varje utvinning parti som lastade på automatiserad DNA/RNA rening instrumentet omedelbart efter sekvensering springa. Siffrorna under varje prov stapel anger antalet filtrerade läsningar för respektive provet. Kompositioner av buffert kontroller är skilt från de bröstmjölk proverna. (B) relativa förekomsten av bakteriell taxa i buffert, mock och PCR-kontroller. Antal läsningar och sammansättning utvärderas för alla negativa (buffert och PCR-vatten) och positiva (bakterie håna) kontroller. Kompositioner av buffert och vatten varierar, men håna gemenskapen förblir ganska stabil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Riktade nästa generations sekvensering av 16S rRNA är en allmänt använd, snabb teknik för mikrobiomet karakterisering18. Men kan många faktorer, inklusive batch effekter, miljöförorening, prov korskontaminering, känslighet och reproducerbarhet negativt påverka försöksresultaten och blanda ihop sin tolkning7,19 , 20. för att underlätta bäst robust 16S analyser, mikrobiomet arbetsflöden måste införliva bra experimentell design, användning av lämpliga kontroller, rumslig segregering av arbetsflödessteg och tillämpningen av bästa praxis. Protokollet beskrivs här innehåller var och en av dessa parametrar och ger viktiga experimentella verktyg för att hantera utmaningarna som ovan och genomföra ett 16S arbetsflöde för olika prover.

Bra experimentell design är avgörande för 16S mikrobiomet analyser. Detta inkluderar korrekt provtagning och förvaring av prover, samt urval av 16S primers lämpliga för regionen av intresse. Till exempel har regionen V4 (515F/806R) valts för bröstmjölk eftersom den har bra förstärkning av Bifidobacterium, som spelar en viktig roll i utvecklingen av neonatal gut mikrobiomet21. Andra primer uppsättningar (t.ex., 27F/338R, 515F/926R) kan vara lämpligare för studier av andra mikrobiella samhällen. En viktig anmärkning är att den glödgning temperatur för de riktade 16S PCR och den Förväntad kopiestorlek kan variera beroende på val av primer.

Andra platser som protokollet ändras baseras på resultatet av QC steg införlivas i arbetsflöde. Det finns några alternativ för felsökning när antingen ingen eller lite DNA upptäcks efter steget riktade 16S PCR-amplifiering. (1) provet kan sättas genom ett PCR-hämmare borttagning steg. Förstärkning följande PCR-hämmare borttagning med hjälp av ett enda steg kit utförs per tillverkarens protokollet är framgångsrika cirka fyrtio procent av tiden, 2) mer extraherat DNA kan läggas till den riktade 16S PCR, eller 3) en ny och potentiellt större alikvot av mjölk kan behandlas om den är tillgänglig. Om det finns en oro för PCR-produkter utanför intervallet beräknade storlek efter kiseldioxid-membran-baserade rening av biblioteket, kan en gel reningssteg läggas. Slutligen, QC stegen är avgörande för att fastställa om det finns bevis för kontaminering, vilket diskuteras i detalj nedan. Om betydande förorening upptäcks, sedan beroende på där föroreningen införs antingen PCR kan upprepas eller om nödvändigt, provet kan vara åter extraherade. Lyckligtvis, med god laboratoriepraxis, dessa är sällsynta händelser. Slutligen, medan detta protokoll skrivs att markera varningar i förstärkning av låg biomassa prover och specifikt modersmjölk, protokollet kan lätt ändras för förstärkning av oral, rektal, vagina och hud kompresser eller svampar samt pall. Om andra typer av prov är valt, sedan hänsyn som utvinning Kit är optimal för den specifika provtypen.

Batch effekter på grund av byggsatser, reagenser eller sekvensering körningar är viktiga källor till variation i mikrobiomet studier. DNA extraktion kit, tillsammans med andra reagenser, ha låga nivåer av bakteriell DNA, som kan variera avsevärt beroende på hel20,22,23,24. För ett stort projekt, använda en enda massa kit, reagenser, kan välja kit utformade för att minimera kit kontaminering förenkla analys7. Prover av både patienter och kontroller bearbetas sida vid sida. Det är bäst om alla prover för en enda studie, både föremål och styra, kan införlivas i en enda sekvensering kör. Om ett stort antal prover skall bearbetas i omgångar, prover som är representativa för både patienter och kontroller ingår i varje parti och bearbetas tillsammans. Det är också viktigt att organisera gruppbearbetning för att minimera kontaminering av låg-biomassa prover (dvs, bröstmjölk) av prover som är hög biomassa (dvs, avföring). I sådana fall behandla låg biomassa urval typer först, och sedan hög biomassa prover för samma studie.

Låg biomassa prover posera unika utmaningar mikrobiomet studier, som kontaminering från miljön, reagenser, instrument, och forskaren kan göra det svårt att skilja mellan äkta community-medlemmar som är närvarande i låg överflöd7 , 25 , 26 och de som introduceras på konstgjord väg till provet genom experimentell process19. Arbetsflödet beskrivs här innehåller viktiga experimentella negativa kontroller på både det prov förberedelse steget (endast buffert-Lys kontroll), och den PCR (PCR-vatten kontroll) (se figur 4). Dessa kontroller kan identifiera förorening källor och underlätta effektiva korrigerande åtgärder vid bänk eller i silico27,28,29,30. Negativa kontroller noga utvärderas och rapporteras med studien resultat7.

För att minimera kontaminering, rumslig segregering av experimentell verksamhet till en ren pre-PCR amplifiering område och efter förstärkning område är viktigt. Optimalt, renrum har båda ett område för PCR huvudmixen förberedelse och ett prov förberedelse/tillägg av master blanda område, och kan innehålla en separat döda luft låda eller en biologisk säkerhet skåp bostäder dedikerad förbrukningsvaror och liten utrustning behövs för den beredning av Master mix. Den rena rum innehåller en positiv luftflödet systemet med högeffektiv partiklar (HEPA) luftfiltrering. Användning av personlig skyddsutrustning är avgörande för att bibehålla en kontrollerad, låg-mikrobiella miljö, och inkluderar hårnät, lab rockar, handskar, och sko täcker. Byggsatser/reagenser och prover är idealiskt lagras i separata dedikerade kyl/frys. PCR-installationen utförs också i renrum i utsedda arbetsstationer; tydlig separation mellan primer bestånd och reagenser extraherat DNA upprätthålls tills prover läses på automatiserade pipettering plattformen. När en PCR-installationen är klar, plattan överförs till området efter förstärkning och lastas på en termocykel.

Det är viktigt att begränsa flödet av verksamhet från rena områden efter förstärkning områden; Det finns ingen bakåtsträvande rörelse av reagenser, instrument eller leveranser från efter förstärkning områden till området ren. Personal som har angett någon av områdena efter förstärkning hindras från inträde till området ren för 24 timmar (tills nästa dag). Utöver ovanstående arbetsflöde måste rengöring protokoll genomföras i både ren och efter förstärkning att minimera nukleinsyra kontaminering av arbetsytor och instrumentation. Om fysiska hinder eller separata rum inte är möjligt, måste alla ansträngningar vidtas för att ställa in arbetet i områden så långt från varandra som möjligt.

Utöver kontaminering utmanas mikrobiomet studier av känslighet, variabilitet och reproducerbarhet31. Detta protokolladresser dessa frågor genom att införliva en definierad bakteriell håna gemenskap som utvinns, förstärks och sekvenserade tillsammans med varje batch av prover (se figur 4b). Denna kontroll ger en konstant inre referens som utvärderar reproducerbarheten av experimentella resultat genereras och kan användas för att felsöka problem som uppstår. Kvaliteten på den extraherade håna DNA kan exempelvis ge ett mått för effektiva urval lysis och DNA-extraktion, vilka genomisk DNA-kontroller missar. Kvalitetskontroll av PCR-amplikoner för håna provet kan också indikera PCR effektivitet och specificitet. Dessutom eftersom mock omfattar flera bakterier typer, kan relativ känslighet för en bearbetad sats av prover utläsas av representation av taxa i sekvensering resultaten för håna provet. En idealisk håna gemenskapen kommer att utvärdera möjligheten att upptäcka bakteriell nyckelart i kupén som analyseras, och sammansättningen av mock gemenskapen kan därför behöva variera av studien. Som visas i figur 4a, det finns stor variation bland sekvensering provresultaten, men sekvens resultaten för bakteriell håna gemenskapen är mycket reproducerbara (se figur 4b).

Håna gemenskapen i figur 4 är en unik blandning av 33 stammar från en kombination av kommersiellt tillgängliga och lokala kliniska isolat, varit ett kommersiellt tillgängliga håna gemenskapen nyligen utvecklade32.

Även om arbetsflödet beskrivs här är begränsad i sin förmåga att i stort sett adressen reproducerbarhet mellan olika mikrobiomet studierna, ger det ett viktigt experimentella förhållningssätt som tillåter forskare att införliva lämpliga experimentella styr och övervaka reproducerbarhet inom sina egna resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Helty Adisetiyo, PhD och Shangxin Yang, PhD för utveckling av protokollet. Övergripande stöd för den internationella mödra Pediatric Adolescent AIDS kliniska prövningar Group (IMPAACT) tillhandahölls av det nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) av National Institutes of Health (NIH) under Award nummer UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) och UM1AI106716 (IMPAACT LC), med medfinansiering från Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen (NICHD) och National Institute of Mental Health (NIMH). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Immunologi och infektion fråga 133 16S ribosomalt RNA microbiom nästa generations sekvensering bröstmjölk bröstmjölk låg biomassa
En metod för riktade 16S sekvensering av bröstmjölk prover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter