Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Abstract

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Introduction

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.

Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).

1. Probe lyse

Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein DNA/RNA-Extraktion-Kit in einem Reinraum wo gibt es technische und verfahrenstechnische Kontrollen, die Einführung von Umweltbakterien zu den Proben zu minimieren.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Das Biosafety-Kabinett (BSC) Arbeitsbereich sauber mit entsprechenden Oberflächen Reiniger, Nukleinsäure-Verunreinigungen zu beseitigen.
    2. Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer, und setzen Sie ihn auf 37 ° C.
  2. Guanidinium-Thiocyanat-Lyse-Puffer vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien)
    1. Überprüfen Sie die Lyse-Puffer für Ausscheidungen. Wieder lösen sich Ausscheidungen durch die Erwärmung bei 37 ° C.
    2. Bereiten Sie 600 µL Lyse Puffer mit 6 µL β-Mercaptoethanol (β-ME) für jede Probe. Betrachten Sie ein extra 20 % Volumen pro Probe.
  3. Vorbereitung der Probe
    1. Wenn Vollmilch eingefroren ist, lassen tauen Sie es auf Eis auf. Aliquoten 5 mL des ganzen Milch in einem 15 mL oder eine 5 mL steriles Röhrchen im BSC und halten sie auf dem Eis.
    2. Drehen Sie die 5 mL Milch aliquoten für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C, pellet-Zellen.
    3. Die Fettschicht zu entfernen, jetzt die oberste Schicht in der Röhre, mit einem Kunststoffspachtel oder große Bohrung Pipettenspitze.
    4. Ohne zu stören das Pellet, entfernen des Überstands mit Ausnahme von 100 µL.
    5. Waschen Sie die Pellets von resuspending in 1 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    6. Bereiten Sie 1 negative Kontrolle durch Zugabe von 1 mL sterile PBS, eine 5-mL-Tube.
    7. Die Aussetzung auf eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und spin in einem Microcentrifuge für 1 min (5.000 x g bei Raumtemperatur (RT)).
    8. Verwenden Sie eine 1.000 µL steriler gefilterter Pipettenspitze um die gesamte Ebene überstand/Fettsäuren zu verwerfen.
    9. Wenn nicht extrahieren am selben Tag snap frieren die Zelle pellet-indem man es in einem Ethanol/trocken Eis Gülle und sofort auf die-80 ° C Gefrierschrank zu übertragen.
  4. Probe-Störung und Homogenisierung (Wulst-schlagen)
    1. Fügen Sie 600 µL Lyse Puffer mit β-ME zum Pellet und übertragen Sie die Aussetzung zu einem Wulst-Schlauch.
    2. Jede Charge der Extraktion von 12 enthält 10 Proben, 1 Negativkontrolle (vorbereitet in Schritt 3.7 oben) und 1 positiv-Kontrolle (im nächsten Schritt vorbereitet).
      1. Bereiten Sie 1 Positivkontrolle mit Lyse-Puffer und 20 µL der bakteriellen mock Probe (mock Gemeinschaft verwendet hat eine Konzentration, die einmal extrahiert, von ca. 0,2 ng/µL DNA).
    3. Vortex alle bead Tubes energisch für 15 s.
    4. Erwärmen Sie Proben über temperaturgesteuerte Vortexer bei 37 ° C für 10 min, mit Schütteln bei 700-800 u/min.
    5. Laden Sie Rohre in das automatisierte Sample Disruptor Adapterset.
    6. Wulst schlagen für 1 min bei 30 Hz.
    7. Zerlegen Sie das Adapter-Set und manuell wechseln des Adapters set mit die Musterplatten aus der linken Roboterarm, der rechts Roboterarm des Instruments.
    8. Wulst schlagen für ein weiteres 1 min bei 30 Hz.
    9. Zentrifuge Röhren 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.
    10. Entfernen Sie alle der Überstand mit einer 200 µL Pipette, wobei Sie darauf achten, nicht um eine der fetthaltigen Schicht an der Spitze der Probe oder die Perle Rückstände an der Unterseite der Probe, und gelten für eine Spalte Homogenisator.
    11. Zentrifuge Homogenisator Spalten mit maximaler Geschwindigkeit, 17.200 x g, für 3 min bei 25 ° C.
    12. Übertragen Sie 350 µL Eluat auf ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch für den Einsatz mit dem automatisierten Instrument zur Reinigung von DNA und RNA (verwenden Sie nicht anderen Röhre). Achten Sie darauf, dass Sie keine verbleibende Fettschicht zu übertragen.
    13. Bei der Durchströmung Größe von weniger als 350 µL fügen Sie Lyse Puffer mit β-ME zu einem Endvolumen von 350 µL hinzu.
    14. Lassen Sie die Proben an RT für bis zu 2 Stunden bevor Sie fortfahren Nukleinsäure-Isolierung mit dem automatisierten DNA-Reinigung-Instrument oder Einfrieren bei-80 ° C.
  5. Reinigung Arbeitsbereich
    1. Sauber alle Oberflächen in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 min, dann sprühen Sie mit 70 % Ethanol und wischen Sie die Oberfläche.

(2) isolieren Sie DNA/RNA

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Schalten Sie den Heizblock und stellen Sie die Temperatur auf 70 ° C.
    2. Schalten Sie die temperaturgeführte Vortexer und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.
    3. Wärmen Sie die Elution Puffer (EB) mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in einem 50-mL-Röhrchen bis 70 ° C.
    4. Wärmen Sie 350 µL eingefrorene Samenprobe Lysates in 2 mL Röhrchen bei 37 ° C, bis Sie vollständig aufgetaut ohne jede Niederschlag (ca. 10 min).
  2. DNA-Reinigung
    1. Wirbel und Zentrifuge der 2-mL-Röhrchen mit kurz Probe (3000 X g für 10 s).
    2. Legen Sie 2 mL Röhrchen in den Shaker nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gemäß den Herstellerangaben.
    3. Bekommen Sie die Rotor-Adapter und richten Sie diese auf dem Tablett, basierend auf der Anzahl der Proben.
    4. Beschriften Sie jeden Rotor Adapter anhand des Beispiels Identifikation (ID).
    5. Schneiden Sie den Deckel und glätten Sie die Kanten der einzelnen Spin Spalten für DNA und RNA.
    6. Fügen Sie die DNA Spin Spalte ohne das Sammelröhrchen in den Rotor-Adapter. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen.
    7. Label 1,5 mL Röhrchen und Rotor-Adapter stecken.
    8. Rotor-Adapter in die Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.
    9. Tipp-Racks stecken Sie des Herstellers 1.000 µL Filterspitzen.
    10. Ein 2-mL-Hersteller Microcentrifuge Schlauch basierend auf der Anzahl der Proben (je spezifischen Maschinenanweisungen Protokoll) fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu.
    11. Stecken Sie das Rohr in Rohr-Steckplatz "A" Microcentrifuge Schlauch Slots.
    12. Entsorgen Sie Reagenz, das in Flaschen Reagenz und füllen mit einem Mindestvolumen von 10 mL übrig bleibt.
    13. Das Reagenz Flaschenregal (außer EB Flasche) stecken Sie Reagenz Flaschen.
    14. Die Position der Reagenz Flasche 6 warme EB aus der 50-mL-Tube hinzufügen.
    15. Check-1,5 mL-Tuben sind eng in die Rotor-Adapter platziert.
    16. Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Extraktion Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Kit Name 350 µL Teil A Custom DNA" → Elution Lautstärke 100 µL (Standard) oder 50 µL für niedrigen Biomasse Proben → bearbeiten "Start."
    17. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf dem Tablett.
    18. Entsorgen Sie die DNA Spin Spalte von Rotorposition Adapter 3.
    19. Rotor-Adapter nicht wegwerfen, RNA ist in der Position 2.
    20. 1,5 mL Röhrchen mit eluierten DNA an Position 3 zu entfernen und speichern in −20 ° C.
    21. Sammeln Sie Probe-haltige Rohre im Shaker und Store in −20 ° C, wenn jede Probe, sonst verwerfen übrig ist.
    22. Fahren Sie mit dem Protokoll "Kit Name 350 µL Teil B RNA" für die weitere Reinigung der RNA.
    23. RNA-Reinigung erfolgt von der rund 350 µL durchströmten, die in der mittleren Position des Rotors Adapter ist.
  3. RNA-Reinigung
    1. Fügen Sie die RNA Spin Spalte ohne seine Sammelröhrchen und Deckel in den Rotor-Adapter.
    2. Beschriften Sie neue 1,5 mL Röhrchen und in Rotor-Adapter setzen Sie ein, wie im Handbuch angegeben.
    3. Die Rotor-Adapter in der Zentrifuge nach automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments laden Diagramm gesetzt.
    4. Schließen Sie das Instrument Deckel und wählen Sie: "RNA" → "Des Herstellers Kit" → "Tier, Geweben und Zellen" → "Standard Teil B RNA" → "Start."
    5. Nach Fertigstellung, entfernen Sie Rotor-Adapter aus der Zentrifuge zu und legen Sie sie auf dem Tablett.
    6. RNA-Spin-Spalte von Position 3 zu verwerfen.
    7. 1,5 mL Röhrchen mit 30 µL eluiert RNA an Position 3 zu entfernen und Lagern bei −80 ° C.
    8. Reagenz-Flaschen zu entfernen.
    9. Rotor-Adapter Inhalt durch entsprechende Sondermüll Kanäle entsorgen.
  4. Sauberen Arbeitsplatz
    1. Spray alle automatisierten DNA/RNA Reinigung des Instruments Zubehör wie Reagenz Racks, Tablett und einer anderen Oberfläche in mit einer nicht-enzymatische Dekontaminationslösung verwenden, lassen Sie für 10 Minuten und Spülen mit entionisiertem Wasser (DI), dann trocknen lassen.
    2. Spray die automatisierten Instrument mit nur Hersteller genehmigt nicht-enzymatische Dekontaminationslösung, wischen Sie die Innenseite der Zentrifuge zusammen mit allen Oberflächen lassen für 10 min und wischen Sie dann mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie andere Arten von Dekontamination Lösungen nicht, da diese das Gerät beschädigen können.

3. gezielte 16 s PCR Setup

Hinweis: Das Setup für die 16 s-PCR wird in einem dafür vorgesehenen Vorverstärkung Arbeitsbereich befindet sich innerhalb der Reinraum durchgeführt. Die Reagenzien und Proben sind vorbereitet und dann auf einen flüssigen Handler durchführen die PCR für jede Probe in dreifacher Ausfertigung (30 Proben, darunter wahre Proben und Extraktion positive und negative Kontrollen, plus 2 PCR Wasser steuert in dreifacher Ausführung, für eine Gesamtmenge von 96 verladen kombinierten Proben und Kontrollen). Sobald die PCR-Reaktionen montiert und abgedichtet sind, ist ein Thermocycler befindet sich in einer Post-Verstärkung-Gebiet zum Radfahren Probenteller übertragen.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Reinigen Sie die PCR-Workstation. Spray, die alle Oberflächen mit einer RNase, DNase, DNA Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.
    2. Vorbereiten der 16 s-PCR-Arbeitsblatt (siehe gezielte 16 s PCR Arbeitsblatt) eine genaue Liste und weisen unterschiedliche Barcodes Primer an jede Probe-9. Drucken Sie das Arbeitsblatt und die Platte Karten (siehe Plate 1).
  2. PCR-master-Mix-Vorbereitung
    Hinweis: 16 s Grundierung Auswahl basiert auf der Region von Interesse für die Studie und kann durch Studium oder Probe-Typ ändern. Daher vor der Bestellung Primer, ist es wichtig, welchem Bereich der 16 s rRNA beste verstärkt die Mikroben von Interesse für die Studie zu bestätigen. Dieses Protokoll wie geschrieben ist für die Verstärkung der 16 s V4 Region. Verschiedenes Grundierungen/Region ausgewählt sind, kann die Anlasstemperatur in die Temperaturzyklen Anpassung verlangen.
    1. Arbeiten Sie in der PCR-Arbeitsstation, um alles vorzubereiten.
    2. Nehmen Sie 50-100 µL DNA-Proben von-20 ° C und alle benötigten Reagenzien und tauen sie auf Eis. Wirbel und kurz spin-down.
    3. Die Primer werden vorab zur Arbeit Konzentration von 5 µM in ein Mindestvolumen von 20 µL verdünnt.
    4. Bereiten Sie die PCR-master-Mix in der spezifischen 5 mL Tube mit nur die forward Primer nach der Berechnung auf dem Arbeitsblatt.
  3. Vorbereitung des Roboter liquiden Handlers für automatisierte PCR setup
    1. Für Proben ein 32-gut Instrument Probe Adapter herausnehmen, und 50-100 µL DNA-Proben nach der 96-Well-Platte-Karte gemäß den Anweisungen des Herstellers zu laden.
      1. Für jede PCR-Platte 2 Negativkontrollen indem man 30 µL des PCR-Wasser in einem sauberen Probenröhrchen eingerichtet.
      2. Legen Sie alle Proben auf das 32-gut Instrument Probe Adapter mit Kappen verschlossen in Offenstellung.
    2. Für reverse Primer9
      1. Entfernen Sie die Kappe von jedem rückwärts-Primer mit bestimmten Barcode # es eins zu einem Zeitpunkt (Handschuhe wechseln dazwischen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden).
      2. Legen Sie maximal 32 Primer auf das Instrument Reagenz Adapter.
    3. Nehmen Sie eine 96-Well-PCR-Platte und beschriften Sie sie mit Studiennamen, Probennummer, Datum und Initialen des Technikers.
    4. Laden den Roboter liquiden handler
      1. Setzen Sie den Reagenz-Adapter auf B1. Um einen Effekt zu vermeiden, legen Sie vorsichtig eine Kante des Adapters gegen die Griffseite und langsam die andere Kante herab. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.
      2. Setzen Sie die Probe-Adapter in Position C1. Achten Sie darauf, an allen Ecken von den Adapter schieben.
      3. Wirbel der 5-mL-master-Mix, öffnen Sie die Kappe, und legen Sie sie in Position A auf das Instrument master Mix und Reagenz Block.
      4. Legen Sie die PCR-Platte auf der 96-Well-Instrument-Adapter, der halb skirted PCR-Platten halten soll.
      5. Den Durchlauf starten und als neue Datei speichern.
      6. Folgen Sie den Anweisungen und Häkchen jeder Eingabeaufforderung: einerseits Tipps gibt es, zwei, Abfallbehälter ist verfügbar, und drei, starten.
    5. Nach der abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, es gab keine Fehler durch die Überprüfung der Maschine für Fehlermeldungen.
    6. Dichtplatte mit den 12 oder 8 Streifen Kappen, Strudel kräftig, spin-down für 1 min mit einem 96-Well-Platte-Spinner und legen Sie es auf Eis oder in den Kühlschrank stellen.
    7. Röhrchen mit reverse Primer und Proben zu entfernen.
    8. Nehmen Sie die 96-Well-Platte um den Post-Verstärkung-Raum und laden Sie die Platte auf den Thermocycler und Zyklus entsprechend der Tabelle des thermischen Radfahren Bedingungen (siehe Tabelle 1).

4. gezielte 16 s Post-PCR-Qualitätskontrolle mit Band-basierte Plattform für Gelelektrophorese

Hinweis: Post-PCR-Qualitätskontrolle (QC) und alle weiteren Schritte werden in einem bestimmten Bereich der Post-Verstärkung des Labors durchgeführt. Die DNA wird in einen automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer analysiert.

  1. Bereich Arbeitsvorbereitung
    1. Reinigen Sie die Arbeitsstation durch Spritzen, die alle Oberflächen mit RNase, DNase, DNA-Dekontaminierungsmittel gefolgt von VE-Wasser zwei Mal, und schließlich 70 % Ethanol.
    2. Sammeln Sie alle Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände benötigt.
  2. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Der temperaturgesteuerten Vortexer bei 25 ° C für mindestens 30 min entgegenbringen Sie Probenpuffer und Leiter.
  3. Während die Reagenzien Aufwärmen, bereiten Sie PCR Proben vor, durch die Bündelung der 3 PCR-Wiederholungen für jede Probe in ein einzelnes Rohr
  4. Proben am Instrument zu laden.
  5. Kurz Wirbel und Spin-down Rohre mit gepoolten PCR-Produkt.
  6. Platzieren Sie das Instrument 96-Well-Platte auf eine Zahnstange bei RT und beschriften Sie sie.
  7. Kurz nach unten Wirbel und Spin Probenpuffer und Leiter.
  8. Geben Sie 3 µL Probenpuffer in jedes der 96-well-Platte (Notwendigkeit mindestens 53 µL/Bildschirm Klebeband).
  9. Führen Sie eine gerade Anzahl von Proben; besteht eine ungerade Anzahl von Proben, geben Sie 4 µL Probenpuffer in eine leere.
  10. Hinzu kommt 1 µL Leiter Anlegeleiter gut.
  11. Nach der Karte hinzufügen 1 µL der gepoolten PCR-Produkt seiner ausgewiesenen gut.
  12. Abdeckplatte mit Folienversiegelung
  13. Wirbel der Platte mit des Instruments Vortexer und Adapter bei 2.000 u/min für 1 min.
  14. Drehen Sie wieder nach unten in Position, die die Probe an der Unterseite des Rohres, wenn es gibt Spin down sprudelt.
  15. Starten Sie die Software.
  16. Laden Sie Bildschirmtipps Band und laden in das Gerät.
  17. Proben in den Fragment-Analysator mit einem 96-Well-Adapter zu laden.
  18. Richten Sie ein mit der Controller-Software laufen.
  19. Achten Sie darauf, wählen geradzahligen Brunnen.
  20. Beispiel-IDs zu schreiben.
  21. Überprüfen Sie, dass die Brunnen des Bandes Bildschirm grau hervorgehoben werden.
  22. Stellen Sie sicher, dass der Analyzer erkennt die Pipettenspitzen.
  23. Wählen Sie Start, und geben Sie einen Dateinamen, um die Ergebnisse zu speichern (Studie Probennummern, Name und Datum).
  24. Beziehen sich auf die Anweisungen des Herstellers für weitere Details.
  25. Nachdem das abgeschlossen ist, entsorgen Sie Tipp, Bildschirm Klebeband und Röhren.
  26. Analysieren von Daten für 16 s Peak nM (zwischen 315-450 bp für V4). Dieser Gipfel variieren je nach dem Primer ausgewählt.

5. Bibliothek Berechnung, Pooling, Clean-Up, und QC

  1. Nach der Bestimmung der Größe der Amplifikate und Molarity aller Proben, bündeln die Bibliotheken zur Erreichung der gewünschten Endvolumen und nM für die gepoolten Bibliothek (siehe Beispielrechnung).
  2. Clean-Up und Konzentrat die gepoolte Bibliothek mit einer Silica-Membran-basierten Läuterung kit für PCR-Produkte nach Angaben des Herstellers Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Eluieren Sie die DNA mit einem Endvolumen von 50 µL.
  3. Messen Sie die Konzentration der gereinigten Bibliothek sofort mit den doppelten gestrandeten DNA-hohe Empfindlichkeit Kit für ein Fluorometer laut Protokoll des Herstellers.
    1. Verdünnen Sie 2 µL der gebündelt und gereinigte Bibliothek mit 198 µL des Verdünnungspuffer plus Farbstoff (1: 100 Verdünnung).
    2. Nehmen Sie den gemessenen Wert vom fluorometrisch Gerät und nach den Verdünnungsfaktor zu konvertieren.
  4. Mit der Konzentration (ng/µL) für die gepoolten Bibliothek lesen, berechnen Sie die Bibliothek Molarity in nM. Verwenden Sie 1 µL unverdünnte Bibliothek der OD260/280 auf einem Microvolume Spektralphotometer messen.
    Hinweis: Der Wert von 1,8-2,0 gibt ausreichende Reinheit der Bibliothek.
  5. Speichern Sie die endgültige Bibliothek bei-20 ° C bis bereit für die nächste Generation-Sequenzierung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-450 bp (Abbildung 2, roter Pfeil). Einige menschliche Milchproben erzeugt geringere Mengen des spezifischen Produktes (Abbildung 2A, vergleichen die Bahnen 3 und 9 / 11 mit Bahnen 4-8), schlägt entweder niedrigen Konzentrationen von mikrobiellen DNA in diesen Proben oder Verschleppung von PCR-Inhibitoren während der Extraktion gewonnen. Für Proben, die produzieren weniger als 2,0 nM des Produkts im 315-450 bp-Bereich (Abb. 2A, Bahn 7), PCR-Inhibitor Bereinigung wird durchgeführt, mit einem einzigen Schritt-Kit und die Probe ist wieder verstärkt. Erfolgsraten für die Wiederherstellung der Probe Verstärkung nach Bereinigung ca. 40 %. Quantifizierung von bestimmten Produkt für jede Probe (Abb. 2 b) ist wesentlich für die Bestimmung der erforderliche Volumen gleich molare Pooling von Proben für die Sequenzierung. Eine gepoolte Bibliothek für gezielte Sequenzierung wird in der Regel durch eine spezifische PCR-Produkt (Abbildung 3) dominiert. Besteht eine erhebliche Menge an nicht-spezifische Produkt in der Bibliothek, sollte der Workflow ein Gel-Reinigung Schritt hinzugefügt werden.

Im Beispiel in Abbildung 2Apräsentiert, sind schwache Bänder für Puffer Steuerelemente beobachtet (BC; Bahnen 2 und 12) und der PCR Negativkontrolle (PC, Spur 1), Wasser zeigt mögliche Umwelt- oder Reagenz Kontamination. Solche Bands sind keine Seltenheit und repräsentieren in der Regel geringe Mengen an PCR-Produkt (d.h.< 1 nM) und produzieren nur wenige lesen Sie zählt während der Sequenzierung (< 1.000). Repräsentative Sequenzierung Ergebnisse (Abbildung 4) bestätigen, dass diese Proben in der Tat sehr niedrigen Sequenzierung lesen zählt (Abbildung 4A, Bahnen 1 und 11 haben; Abbildung 4 b, Puffer und PCR Wasser Bahnen) und vor allem die Taxa Zusammensetzung für die Kontrollproben unterscheidet sich von menschlichen Milchproben (Abbildung 4A; vgl. Bahnen 1 und 11 mit Bahnen 2-10). Hohen lesen Sie zählt in den Negativkontrollen, zusammen mit erhebliche Überschneidungen in Taxa Zusammensetzung zwischen Kontrollen und Proben, schlägt Cross-Kontamination und die Notwendigkeit einer verbesserten Kontaminationskontrolle.

Sequenzierung Ergebnisse (Abbildung 4) zeigen hohe Diversität in der Taxa der Muttermilch Microbiome zugeordnet und Variabilität in der Anzahl der Sequenzierung lesen zählt für jede Probe (Abbildung 4A, Fahrspuren 2-10). Im Gegensatz dazu die Sequenzierung Ergebnisse für die bakterielle mock, die zusammen mit der Muttermilch Proben verarbeitet wurde demonstriert Taxa Zusammensetzung und lesen zählt, die waren vergleichbar mit den Ergebnissen für das Mock in vorherigen Workflow läuft (vergleiche Abbildung 4A , Spur 12 mit Abbildung 4 b, mock Bahnen). Die konsistente Ergebnisse für die mock Gassen vermuten, dass die beobachtete Variabilität für die Muttermilch Proben eine authentische Versuchsergebnis und keine Funktion der intrinsischen Workflow Variabilität.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm der gezielte 16 s Sequenzierung Pipeline. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Qualitätskontrolle Analyse der Amplifikate 16 s V4. (A) Gelbild der 16 s V4 Amplifikate durch Elektrophorese mit einer automatisierten DNA/RNA Fragment Analyzer gelöst. 16 s V4 Amplifikate wurden nach Caporaso Et Al. generiert. 9und 1 µL jeder PCR-Produkt wurde mit hoher Empfindlichkeit DNA Reagenzien gemäß den Richtlinien des Herstellers analysiert. Die meisten menschlichen Milchproben (Bahnen 3 bis 6 und 8 bis 11) und die bakterielle Mock (Bahn 13) produziert eine primäre PCR-Produkt in der erwarteten Größe von ca. 400 bp (roter Pfeil). Die Muttermilch Probe in Spur 7 versäumt, eine erhebliche Menge an bestimmten Produkt zu produzieren und unterlag Bereinigung und erneute Verstärkung. Minimal-Produkt wurde für die PCR-negativ-Kontrolle (PC, Spur 1) erkannt und Lyse Puffer Negativkontrollen (BC, die Bahnen 2 und 12) angegebene minimale Kontamination in der analysierten Proben vorhanden. MW, Molekulargewicht Marker: obere rote und unteren grüne Balken identifizieren die 1.500 bp und 25 bp Größe Marker, bzw. in jeder Spur. (B) Top Electropherogram der Bahn 3 aus Gel in (A). Das primäre PCR-Produkt fällt in der Peak-Region durch die roten vertikalen Balken definiert und umfasst Fragmente in einer Größe von 299-497-bp, was zu einer durchschnittlichen Größe von PCR-Produkt von 396 BP. Gating erfolgt auf ein etwas breiteres Spektrum als die erwarteten Amplikons Größe (i n diesem Fall 315-450 bp) Sie sicher, dass die gesamte Probe Spitze sein. Die oberen und unteren Spitzen korrelieren mit Fragment Größen von 25 bp und 1.500 bp, beziehungsweise. Unten: Diagramm fasst die Größenparameter für die Peak-Region, die Konzentration in ng/µL des PCR Produktes innerhalb der Peak-Region und das Molarity in nM für das PCR-Produkt. Diese Informationen werden dann verwendet, zu berechnen, wie viel von jeder Probe wird in einer gleich molare Bibliothek für die Sequenzierung gebündelt werden (siehe Beispielrechnung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Electropherogram einer Bibliothek gebündelt und konzentriert Sequenzierung. Gleiche molare Mengen von Einzelproben zu sequenzieren wurden zu einer gepoolten Bibliothek zusammengefasst. Die Bibliothek wurde dann gereinigt und konzentrierte sich auf ein Gesamtvolumen von 50 µL mit einer Silica-Membran-basierten PCR aufräumen Kit. Letzte Vorbereitung der Bibliothek für die Sequenzierung auf die nächste Generation-Sequenzer wurde laut Protokoll des Herstellers durchgeführt. Diese Bibliothek wurde erfolgreich trotz der Anwesenheit von zusätzlichen Bändern sequenziert. Besteht eine Besorgnis über PCR-Produkte außerhalb der erwarteten Größenbereich, schlägt der Hersteller Protokoll die Zugabe von einem Gel Größe Auswahlschritt. Diese QC Schritt erfolgt in der Regel nicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Auswertung der negativ-und Positivkontrollen. (A) Relative Häufigkeiten der bakteriellen Taxa eine Extraktion Charge mit Kontrollen und Proben der Muttermilch. Als QC Maßnahme entstehen Kompositionen jeder Extraktion Charge auf dem automatisierten DNA/RNA-Reinigung-Instrument geladen, unmittelbar nach der Sequenzierung laufen. Unter jeder Probe Balken geben die Anzahl der gefilterten Lesevorgänge für die jeweilige Probe. Die Kompositionen der Puffer Steuerelemente unterscheiden sich von derjenigen der menschlichen Milchproben. (B) Relative Häufigkeiten der bakteriellen Taxa in Puffer, Mock und PCR-Steuerelemente. Anzahl der Lese- und Zusammensetzung sind für alle Negative (Puffer und PCR Wasser) und positiv (bakterieller mock) Kontrollen ausgewertet. Die Kompositionen der Puffer und Wasser variieren, aber die mock Gemeinschaft bleibt relativ stabil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu erleichtern, müssen Microbiome Workflows integrieren, gute experimentelles Design, die Verwendung geeigneter Kontrollen, räumliche Trennung von Workflow-Schritte und die Anwendung von best Practices. Das hier beschriebene Protokoll enthält jeder dieser Parameter und bietet wichtige experimentelle Werkzeuge, um den oben genannten Herausforderungen und einen 16-Workflow für diverse Proben zu implementieren.

Gute experimentelle Design ist entscheidend für 16 s Microbiome Analysen. Dazu gehören korrekte Sammlung und Lagerung von Proben sowie Auswahl der 16 s Primer für die Region von Interesse. Zum Beispiel ist die V4-Region (515F/806R) für Muttermilch gewählt, weil es gute Verstärkung von Bifidobacterium, die eine wichtige in der Entwicklung der Neugeborenen Darm Microbiome21 Rollehat. Anderen Primer-Sets (z.B., 27F/338R, 515F/926R) möglicherweise besser geeignet für Studien von anderen mikrobiellen Gemeinschaften. Ein wichtiger Hinweis ist, dass die Temperatur für die gezielte 16 s Glühen PCR und die erwarteten Amplikons Größe können variieren je nach Grundierung Auswahl.

Andere Orte, die das Protokoll geändert werden kann basieren auf Ergebnissen der QC-Schritte in den Arbeitsablauf integriert. Ein paar Möglichkeiten gibt es für die Fehlersuche, wenn entweder keine oder wenig DNA erkannt wird nach dem gezielten 16 s PCR Verstärkung Schritt. (1) die Probe kann durch eine PCR-Inhibitor Schritt Entfernung gestellt werden. Verstärkung, die folgenden PCR-Inhibitor-Entfernung mit einem einzigen Schritt-Kit pro des Herstellers Protokoll durchgeführt ist erfolgreich etwa vierzig Prozent der Zeit, 2) mehr extrahiert DNA kann hinzugefügt werden, um die gezielte 16 s PCR, oder 3) ein neues und potenziell größeren Aliquoten Milch kann ggf. bearbeitet werden. Besteht eine Besorgnis über PCR-Produkte außerhalb der erwarteten Größenbereich nach der Silica-Membran-basierten Reinigung der Bibliothek, kann ein Gel Reinigungsschritt hinzugefügt werden. Schließlich sind die QC-Schritte wichtig, festzustellen, ob Anzeichen für Verunreinigungen, die weiter unten genauer eingegangen wird. Wenn erhebliche Verunreinigungen erkannt wird, dann je nachdem, wo die Kontamination eingeführt wird, entweder die PCR kann wiederholt werden oder falls nötig, kann die Probe neu extrahierten werden. Glücklicherweise sind diese mit guten Laborpraxis, seltene Ereignisse. Schließlich, während dieses Protokoll geschrieben wird, um Einschränkungen bei der Verstärkung von niedrigen Biomasse Proben und speziell der Muttermilch zu markieren, kann das Protokoll leicht für die Verstärkung der oral, rektal, vaginale und Haut Tupfer oder Schwämme sowie Hocker geändert werden. Wenn andere Probentypen ausgewählt werden, ist dann erwogen, Extraktion-Kits für die spezifischen Probentyp optimal sind.

Batch-Effekte durch Kits, Reagenzien oder Sequenzierung läuft sind wichtige Quellen der Variabilität der Microbiome Studien. DNA-Extraktion-Kits, zusammen mit anderen Reagenzien, besitzen geringe bakterielle DNA, die durch viele20,22,23,24erheblich variieren können. Für ein großes Projekt, mit einer einzigen Menge Installationssätze, Reagenzien, kann die Auswahl Kits Bausatz Verunreinigung minimieren Analyse7vereinfachen. Proben von Themen und Kontrollen sind nebeneinander verarbeitet. Es ist am besten, wenn die Proben für eine einzelne Studie, beide zu unterwerfen und zu steuern, können in einem einzigen Sequenzierung ausgeführt eingebunden werden. Wenn eine große Anzahl von Proben sind in Batches verarbeitet werden, sind Beispiele, die Vertreter der Fächer und Kontrollen sind in jeder Charge enthalten und zusammen verarbeitet. Es ist auch wichtig, Batch-Verarbeitung zur Minimierung von Kontamination der Proben Low-Biomasse (d.h. der Muttermilch) von Proben, die hohe Biomasse (z.B. Hocker) zu organisieren. In solchen Fällen niedrigen Biomasse Probe Typen zuerst, und dann hohe Biomasse Proben für die gleiche Studie zu verarbeiten.

Geringe Biomasse Proben stellen einzigartige Herausforderungen an Microbiome Studien als Verunreinigungen durch die Umwelt, Reagenzien, Instrumente, und der Forscher kann machen es schwierig zu unterscheiden, authentischer Gemeindemitglieder in niedrigen Fülle7 vorhanden , 25 , 26 und diejenigen, die zum Beispiel durch die experimentellen Prozess19künstlich eingeführt werden. Die hier beschriebene Workflow enthält wichtige experimentelle Negativkontrollen Probe Vorbereitungsschritt (nur-Puffer-Lyse-Steuerung), sowohl auf der PCR-Schritt (PCR-Wasser-Steuerung) (siehe Abbildung 4). Diese Kontrollen helfen Kontaminationsquellen erkennen und wirksame Korrekturmaßnahmen bei der Bank oder in Silico27,28,29,30erleichtern. Negativkontrollen sorgfältig ausgewertet und mit der Studie Ergebnisse7berichtet.

Um Kontamination zu minimieren, ist die räumliche Trennung der experimentellen Aktivitäten in eine saubere Prä-PCR-Amplifikation und Post-Verstärkung Bereich wichtig. Optimal, Reinraum hat sowohl eine Fläche für PCR-master-Mix-Vorbereitung und eine Probe Vorbereitung/Ergänzung des Meisters mischen Bereich und können einschließen eine separate tote Luft-Box oder einem biologischen Sicherheitsschrank Gehäuse engagierten Verbrauchsmaterialien und Kleingeräte für benötigt die Master-Mix Vorbereitung. Der Reinraum-Entwurf enthält eine positive Belüftungssystem mit hocheffizienter Partikelfilter (HEPA) Luftfiltration. Einsatz von persönlicher Schutzausrüstung ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung einer kontrollierten, niedrig-mikrobiellen Umgebung und umfasst Haarnetze, Kittel, Handschuhe, und Überschuhe. Kits/Reagenzien und Proben sind im Idealfall in separaten dedizierten Kühlschränke/Kühltruhen gelagert. PCR Setup erfolgt ebenfalls im Reinraum in dafür vorgesehenen Arbeitsplätze; klare Trennung von Grundierung Bestände und Reagenzien aus extrahierte DNA wird beibehalten, bis die Proben auf der automatischen Pipettier-Plattform geladen werden. Sobald eine PCR-Setup abgeschlossen ist, wird die Platte auf die Post-Verstärkung-Bereich übertragen und in einem Thermocycler geladen.

Es ist wichtig, den Fluss der Arbeitstätigkeit von Reinräumen auf Post-Verstärkung Bereiche einzuschränken; Es gibt keine retrograde Bewegung Reagenzien, Instrumente oder Zubehör aus den Bereichen Post-Verstärkung zum Bereich sauber. Personal, die den Post-Verstärkung-Bereichen eingegeben haben sind vom Eingang zum sauberen Bereich für 24 Stunden (bis zum nächsten Tag) ausgeschlossen. Zusätzlich zu den oben genannten Workflow Überlegungen muss die Reinigung Protokolle im sauber und Post-Verstärkung, Nukleinsäure-Kontamination von Arbeitsflächen und Instrumentierung zu minimieren implementiert werden. Wenn physische Barrieren oder getrennten Räumen nicht möglich sind, müssen alle Anstrengungen unternommen werden, um die Arbeit in den Bereichen so weit auseinander wie möglich einrichten.

Neben der Verschmutzung sind Microbiome Studien von Empfindlichkeit, Variabilität und Reproduzierbarkeit31herausgefordert. Diese IP-Adressen diese Probleme durch den Einbau einer definierten mock Bakteriengemeinschaft, der gewonnen wird, verstärkt und sequenziert zusammen mit jeder Charge der Proben (siehe Abbildung 4 b). Dieses Steuerelement bietet eine ständige interne Referenz, die die Reproduzierbarkeit die experimentellen Ergebnisse auswertet und kann verwendet werden, um Probleme zu beheben, die auftreten. Die Qualität der extrahierten DNA mock bieten beispielsweise eine Metrik für effektive Probe lyse und DNA-Extraktion, welche genomische DNA-Steuerelemente zu verpassen. Qualitätskontrolle der PCR-Amplifikate für das mock-Beispiel können auch PCR-Effizienz und Genauigkeit angeben. Außerdem weil das Mock mehrere Arten von Bakterien umfasst, die relative Empfindlichkeit für einen verarbeiteten Stapel von Proben durch die Darstellung der Taxa in der Sequenzierung Ergebnisse für die mock Probe entnehmen. Eine ideale mock Community bewerten die Fähigkeit zu wichtigen Bakterienspezies in das Fach analysierten erkennen, und die Zusammensetzung der mock Gemeinschaft kann daher je nach Studie variieren. Wie Abbildung 4azeigt, gibt es erhebliche Variabilität unter Sequenzierung Probenergebnisse, aber die Reihenfolge Ergebnisse für mock Bakteriengemeinschaft ist hoch reproduzierbare (siehe Abbildung 4 b).

Während die mock Gemeinschaft in Abbildung 4 eine einzigartige Mischung aus 33 Sorten aus einer Kombination von kommerziell verfügbar und lokalen klinischen Isolaten ist, wurde eine handelsübliche mock Gemeinschaft kürzlich entwickelten32.

Obwohl die hier beschriebene Workflow in ihrer Fähigkeit, im großen und ganzen Adresse Reproduzierbarkeit in verschiedenen Microbiome Studien begrenzt ist, bietet es einen wichtigen experimentellen Ansatz, der Forscher integrieren entsprechende experimentelle erlaubt Kontrollen und Monitor Reproduzierbarkeit innerhalb ihrer eigenen Ergebnisse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Immunologie und Infektion Ausgabe 133 16 s ribosomalen RNA Mikrobiom Next Generation Sequencing Muttermilch Muttermilch niedrigen Biomasse
Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter