Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Summary

Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.

Abstract

Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.

Introduction

Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie^{1, 2}. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer^3,

Protocol

Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).

1. Probe lyse

Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein ....

Results

Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-450 bp (

Discussion

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung¹⁸. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung^{7,19 , 20}. um robuste 16 s Analysen am besten zu erleicht.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit	Qiagen	80204	DNA/RNA-Extraktionskit
Eliminase	Fisher Scientific	435532	RNase, DNase, DNA-Dekontaminationsmittel
Thermomixer	Fisher Scientific		temperaturgesteuerter Vortexer-Puffer
RLT plus	Qiagen	1053393	Guanidiniumthiocyanat-Lysepuffer/ Teil des Allprep-Kits
ß-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689-25ML-F	ß-ME ist ein Reduktionsmittel, das RNasen irreversibel denaturiert, indem es Disulfidbindungen reduziert
LME Beads	MP Biomedicals	116914050	Bead
Tube QIAgen TissueLyzer	Qiagen	85300	automatisiertes Probendisruptor-Adapterset
QIAshreddersäule	Qiagen	79654
QIAgen RB Röhrchenhersteller			Mikrozentrifugenröhrchen im Kit
QIAcube und zugehörige Kunststoffe	Qiagen	9001292	automatisiertes DNA/RNA-Aufreinigungsinstrument
DNA-Exitus plus	Applichem	A7089	nicht-enzymatische Dekontaminationslösung
EB Puffer	Qiagen	19086	Elutionspuffer
QIAgility und verwandte Kunststoffartikel	Qiagen	9001532	Roboter-Liquid-Handler
PCR-Wasser	MO BIO	17000-5PRIME
HotMasterMix	Quantabio	2200400
Barcode-Reverse-Primer	Eurofin	Kein Katalog #'s	entworfen und bestellt
96 Well PCR-Platte	USA wissenschaftlich	1402-9708
Tapestation 2200 und zugehörige Kunststoffartikel	Agilent	G2964AA	automatisierter DNA/RNA-Fragmentanalysator
D1000 Reagenzien für die Tapestation	Agilent	5067-5585	Probenpuffer und Leiter sind Teil dieses Kits
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit	Zymo Research	50444470	PCR-Inhibitorentfernung erfolgt gemäß den Anweisungen des Herstellers.
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104	DNA-Aufreinigungskit: Aufreinigung von PCR-Produkten auf Kieselsäuremembranbasis
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Dimethylsulfoxid-basierter Verdünnungspuffer und Farbstoff sind Teil dieses Kits.
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216
NanoDrop	Thermo Fisher		Mikrovolumen-Spektralphotometer
MiSeq 300 V2 Kit	Illumina	15033624/15033626
MiSeq	Illumina	No Catalog #'s	Sequenzer der nächsten Generation