Summary
هذا الأسلوب إدخال التحوير في البطانة للشرايين السباتي الأرانب. الأخذ التحوير يسمح تقييم دور المنتج التحوير في الشرايين طبيعية أو نماذج الأمراض البيولوجية. الأسلوب أيضا مفيدة لقياس النشاط لتسلسل الحمض النووي التنظيمية.
Abstract
والهدف من هذا الأسلوب إدخال التحوير في بطانة شرائح معزولة من كلا الشرايين السباتي المشترك الأرانب. الأسلوب الذي يحقق التنسيق ترانسجينيسيس بطانية انتقائية، مما يسمح لمحقق لتحديد الأدوار البيولوجية المتسلسلات غشائي أعرب وقياس نشاط النسخي المجراة في تسلسل الحمض النووي في الشريان الكبير خلايا بطانية. يستخدم الأسلوب العزلة الجراحية أرنب الشرايين السباتي المشترك وأرتيريوتومي لتسليم ناقلات الأمراض فيروسية معربا عن التحوير في التجويف الشرياني. فترة حضانة قصيرة ناقل في التجويف، مع التطلع اللاحقة لمحتويات التجويف، غير كافية لتحقيق التعبير فعالة ودائمة للتحوير في البطانة، مع عدم توصيل يمكن اكتشافها أو التعبير خارج نطاق الجزء الشرياني معزولة. الأسلوب يسمح تقييم الأنشطة البيولوجية للمنتجات التحوير في الشرايين طبيعية، وفي نماذج لأمراض الأوعية الدموية البشرية، مع تجنب الآثار النظمية التي يمكن أن تسببها أما عن طريق استهداف الجين إيصالها إلى مواقع أخرى (على سبيل المثال. الكبد) أو بواسطة نهج بديل إيصال البنيات الوراثية للبطانة بجرثومة خط ترانسجينيسيس. تطبيق الطريقة يحد من الحاجة إلى طبيب جراح مهرة والتخدير، غرفة مجهزة تجهيزا جيدا للتشغيل، وتكاليف شراء والأرانب الإسكان، والحاجة إلى الخبرة في بناء ناقلات نقل الجينات واستخدام. وتشمل النتائج التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة: التعديلات المتعلقة بالتحوير في هيكل الشرياني، سيلولاريتي، المصفوفة خارج الخلية، أو دالة فاسوموتور؛ زيادات أو انخفاضات في التهاب الشرايين؛ تغييرات في خلايا الأوعية الدموية المبرمج؛ والتقدم أو التخلف العقلي، أو الانحدار من الأمراض مثل فرط تنسج intimal أو تصلب الشرايين. كما يسمح الأسلوب قياس قدرة تسلسل الحمض النووي التنظيمية الأصلي والتركيبية لتغيير التعبير التحوير في خلايا بطانية، تقديم النتائج التي تشمل: مستويات التحوير مرناً، ومستويات البروتين التحوير، ومستويات من التحوير النشاط الأنزيمي.
Introduction
والهدف من هذا الأسلوب إدخال التحوير في البطانة للشرايين السباتي المشترك أرنب. الأخذ التحوير يسمح التقييم البيولوجي دور المنتج التحوير في الشرايين طبيعية، وفي نماذج أرنب من أمراض الشرايين البشرية. يمكن أن تكشف overexpression التحوير في نماذج المرض سواء التحوير (وإلى منتج البروتين) إظهار الوعد كالعوامل العلاجية1،،،من234. إدراج العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة-النيابة في كاسيت التعبير التحوير يمكن تقييم نشاط هذه العناصر في البطانة الشريانية في فيفو5،6. يمكن استخدام المعرفة لنشاط عناصر تنظيمية محددة في رابطة الدول المستقلة-بالنيابة إلى تصميم التعبير نشطة أكثر من أشرطة الكاسيت وسبر آليات لتنظيم الجينات في بطانة الشريان الكبير في فيفو7.
الأرانب نموذجا قيماً للجوانب المختلفة لعلم وظائف الأعضاء البشرية والأوعية الدموية والأمراض. الأرانب بمشاركة العديد من الميزات والأوعية الدموية مع البشر. على سبيل المثال، تتشابه قيم الأساس الدموية وتنظيم مرقئ والتوتر طولية الأوعية الدموية بين الأرانب والبشر8. تكرار نماذج الأرانب أمراض الأوعية الدموية الملامح الرئيسية لكثير من الأمراض البشرية بما في ذلك: تمدد الأوعية الدموية (مماثلة هندسية وخصائص تدفق)9،10،بالتشنج (استجابة مماثلة لمعاملة اللمفاوية)11، و تصلب الشرايين (لويحات intimal مع ميزات مشابهة، بما في ذلك نواة غنية بالخلايا الدهنية والضامة والعضلات الملساء في سقف ليفي)12،13. وبناء على ذلك، تم تطوير نماذج أرنب للعديد من أمراض الأوعية الدموية مثل تجلط الدم، بالتشنج وتمدد الأوعية الدموية، والسكري، وتضيق الأوعية الدموية الاختلاس وتصلب الشرايين8،،من1314، 15،16.
للباحثين اختيار بين نماذج حيوانية لفسيولوجيا الأوعية الدموية والأمراض والارنب مزايا عدة. بالمقارنة مع القوارض، تسمح السفن الأكبر حجماً من الأرانب أسهل الجراحية التلاعب واستخدام الأجهزة اللمفاوية، وكمية أكبر من الأنسجة للقياسات الكمية. الأرانب أقرب بكثير إلى الرئيسات من القوارض17فيلوجينيتيكالي، وزيادة التنوع الوراثي من الأرانب أووتبريد يقارب أفضل التنوع الجيني للبشر. التنوع الوراثي مهم بشكل خاص للدراسات الإكلينيكية، والتي-بالطبيعة هدفها تطوير العلاجات التي يمكن تطبيقها على السكان البشرية المتنوعة وراثيا. كما مع العديد من إذا لم سائر الأنواع النموذجية، هي الجينات أرنب بسهولة استنساخ أو توليفها لأنه قد تم تعيين تسلسل الجينوم أرنب مع تغطية عالية (7.48 س) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. مقارنة مع غيرها من النماذج الحيوانية الكبيرة (مثل الكلاب، والخنازير، أو الأغنام)، الأرانب رخيصة نسبيا لشراء والبيت وأسهل لتولد والتعامل معها. وقد نماذج محددة من أمراض الأوعية الدموية في الأرانب كل المزايا والعيوب الخاصة بهم كنماذج للأمراض البشرية التي خارج نطاق هذه المخطوطة8،،من1218. وينبغي استعراض محقق هذه المزايا والعيوب تحديد ما إذا كان الأرنب أفضل نموذج للإجابة على سؤال تجريبية محددة.
يتيح إدخال تسلسل تنظيمي الحمض الخلوي الصبغي (DNA) في خلايا بطانية في فيفو التحقيق في نشاط هذه التسلسلات في بيئة معقدة والفسيولوجية. الدراسات في المختبر في خلايا بطانية ترانسفيكتيد يمكن أن تكون مفيدة للتقييم الأولى لتسلسل الحمض النووي التنظيمية؛ ومع ذلك، مستويات التعبير في نماذج زراعة الأنسجة في بعض الأحيان لم تستنسخ عند الدراسات المتكررة في فيفو5،،من1920. نظم في المختبر أيضا يمكن أن تكون مفيدة لاستكشاف المسارات الأساسية مما يشير إلى البروتين وفسيولوجيا غشائي فضلا عن الاتصالات بين الخلايا والأوعية الدموية مثقف؛ ومع ذلك، مسارات أكثر تعقيداً أو الشبكات التنظيمية التي تتأثر بالسكان المعقدة من خلايا الأوعية الدموية المجاورة أو المناعي أفضل درس في في فيفو نظام6،20. الأسلوب الموصوفة في هذه الوثيقة توفر منبرا لاستكشاف تنظيم التعبير التحوير في البطانة داخل السياق سفينة سليمة، مع أو بدون مرض. ويسمح النظام في فيفو أيضا التحقيق في الحديث المتبادل الخلوية الفسيولوجية والمرضية وتحديد الاشتراكات في الجهاز المناعي لتنظيم التعبير الجيني6.
ترانسجينيسيس الجرثومية-الخط (لا سيما في الفئران) نهج بديل لتوجيه التعبير التحوير إلى خلايا بطانية. هذا النهج يمكن أن توفر التعبير التحوير مدى الحياة، مع استهداف غشائي توسط المروج محددة أو مناطق تنظيمية21،22. بيد أن جيل الفئران المعدلة وراثيا مضيعة للوقت ومكلفة، يجب اختبار عدة أسطر المعدلة وراثيا غالباً لضمان استهداف التحوير لنوع الخلايا المطلوب وتحقيق مستويات التعبير الملائم التحوير، والتجريبية يمكن أن تكون النتائج في نظم مورين تعتمد على السلالة. مورين نماذج معدلة وراثيا مع المتسلسلات غشائي المستهدفة لديها العديد من المزايا: ليست هناك حاجة لإجراء عملية جراحية على كل الحيوانات التجريبية بغية تحقيق ترانسجينيسيس، ويمكن أن يولد الفئران التجريبية مع العديدة الأخرى المتاحة من الفئران المعدلة وراثيا في لاختبار التفاعلات الجينية والمظهرية، وهناك تشكيلة واسعة من الأجسام المضادة التي تتفاعل مع البروتينات مورين، تيسير توصيف لتعمل. ومع ذلك، استهداف المتسلسلات للبطانة عبر خط الجرثومية عادة النتائج في التعبير التحوير في جميع أنحاء المفرج،22 مما يجعل من الصعب تحديد الموقع الذي يتصرف بالمنتج التحوير. وهذا ينطبق بشكل خاص عندما يفرز المنتج التحوير، لمنتج التحوير يفرز من خلايا بطانية في جميع أنحاء المفرج يمكن أن يكون النشاط البيولوجي في أي عدد من المواقع داخل حيوان. على الرغم من أن الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة يتطلب الخبرة التقنية والمرافق المتخصصة، يمكن أن يكون أقل استهلاكاً للوقت وأقل تكلفة من وضع خط ماوس الخاصة ببطانية المحورة وراثيا. أنها تسمح لتقييم وظيفة البروتين بشكل انتقائي في خلايا بطانية لمقطع من شريان كبير، وأنه يسمح باستخدام السباتي المشترك contralateral كعنصر تحكم مقترن (القضاء على العوامل النظامية التي يمكن أن تختلف بين التجريبية الحيوانات--على سبيل المثال، ضغط الدم أو مستويات الكوليسترول في الدم-كمتغيرات غير المنضبط).
العلاج الجيني نهج واعدة لعلاج أمراض الأوعية الدموية، الأمراض المزمنة خاصة، نظراً لأن تطبيق واحد يمكن أن يوفر التعبير المستمر أو ربما مدى الحياة من الجينات العلاجية23. تم استكشاف الوعد العلاجية للعلاج الجيني في نماذج حيوانية لنقل الجينات الجسدية، وكثيراً ما تستهدف الكبد24،25، التي تعد هدفا سهلاً نسبيا نظراً للعديد من النواقل الفيروسية المنقولة بالدم هيباتوتروبيك. ومع ذلك، يكون لها تأثير على أمراض الأوعية الدموية، يجب أن يحقق العلاج الجيني يستهدف الكبد overexpression المنهجي للبروتينات. وهذا يتطلب عادة جرعات كبيرة من ناقلات الأمراض، التي يمكن أن تكون سامة أو قاتلة حتى26. وعلاوة على ذلك، زادت مستويات المنهجية من البروتين زيادة مخاطر الآثار الجانبية قبالة المستهدفة، التي يمكن أن تؤدي إلى تعقيد أو حتى يحجب تفسير النتائج التجريبية. العلاج الجيني المحلية تستهدف البطانة الوعائية كما هو موضح في هذه المخطوطة يمكن تجنب الآثار الجانبية الجهازية للمتجهات التي غرست لا على نطاق واسع خارج الجزء الشرياني ترانسدوسيد، وآثار الأوعية الدموية المحلية يمكن أن يتحقق دون التغيرات في مستويات البلازما النظمية للبروتين. 27 بالإضافة إلى ذلك، يلزم كمية أقل بكثير من ناقل ترانسدوسي جزء الشرياني مما هو ضروري لتحقيق توصيل كبدي قوية. أبلغ إلى الانخفاض مع مرور الوقت، ربما بسبب دوران الخلية، التي تتطلب الجرعات المتكررة إذا كان التعبير التحوير رفيع المستوى الإبقاء على التعبير التحوير من الكبد. 28 وفي المقابل، يوفر معدل دوران منخفض البطانة تعبير مستقر للأرانب تشاو التي تغذيها 48 أسبوعا على الأقل وفي الآفات تصلب الشرايين من الكوليسترول التي تتغذى الأرانب 24 أسبوعا على الأقل. 1 , 27
لتحديد ما إذا كان هذا الأسلوب لنقل الجينات لأرنب البطانة السباتي المشترك المناسب، ينبغي النظر في مزايا وعيوب (الجدول 1) في سياق أهداف بحثية محددة. وتشمل مزايا هذا الأسلوب: الأرانب أووتبريد تمثيلاً أفضل للتنوع الوراثي البشري أكثر من الفئران الفطرية (مهم للعمل السريري)؛ تقديم الأرانب السفن الأكبر حجماً للتلاعب أسهل وأكثر الأنسجة للتحليل؛ الأسلوب يمكن تحقيق التعبير التحوير مستهدفة البطانة بسرعة أكبر بكثير مما يفعل الجرثومية-خط غشائي الاستهداف في الفئران المحورة وراثيا؛ الجرعة ناقلات يمكن تعديلها بسهولة لمستويات متغير نموذج التحوير التعبير؛ يمكن أن يحقق في عمليات محددة لبطانة الشريان الكبيرة؛ ويسمح ترانسجينيسيس الأوعية الدموية المحلية السباتي المعاكس في نفس الحيوان لاستخدامه كعنصر تحكم، القضاء على العوامل النظامية كمتغيرات غير المنضبط. من عيوبها: المرافق الخاصة والخبرات المطلوبة؛ خلفيات المعدلة جينياً أقل للتجربة متوفرة في الأرانب من الفئران؛ وهناك تشكيلة واسعة النطاق أقل من الأجسام المضادة لأرنب مقابل البروتينات الماوس (بالنسبة إيمونوديتيكشن البروتين التحوير ومولدات المضادات الأخرى التي قد تكون مهمة في تفسير النتائج التجريبية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها جامعة مكتب واشنطن للرفق بالحيوان ورعاية الحيوان المؤسسية المرتبطة بها واستخدام اللجنة (إياكوك)، وأكملت وفقا والامتثال لكافة ذات الصلة التنظيمية والمؤسسية المبادئ التوجيهية.
ملاحظة: يتم نقل الجينات لأرنب الشرايين السباتي المشترك على الأرانب بجراح بمساعدة طبيب التخدير أو مساعد.
1. نقل الجينات لأرنب الشرايين السباتي المشترك: مرحلة ما قبل التشغيل
- تخدير الأرنب. وزن الأرنب. الجمع بين الكيتامين 30 ملغ/كغ و xylazine 2 مغ/كغ في محقن. حقن الكيتامين/xylazine العضلي (IM) في العضلات باراسبينوس للحث على التخدير.
- أثناء انتظار الأرنب لتصبح تخديره، إعداد غرفة التحضير والجداول غرفة العمليات (أو).
- في غرفة أو إعداد: ضع مرهم العيون والتصحيح شيفتشنكو متناول إعداد الجدول؛ إعداد مقص الشعر وفراغ لحلق الأرنب في الرقبة والإذن؛ جانبا جهاز pad الإعدادية الكحول وقسطرة 24 × ¾ "، منفذ الحقن والشريط الجراحي لتأمين خط الحقن في الوريد (رابعا) في الوريد الإذن للأرنب.
- في أو: إعداد معدات الرصد وموضع التحقيقات [رسم القلب (EKG)، تشبع الأكسجين (SpO2)، درجة الحرارة] على الجدول أو؛ تحضير الأكسجين وإيسوفلوراني؛ ربط قطاع شاش على قناع الوجه تأمينه للأرانب ووضع القناع على رأسه نهاية الجدول.
ملاحظة: يجب أن يكون شرائط الشاش مرتبطة في قناع الوجه ذيول 2 من حوالي 45 سم. - قم بتشغيل بطانية المياه الاحترار على الجدول أو. على رأس الماء بطانية، ضع منشفة تدحرجت لدعم الرقبة وصفيحة قطب المشتتة (في وقت لاحق وضع تحت الظهر أرنب).
- إعداد المضخة "الرابعة أو" مع 100 مل كيس الرابع المالحة مع إبرة ز 18-19 تعلق وتعيين معدل التدفق إلى 10 مل/ساعة للكيلو.
- الجمع بين 1 مل ليدوكائين هيدروكلورايد (حل الأسهم 2%) و 1 مل بوبيفيكيني HCl (0.5% محلول الأسهم) في حقنه، لاستخدامها كمسكن محلي.
- عندما يتم تخديره أرنب تماما، إعداد الأرانب لإجراء عملية جراحية.
ملاحظة: التحقق من عدم وجود منعكس دواسة (رشة أخمص القدمين؛ والبحث عن انسحاب أطرافهم) لضمان عمق مخدر، ومواصلة رصد المعاكسة دواسة طوال عملية جراحية.- تطبيق مرهم العيون إلى العيون. إزالة البراز من المستقيم للأرنب بالضغط بأصابع القفاز في أسفل البطن الأمامي (أعلاه المستقيم) والأصابع تتحرك نحو فتحه الشرج. وهذا سيسمح لموضع لاحق من مجس درجة حرارة المستقيم.
- حلق الرقبة الأمامية من الشق القصية إلى حافة الفك السفلي أثناء استخدام فراغ لإبقاء المنطقة نظيفة. كما يحلق كلتا الأذنين للموضع الرابع والمرفق التصحيح شيفتشنكو، ويحلق إصبع القدم اليسرى الأوسط خلفي للتحقيق pulse oximetry.
ملاحظة: البروتوكول يفترض أن الجراح على الجانب الأيمن للأرنب للإجراء بأكمله. إذا كان الإعداد أو يضع الجراح على الجانب الآخر، عكس الجانبين في هذه الخطوة للحفاظ على الأسلاك والرابع العكس من الجراح. وينبغي أيضا تبديل الجانبين من الخطوات المستقبلية حسب الحاجة. - مسح الإذن اليسرى مع منصة الكحول الإعدادية، ضع قسطرة الرابع 24 ز الوريد الإذن اليسرى وكاب مع منفذ الحقن والشريط القسطرة/المنفذ إلى الإذن للأرنب لضمان الحصول عليها. تطبيق تصحيح شيفتشنكو (25 ميكروغرام/h) لأرنب الإذن اليمنى.
- نقل الأرنب إلى أو ومكان ضعيف على طاولة العمليات بمنشفة دعم الرقبة تدحرجت تحت الرقبة الأرنب أسفل الرأس. بلطف تمديد الرقبة أرنب حتى يكون مستقيم وأفقي تقريبا.
- ربط الأرنب حتى قناع الوجه مع س2 في الساعة 1 لتر في الدقيقة، وبدء تشغيل إدارة إيسوفلوراني. تأمين القناع بالتفاف نهايات قطاع شاش مرتبطة بالقناع حول دعم الرقبة منشفة تحت الأرنب. ضبط إيسوفلوراني (عادة 1-2 ٪) حسب الحاجة (على أساس معدل ضربات القلب ومعدل التنفس، ومنعكس دواسة) للمحافظة على التخدير المناسب لما تبقى من هذا الإجراء.
- ضمان أن يتم توسيط صفيحة القطب المشتتة تحت ظهره الأرنب. مكان درجة الحرارة ونبضي تحقيقات وتنطبق جهاز رسم القلب يؤدي إلى الأرنب.
- ربط المالحة الرابع إلى منفذ القسطرة في الإذن للأرنب، بدءاً مضخة المالحة في 10 مل/ساعة للكيلو.
ملاحظة: بعد ح 1، يمكن تخفيض المضخة المالحة إلى 5 مل/ساعة للكيلو. - تقييد الأرجل الأمامية للأرنب بربطهم فضفاضة للجدول. بشكل اختياري، ضع طاولة بلاستيكية صغيرة على الأرنب لحماية الأرانب من التعرض لضغط الصدر/البطن من الجراح يميل على الصدر/البطن أرنب.
ملاحظة: الجدول الصغيرة قد يساعد في منع انكفاء قسري لمحتويات البطن. - حقن 2 مل ليدوكائين معدّة مسبقاً (2% الأسهم)/bupivacaine (0.5% الأسهم) (ميكس 50/50) تحت الجلد على طول خط الشق العنق المخططة للتخدير الموضعي.
- واسمحوا المساعد إعداد موقع الجراحية مع 3 يدعك الكلورهيكسيدين والكحول، ومن ثم رذاذ مع تدين بالتناوب. فرك، ثوب، والقفازات، اتباع الأسلوب السليم العقيم.
ملاحظة: ينبغي أن يكون الجراح ارتداء 2 × الموازين الجراحية المعونة مع النصف الأول من الجراحة. أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة من أهمية حيوية للحفاظ على العقم الجراح وميدان العمليات الجراحية. مساعد فقط ينبغي التعامل مع أية عناصر غير معقمة، ويجب تمريرها إلى الجراح مواد تعقيم أو وضعها على الجدول صك رايات أسيبتيكالي. مناشف معقمة يمكن أن يستخدمها الجراح للحفاظ على العقم مع التلاعب بمعدات غير معقمة مثل المجهر.
2-بقاء جراحة (نقل الجينات)
- إعداد الصكوك وميدان العقيمة.
- واسمحوا المساعد فتح حزمة ثني معقمة تحتوي على ثني جدول ثني ورقة واحدة للأرنب، والمناشف عدة. أسيبتيكالي نقل الأصناف إلى الجراح.
- ثني الجدول الصك. المكان 6 مناشف معقمة والورقة ثني على الجدول رايات.
- مع المناشف 4، ثني الرقبة للأرنب، تاركاً فقط موقع الجراحية مكشوف (حوالي 4 × 10 سم). وتكمن ثني الورقة على الأرنب.
- واسمحوا المساعد فتح حزمة أداة معقمة ووضع أسيبتيكالي على الجدول الصك.
- واسمحوا المساعد فتح المعدات التالية ووضع أسيبتيكالي على الجدول الصك أو اليد للجراح: ثلاثة 1 مل المحاقن (وابرة واحدة إذا لم يتم تحميل المحاقن الفعل مع الإبر) محقنة 20 مل واحد، واحد ز 21 إبرة، واحد إبرة ز 19، 3-0 بوليجليكوليك خياطة حمض (PGA) وخياطة الشبكة 5-0، 7-0 البوليبروبيلين خياطة واثنين 24 ز الرابع-القسطرة.
- تأمين كابل اليكتروكوتيري لثني أرنب باستخدام 7.25 "الملقط كانتروويتز وقطره ثم السد نهاية الخروج من الجدول. واسمحوا المساعد قم بتوصيل الكبل وحدة كهربية وتشغيل الطاقة.
- ملء المحاقن 20 مل مع المالحة العقيمة، المستمدة من حقيبة الرابع أو قنينة عقدت قبل المساعد. استخدام هذا المحلول الملحي حسب الحاجة للحفاظ على الأنسجة المعرضة رطبة أثناء الإجراء.
- إعداد حقنه 1 مل واحد مع 1 مل من "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو (دميم، للغسيل الشريان). ويلزم لكل الشريان السباتي الذي سوف ترانسدوسيد، 0.35 مل فيروس المخفف. إذا تم استخدام نفس الفيروس لكلا الجانبين، إعداد واحد 1 مل المحاقن مع الفيروس المخفف في دميم حجم 0.7 مل. إذا تلقي الجانبين مختلف أنواع مختلفة من الفيروسات [على سبيل المثال "Null" فيروس تحكم على جانب واحد]، إعداد اثنين 1 مل المحاقن، كل مع 0.35 مل من محلول الفيروس. هو تركيز الفيروس إتش تعتمد على مساعد، 2 × 1011 الجسيمات الفيروسية (vp)/مل.
ملاحظة: تتيح مساعد إعداد الفيروس. ويضع الجراح تعليق دميم والفيروسات في المحاقن المعقمة. - قطع حفرة في ثني. ينبغي أن يكون حجم الحفرة بنفس حجم الموقع الجراحية في الرقبة للأرنب التي صيغت بواسطة المناشف في خطوة 2.1.3. المشبك زوايا الثقب في ثني الورقة للمناشف الكامنة التي هي كاسية الرقبة للأرنب مع المشابك منشفة.
- عزل الشرايين السباتي المشترك.
ملاحظة: يجب استخدام 2 × الموازين الجراحية لهذا الجزء.- قطع الجلد مع اليكتروكوتيري على طول خط الوسط تمتد حوالي 7-9 سم cranially تجاه الفك السفلي والمشبك فتح الجلد مع المشابك منشفة.
- جعل قطع أفقي قصير عن طريق اللفافة مع اليكتروكوتيري في نهاية والذيلية. قم بإدراج مقص كبير في الخفض وصراحة تشريح اللفافة على طول كامل خط الوسط. قص اللفافة تشريح أسفل خط الوسط مع electrocautery.
- مع مقص تشريح الصغيرة، تشريح بين العضلات على شكل V (ستيرنوسيفاليك العضلات) والعضلات ستيرنوهيويد عبر القصبة الهوائية، لفضح الشرايين السباتي المشترك، بدءاً من الجانب الأيمن.
- تشريح الشريان السباتي المشترك حق الحرة من الأنسجة، وتقسيم جميع الفروع، من قاعدة العنق كودالي إلى معبر للعصب البلعوم cranially المحيطة. استخدام حلقات السيليكون الجراحي للمعونة في تراجعه الشريان أثناء التشريح.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإزعاج على العصب المبهم الذي يعمل في موازاة السباتي المشترك، أو أصغر الأعصاب التي تتقاطع السباتي المشترك. - سد أي فروع كبيرة نزوله الشريان السباتي المشترك (1-2 كل جانب) مع خيوط الحرير 5-0 قبل قطع الفرع ديستالي لتحرير قطعة 4-5 سم السباتي. قص الفروع الواصلة 1-2 مم بعيداً عن إدراك التعادل حيث أن التعادل لا تنزلق قبالة.
- كرر تشريح على الجانب الأيسر (الخطوات 2.2.3-2.2.5).
- ضخ ناقلات في الشرايين السباتي المشترك.
ملاحظة: يتم استخدام مجهر جراحي (16 س) حسب الحاجة لأداء أرتيريوتومي، غرس ناقلات/الحل، وإصلاح أرتيريوتومي.- واسمحوا المساعد إزالة الصفائحي الجراحية من الجراح وتحريك المجهر الجراحي في الموقف. ثني منشفة عقيمة على المجهر للسماح بالتلاعب بالمجهر دون تلويث الحقل العقيمة.
- حقن الهيبارين [150 وحدة دولية (وحدة دولية) كغ] في القسطرة الرابع ومطاردة مع 10 مل من المحلول الملحي.
- العودة إلى السباتي المشترك حق معزولة، وضع العلاقات الحرير اثنين حول الجزء منتصف الجزء السباتي تعبئة وقرانهما تراكم واحد على كل-دون تشديد لهم.
- ثني الإبرة ز 19 فقط فوق المجسم مشطوف الحواف لحوالي 80 درجة باستخدام برنامج التشغيل إبرة كبيرة (لا ينحني الشطب؛ الشكل 1).
- المشبك الشريان في كل نهاية الجزء المعزول مع مقاطع الأوعية الدموية، وضع القصاصة الجمجمة أولاً للسماح لسد الشريان، وثم وضع القصاصة والذيلية.
- ثقب الشريان السباتي المشترك مع الإبرة ز 19 بنت الجمجمة فقط لمقطع الأوعية الدموية والذيلية، مع الحرص على عدم ثقب الجدران الخلفية أو الجانبية. دفع طرف الإبرة في التجويف وسحب مرتين للتأكد من أرتيريوتومي تماما يخترق جدار الشريان. بعناية ثم تسحب الإبرة.
ملاحظات: من المهم إنشاء أرتيريوتومي التي تخترق جميع طبقات جدار الشريان نظيفة ولا تشريح جدار الشريان (عن طريق تمرير محوريا من خلال الغلالة ووسائط الإعلام). لتحقيق هذا الهدف، ينبغي أن ثقب في السباتي مع طرف الإبرة في وضع أقرب ما يمكن إلى زاوية 90° ضد الجدار الشريان (الشكل 1). وبمساعدة من ثقب السباتي بزاوية 90 درجة بالاستيلاء على الشريان الغلالة مع الملقط غرامة ورفع سطح الشريان بلطف أثناء الضغط غيض إبرة والذيلية فقط لرفع درجة. هذه المناورة يقلل أيضا من خطر ضرب الجدار الخلفي (الشكل 1). - تتكشف وحفنة-يصل عدة منصات الشاش إلى عش لإرساء المحاقن المستخدمة للحقن. وضع العش على صدره للأرنب والذيلية للشق.
- وضع رابعا-قسطرة على حقنه تحتوي على دميم فقط (لا ضيقة جداً) وينحني القسطرة ~ 4 مم من الحافة حتى أن يحمل الانحناء في حوالي 75 درجة بعد إصدارها.
- إدراج رابعا-القسطرة في الشريان الذي يصل إلى نقطة الانحناء وتغسل كل الدم من الشريان مع دميم (~ 0.25 مل × 2). لكل غسل، سد الشريان مع دميم، ومن ثم إزالة دميم المتبقية من التجويف السفينة عن طريق الضغط بلطف على الشريان مع إصبع القفاز، ابتداء من مجرد والذيلية للقصاصة الجمجمة والأوعية الدموية. الحفاظ على ضغط لطيف، حرك الإصبع من الجمجمة إلى والذيلية. وسوف تغسل محتويات لومينال عبر أرتيريوتومي.
- تبقى القسطرة في الشريان وتبادل المحاقن دميم للمحاقن التي تحتوي على الفيروسات الحل. تأكد من أن الهواء لا يدخل القسطرة.
- الشريحة الروابط الحرير أسفل الشريان حيث أن تطويق الشريان في موقع طرف القسطرة، ولكنها لا تشديد لهم.
- يبث 0.03 مل من الفيروسات الحل دفع دميم المتبقية خارج القسطرة ثم قم بإفراغ الشريان. طيها بإزالة جميع السوائل مرة أخرى من التجويف بأصبع، الجمجمة إلى والذيلية (كما هو الحال في الخطوة 2.3.9).
- توثيق العلاقات بين حول طرف القسطرة لإغلاق التجويف. يبث الحل الفيروس (~ 0.25 مل؛ 2 × 1011 نائب الرئيس/مليلتر بالنسبة إتش) بضغط المكبس حقنه بلطف حتى الشريان هو منتفخة للعيار الفسيولوجية.
ملاحظة: من المهم أن الشريان يتسع للعيار الفسيولوجية وتظل منتفخة أثناء ضخ الفيروسات. إذا لم يكن الأمر كذلك، درجة نقل الجينات سوف تنخفض بشكل كبير. - وضع المحاقن بلطف على العش شاش.
- المكان خياطة البوليبروبيلين 7-0 في الغلالة السباتي المشترك والذيلية مجرد قصاصة الجمجمة والأوعية الدموية وضع علامة على حدود الجمجمة لتوصيل الجينات
- بعد أن تم حل الذي يحتوي على الفيروس في تجويف الشريان لمدة 20 دقيقة، إزالة المحاقن التي تحتوي على الفيروسات والاستعاضة عنها حقنه فارغة. نضح الحل الذي يحتوي على الفيروس بلطف حتى يطوي السفينة وإزالة المحاقن. قص أو التراجع عن العلاقات بين الحرير وإزالة القسطرة بلطف.
ملاحظة: قطع العلاقات الإيدز قصيرة جداً في إزالتها. إزالة القسطرة بعناية لتجنب إلحاق أضرار بالبطانة السباتي. - استخدام المجهر الجراحي، أغلق أرتيريوتومي مع بولي بروبلين 7-0 باستخدام نمط X (الشكل 2).
- قم بتمرير أول تدخل في الجهة السفلي-اليمنى من أرتيريوتومي وتخرج السفينة في الأسفل اليسار. ثم عبر فتح وجعل مرور ثانية من أعلى اليمين إلى أعلى اليسار.
- قبل ربط أسفل الخياطة، طرد الشريان بإيجاز شديد الإفراج عن القصاصة الجمجمة والأوعية الدموية. سوف تدفق الدم من أرتيريوتومي عندما يتم تحرير القصاصة، إزالة الهواء والفيروسات المتبقية من التجويف.
- سحب خياطة لإغلاق أرتيريوتومي بلطف والتعادل خياطة مع 2 ساحة عقده.
ملاحظة: سيؤدي سحب الخياطة ضيقة جداً تجميع الأنسجة التي سوف تخل بالتدفق، ويزيد من خطر تجلط الدم، وتغيير التدفق التي يمكن أن تكون متغيراً هاما غير المنضبط في نماذج المرض.
- الإفراج عن القصاصة الجمجمة والأوعية الدموية، ومن ثم مقطع الأوعية الدموية والذيلية استخدام الضغط الخفيف مع شاش لإيقاف أي نزيف. إذا استمر النزيف، مواصلة الضغط لمدة 1-2 دقيقة. إذا كان إغلاق بشكل صحيح أرتيريوتومي، النزيف يتوقف دائماً ضمن هذا الإطار الزمني.
- واسمحوا المساعد حقن البوبرينورفين [0.02 مغ/كغ؛ تحت الجلد (ميدان)] في هذا الوقت لتوفير التسكين بعد العملية الجراحية حتى تصبح مستويات البلازما شيفتشنكو العلاجية.
ملاحظة: حقنه البوبرينورفين ثانية (0.02 مغ/كغ؛ ميدان) قد يلزم ح 6 بعد الحقن الأول للحفاظ على التسكين حتى تصبح مستويات البلازما شيفتشنكو العلاجية. - كرر الفيروس ضخ البروتوكول على الجانب الأيسر بعد الخطوات 2.3.2-2.3.19.
- إغلاق الجرح
- استخدام خياطة الشبكة 5-0 لإغلاق اللفافة خط الوسط مع خياطة مستمرة.
- مع خياطة الشبكة 3-0، إغلاق الجلد مع نمط الأدمة استخدام عقده مدفونة في كلا طرفي.
- التعافي بعد العمليات الجراحية وتنظيف.
ملاحظة: الأرنب يجب رصدها بشكل مستمر لدرجة حرارة الجسم والأوكسجين مناسبة بينما يتعافى من التخدير. ينبغي أن الانتعاش في بيئة هادئة وهادئ.- إيقاف تدفق isoflurane والأكسجين وإزالة قناع الوجه من الأرانب.
- نزع من الخطاف الرابع السوائل ولكن مغادرة الميناء الرابع في مكان لحالات الطوارئ رابعا الوصول.
- تأخذ الأرنب في مجال الإنعاش وتقع على جانبه في قفص مع الاحترار بطانية مياه قيد التشغيل (أو اختيارياً سخان Bair Hugger).
- تعطي س2 بقناع حتى SpO2 مستقر.
- فلاسترداد الأرنب في قفص، التقليب فإنه على الجانب الآخر كل 15 دقيقة، حتى يمكن الجلوس على رجليه الخلفيتين الأرنب والتحرك.
- عندما يكون الأرنب المتنقلة، وإزالة الرابع من الإذن قبل العودة إلى القفص.
ملاحظة: عدم عودة الأرنب إلى شركة الحيوانات الأخرى إلا أنه هو تعافي تماما من التخدير.
- التصرف بأي شيء كان على اتصال مع الناقل أو كان في ميدان المنطوق التالية واقية مناسبة والأدوات الحادة، والنفايات، البروتوكولات.
3. نقل الجينات لأرنب الشرايين السباتي المشترك: "الرعاية" اللاحقة من المنطوق
- تقييم الحالة العامة للأرنب يوميا بعد الجراحة، والتحقق من التئام، دليل على العدوى، الشهية، والتنفس، وعلامات من الألم.
- التحقق من موقف الإذن للأرنب (آذان أسفل يمكن أن يكون علامة للألم أو المعاناة، خاصة عندما يقترن مظهر غير مرتب). تحقق من أن يظل الأرنب متحركة ونشطة. فحص الأرنب للتنفس الطبيعي دون الصرير. تحقق من أن الجرح نظيفة وجافة وسليمة. فحص الأرنب لدرجة حرارة جسم طبيعية. التشاور مع الخدمات البيطرية إذا لم يكن الأرنب التنفس متحركة ونشطة، مع درجة حرارة الجسم العادية، مظهر أنيق، وجرح نظيف، وعادي.
- الاختيار لتناول الطعام العادي وأدلة جديدة البراز والبول.
ملاحظة: قد تكون انخفضت عقب الجراحة تناول الطعام، ولكن ينبغي أن تعود إلى طبيعتها في غضون أيام 2؛ توفير الأغذية التكميلية حسب الحاجة.
- قم بإزالة التصحيح شيفتشنكو بعد العمليات الجراحية في اليوم 3.
ملاحظة: يمكن أن تدار البوبرينورفين حسب الحاجة للألم بعد العمليات الجراحية التي لا يديرها التصحيح شيفتشنكو، أو في حالة إزالة التصحيح شيفتشنكو مبكرا.
4-محطة حصاد جراحة: مرحلة ما قبل التشغيل
- تخدير الأرنب. انظر الفرعين 1.3 و 1.3.5 فيما يتعلق بالإنجاز والصيانة للتخدير.
- وزن الأرنب. الجمع بين الكيتامين 30 ملغ/كغ و xylazine 2 مغ/كغ في محقن. حقن الكيتامين/xylazine إيم في العضلات باراسبينوس للحث على التخدير.
- إعداد غرفة التحضير واو الجداول أثناء انتظار الأرنب تصبح تخديره.
- في غرفة أو إعداد: إعداد مقص الشعر وفراغ لحلق الرقبة والإذن للأرنب.
- في غرفة العمليات: إعداد معدات الرصد ووضع المسابر (SpO2، درجة الحرارة) على الجدول أو؛ تحضير الأكسجين وإيسوفلوراني؛ ربط شريط من شاش على قناع الوجه تأمينه للأرانب ووضع القناع على رأسه نهاية الجدول.
ملاحظة: يجب أن يكون شرائط الشاش مرتبطة في فاسيماسك ذيول 2 من حوالي 45 سم. - قم بتشغيل الاحترار بطانية المياه في الجدول أو. فوق بطانية المياه، ضع منشفة تدحرجت لدعم الرقبة وصفيحة قطب المشتتة (في وقت لاحق وضع تحت الظهر أرنب).
- الجمع بين 1 مل ليدوكائين هيدروكلورايد (الأوراق المالية 2%) و 1 مل بوبيفيكيني HCl (0.5% الأسهم) (ميكس 50/50) في حقنه كمسكن محلي.
- عندما يتم تخديره الأرنب تماما، إعداد الأرانب لإجراء عملية جراحية.
- قم بإزالة البراز من المستقيم، كما هو موضح في 1.3.1، للسماح لموضع لاحق تحقيق درجة الحرارة.
- يحلق الأرنب من الشق القصية إلى زاوية الفك السفلي أثناء استخدام فراغ لإبقاء المنطقة نظيفة. كما حلق إصبع الأوسط الخلفي الأيسر للتحقيق pulse oximetry.
ملاحظة: البروتوكول يفترض أن الجراح على الجانب الأيمن للأرنب. إذا كان سيتم وضع برنامج الإعداد أو الجراح على الجانب الآخر، عكس الجانبين في هذه الخطوة للحفاظ على الأسلاك مقابل الجراح. وينبغي أيضا تبديل الجانبين من الخطوات المستقبلية حسب الحاجة. - نقل الأرنب إلى أو ومكان ضعيف على طاولة العمليات بمنشفة دعم الرقبة تدحرجت تحت الرقبة الأرنب أسفل الرأس. بلطف تمديد الرقبة أرنب حتى يكون مستقيم وأفقي تقريبا.
- ربط الأرنب حتى قناع الوجه مع س2 في الساعة 1 لتر في الدقيقة، وبدء تشغيل إدارة إيسوفلوراني. تأمين القناع بالتفاف نهايات قطاع شاش مرتبطة بالقناع حول دعم الرقبة منشفة تحت الأرنب. ضبط إيسوفلوراني (عادة 1-2 ٪) حسب الحاجة للمحافظة على التخدير المناسب لما تبقى من هذا الإجراء.
- كفالة يتم توسيط صفيحة القطب المشتتة تحت مرة أخرى أرنب. وضع مجسات درجة الحرارة ونبضي.
- تقييد الأرجل الأمامية للأرنب بربطهم فضفاضة للجدول.
ملاحظة: ضع اختيارياً، طاولة بلاستيكية صغيرة فوق الأرانب لحماية الأرانب من التعرض لضغط الصدر/البطن من الجراح يميل على الصدر/البطن أرنب. والهدف هنا منع انكفاء قسري لمحتويات البطن. - حقن 2 مل يدوكائين (2% حل الأسهم)/bupivacaine (0.5% محلول الأسهم) (50/50 مزيج؛ ومن الخطوة 2، 4) تحت الجلد على طول خط الشق العنق المخططة للتخدير الموضعي.
- رش الموقع الجراحي مع تدين. وضع قفازات نظيفة لإجراء العمليات الجراحية.
5-محطة جراحة (سفينة الحصاد)
- إعداد الصكوك والعمليات الجراحية الميدانية.
- فتح حزمة ثني نظيف يحتوي على ثني الجدول وثني ورقة واحدة للأرنب. ثني الجدول الصك.
- فتح حزمة الأداة ومكان على الجدول الصك وترتيب الصكوك. مكان المعدات التالية على الجدول الصك: محقنة 20 مل واحد، وواحد ز 21 إبرة.
- تأمين كابل اليكتروكوتيري لثني أرنب باستخدام 7.25 "الملقط كانتروويتز. توصيل وحدة كهربية وقم بتشغيله.
- ملء المحاقن 20 مل مع المالحة العقيمة. استخدام هذا المحلول الملحي حسب الحاجة للحفاظ على الأنسجة المعرضة رطبة أثناء الإجراء.
- ضع ثني الورقة على الأرنب وقطع حفرة في ثني على موقع الجراحية في الرقبة أرنب. المشبك زوايا ثقب في مكان للجلد للأرنب مع المشابك منشفة.
- عزل الشرايين السباتي المشترك.
ملاحظة: يجب استخدام 2 × الموازين الجراحية لهذا الجزء.- قطع الجلد مع اليكتروكوتيري على طول خط الوسط تمتد حوالي 7-9 سم cranially نحو الجلد الفك السفلي والمشبك مفتوحة مع المشابك منشفة.
ملاحظة: إذا كان الحصاد سوى بضعة أيام بعد الجراحة السابقة، لا حاجة اليكتروكوتيري. فقط قطع خياطة الجروح ولطف سحب فتح الشق من الجراحة السابقة. - جعل قطع أفقي قصير عن طريق اللفافة مع اليكتروكاوتيري في نهاية والذيلية. قم بإدراج مقص كبير في الخفض وصراحة تشريح اللفافة على طول خط الوسط أكمله. قص اللفافة تشريح أسفل خط الوسط مع اليكتروكوتيري.
- مع مقص تشريح الصغيرة، تشريح بين العضلات على شكل V (ستيرنوسيفاليك العضلات) والعضلات ستيرنوهيويد عبر القصبة الهوائية، عزل الشرايين السباتي المشترك، بدءاً من الجانب الأيمن.
- تشريح الشريان الأيمن خال من المحيطة الأنسجة من قاعدة العنق كودالي إلى معبر للعصب البلعوم cranially. استخدام حلقات السيليكون الجراحي للمعونة في تراجعه الشريان أثناء التشريح.
- كرر تشريح على الجانب الأيسر (الخطوات 5.2.3-5.2.4).
- مع 3-0 خياطة حرير، سد الشريان السباتي المشترك الجمجمة إلى الجزء الذي كان يملؤه المتجهات (استخدام خياطة أدفينتيتيال التي توضع في أول عملية جراحية لتحديد مدى ضخ ناقلات الجمجمة. ثم سد السباتي والذيلية إلى أرتيريوتومي تم إصلاحه.
- المكوس الجزء السباتي بين ليجيشنز، ومسح التجويف مع المياه المالحة. تقليم بعيداً الأنسجة أدفينتيتيال الزائدة من السفينة وقص الجزء السباتي إلى أجزاء أصغر لمختلف التحليلات نقطة النهاية (explant علم الأنسجة، الحمض النووي الريبي (الرنا)، البروتين، والثقافة، إلخ.).
- حقن 1 مل الرابع بيوثاناسيا euthanize، وتأكيد القتل الرحيم الأرنب.
- قطع الجلد مع اليكتروكوتيري على طول خط الوسط تمتد حوالي 7-9 سم cranially نحو الجلد الفك السفلي والمشبك مفتوحة مع المشابك منشفة.
- التصرف بأي شيء كان على اتصال مع ناقل أو كان في ميدان المنطوق التالية واقية مناسبة والأدوات الحادة، والنفايات، البروتوكولات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتنفيذ هذا الأسلوب بكل ثقة، التجارب الأولية اللازمة لإثبات أن المشغل يحقق نقل الجينات تتسم بالكفاءة واستنساخه، مع التعبير التحوير في خلايا بطانية لومينال أساسا. في تجربتنا، هذا هو تقييم أكثر سهولة باستخدام موجه الذي يعرب عن β-جالاكتوسيداسي. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (س-غال) تلطيخ شرائح السباتي المشترك إزالة 3 أيام بعد ضخ ناقلات الأمراض، فضلا عن قياس مرناً β-جالاكتوسيداسي (الرنا الرسول) مع كمية النسخ العكسي بوليميريز سلسلة رد فعل (qRT-PCR)، سيكشف عن الكفاءة، وإمكانية تكرار نتائج، والمكان من الخلايا ترانسدوسيد. لإجراء التجارب على أن التحقيق في آثار التعبير التحوير أو قياس نشاط العناصر النسخي رابطة الدول المستقلة-بالنيابة، نقيس عادة التحوير مرناً مؤشرا أولياً لمستوى وإمكانية تكرار نتائج لنقل الجينات.
عامل جديد في المختبر سعت إلى إقامة الكفاءة مع هذا الأسلوب من ترانسدوسينج الأرانب الشائعة السباتي الشرايين مع متجه أدينوفيرال (2 × 1011 نائب الرئيس/mL) معربا عن التحوير β-جالاكتوسيداسي، مدفوعا الفيروس المضخم للخلايا (CMV) مروج. شرايين ترانسدوسيد المقطوع بعد 3 أيام وكانت مقطعة شرائح العرض. شرائح فردية ثم أما قطع مفتوحة محوريا أو ترك كحلقات سليمة. كانت جميع الشرائح X-غال الملون في أنابيب ميكروسينتريفوجي. ووضعت على سطح أفقي والسطح لومينال يتعرض أقصى حد ممكن، استخدام دبابيس حسب الحاجة لمنع هذا الجزء من الشباك الشرائح التي قد تم قص فتح محوريا. وقد أظهرت الصور الوجه en الأسطح لومينال تلطيخ غشائي قوي مع X-غال (الأرقام 3A و 3 باء). وأظهرت الصور المحوري الأسطح لومينال الخواتم السباتي سليمة X-غال تلطيخ فقط على السطح لومينال (3 أرقام و 3D). الجزء المتعلق بأنه قد تم فتح محوريا المجهزة في البارافين، مقطوع، ومكافحة ملطخة الهيماتوكسيلين وويوزين أو الأحمر سريع النووية. صور عرض X-غال تلطيخ أساسا في البطانة، على الرغم من أن هناك كمية صغيرة من تلطيخ في طبقة أدفينتيتيال (الأرقام 3E و 3F). يمكن أن يحدث توصيل الخلايا أدفينتيتيال عن طريق التسرب من ناقلات الأمراض من خلال موقع أرتيريوتومي أو عن طريق التسرب عبر فروع صغيرة الدانية إلى المواقع لربط فرع الجانب. 29
في تجربة منفصلة، مشغل جديد يسعى إلى إثبات الكفاءة في تحقيق مستويات استنساخه من التعبير التحوير، كمقدمة لتجارب تهدف إلى بحث الأنشطة البيولوجية المتسلسلات. الأرانب كانت ترانسدوسيد الشرايين السباتي المشترك مع تعتمد على مساعد إتش (2 × 1011 نائب الرئيس/mL) التي تتضمن أما apo A-أنا (هدادابواي) أو التحوير إيل-10 (HDAdIL10)، على حد سواء تحت سيطرة أحد المروجين CMV. تم حصادها 3 أيام بعد توصيل الشرايين ترانسدوسيد ومقطعة شرائح العرض. تم استخراج الحمض النووي الريبي من أجزاء السفينة، والاشتقاق A-أنا وتعبيرات مرناً إيل-10 تم قياس كمية من قرة-بكر، ومع التطبيع إلى جليسيرالديهيدي 3-الفوسفات نازعة مقتطفات مرناً (جابده) في نفس (الشكل 4). في الشرايين ترانسدوسيد HDAdIL10، قد فقط 1 من أصل 6 الشرايين apo منخفضة جداً، ولكن يمكن كشفها-أنا إشارة مرناً. يعني التعبير عن الاشتقاق A-أنا مرناً كانت أكبر 700-fold في الأوعية الدموية ترانسدوسيد مع هدادابواي من سفن ترانسدوسيد مع HDAdIL10. تم الكشف عن مستويات منخفضة من الذاتية إيل-10 مرناً في الشرايين ترانسدوسيد هدادابواي، بمتوسط زيادة التعبير الشرايين ترانسدوسيد HDAdIL10 في 6-fold. من المذكرة، هناك كبيرة داخلها وبينها artery تقلب في كفاءة توصيل والتعبير التحوير، كما يبين الشكلان 3 و 4، على التوالي. ونجد هذا التغير حتى مع المشغلين ذوي الخبرة.
الشكل 1 . أرتيريوتومي في الشريان السباتي المشترك- وتستخدم الملقط غرامة على فهم والبرانية الشريان السباتي وتطبيق الجر الصاعد للشريان. هذه المناورة توسع التجويف السفينة ويولد سطح رأسي الذي يتم إدراج إبرة ز 19 بنت، وبالتالي تقليل مخاطر ثقب الجدار الخلفي للشريان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . إغلاق أرتيريوتومي السباتي المشترك. مغلق أرتيريوتومي مع خياطة البوليبروبيلين 7-0، استخدام X-نمط. يدخل التجويف الشريان في أسفل يمين أرتيريوتومي (موقع 1) تمرير أول إبرة وخياطة وإنهاء التجويف في أسفل اليسار (الموقع 2). إبرة وخياطة ثم عبر أرتيريوتومي وإعادة إدخال التجويف في أعلى اليمين (الموقع 3). ثم يخرج الإبرة التجويف في أعلى اليسار (الموقع 4). الجر لطيف على طرفي الخياطة يغلق أرتيريوتومي. وترتبط نهايات خياطة (الخروج من الموقع 1 والموقع 4) مع 2 ساحة عقده. تمثل الدوائر الرمادية مواقع خياطة الجروح التي تمر عبر جدار الوعاء. خطوط زرقاء متصلة تشير إلى المناطق التي فيها الخياطة خارج جدار الوعاء. خطوط زرقاء منقطة تشير إلى المناطق التي فيها الخياطة داخل التجويف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . التعبير التحوير غشائي كفاءة. وقد ترانسدوسيد أرنب الشرايين السباتي المشترك مع متجه أدينوفيرال الإعراب التحوير β-جالاكتوسيداسي وحصادها بعد 3 أيام. وكانت شرائح الشريان ترانسدوسيد X-غال الملون كحلقات سليمة أو بعد فتح مع قطع محوري. (أ-ب) صور الوجه أون الأسطح لومينال السباتي الحلقات التي كانت تقطع فتح محوريا. (ج-د) آراء محورية في الفضاء لومينال الخواتم السباتي سليمة. (ه-و) العاشر-غال الملون، جزءا لا يتجزأ من البارافين شرائح السباتي مقطوع ومكافحة ملطخة أما الهيماتوكسيلين (E) وويوزين أو الأحمر سريع النووية (F). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. أنا = البطانية؛ م = وسائط الإعلام؛ و = والبرانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التحديد الكمي للتعبير مرناً التحوير. كانت ترانسدوسيد أرنب الشرايين السباتي المشترك مع إتش مساعد-تعتمد على الإعراب عن أما الاشتقاق-أنا (هدادابواي) أو إيل-10 (HDAdIL10) تحت سيطرة أحد المروجين CMV. كانت تحصد الشرايين بعد 3 أيام. التعبير مرناً للاشتقاق (A)-أنا وايل-10 (ب) كانت كمياً ببكر qRT وتطبيع إلى جابده مرناً في الشريان نفسه، ومعبرا عنه بوحدات التعسفي (الاتحاد الأفريقي). شريط يشير إلى القيمة الوسطية؛ قيمة P من اختبار رتبة بالمبلغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مزايا | العيوب | |
| مقارنة بنماذج القوارض | أقرب فيلوجينيتيكالي إلى الرئيسات | أكثر تكلفة لشراء والبيت |
| قدر أكبر من التنوع الجيني، تخفيف الترجمة السريرية | أكثر صعوبة تولد والتعامل | |
| السفن الأكبر حجماً تسمح المعالجة الجراحية أسهل ويوفر المزيد من الأنسجة للتحليل الكمي | المتطلبات التنظيمية أكثر اتساعاً | |
| يسمح استخدام الأجهزة اللمفاوية مصممة للبشر | خلفيات المعدلة جينياً أقل | |
| اختيار أقل واسعة من الأجسام المضادة للبروتينات الأرنب | ||
| بالمقارنة مع النماذج الحيوانية أكبر | غير مكلفة نسبيا لشراء والبيت | ربما ذات الصلة سريرياً أقل من غيرها نماذج حيوانية كبيرة لبعض أمراض الأوعية الدموية |
| أسهل تربية ومعالجة | ||
| مقارنة بخط جرثومة ترانسجينيسيس | التحوير المعرب عنها فقط في الشريان الكبير؛ ويمكن تحديد أثر التحوير على وجه التحديد في الموقع للفائدة | ومن الصعب تطبيق الأسلوب على خلايا خلاف البطانة |
| ويمكن استخدام السباتي contralateral كعنصر تحكم مقترن؛ يلغي معلمات الجهازية (مثلاً.، ضغط الدم، ومستوى الكوليسترول في الدم) كمتغيرات غير المنضبط | غرفة العمليات والخبرة الجراحية اللازمة؛ الأساسية للمرافق المحتمل غير متوفرة | |
| أعلى من الناتج لاختبار النشاط التنظيمي تسلسل الحمض النووي في البطانة سفينة كبيرة | لا يمكن التعبير عن التحوير في أسرة معظم الأوعية الدموية | |
| يحتمل أن تكون أسرع وأقل تكلفة | ||
| التعرض المنهجي للبروتين المحورة وراثيا من غير المرجح – يقلل من آثار خارج الهدف | ||
| بالمقارنة مع النهج المنهجية العلاج الجيني (على سبيل المثال،. توصيل الكبد عن طريق حقن الوريد المحيطي) |
تعبير مستقر أكثر من التحوير من العلاج الجيني الجهازية (الكبد) | تسليم ناقلات يتطلب التدخل الجراحي |
| التحوير وأعرب في جدار الشريان، والسماح بالتسليم المحلي لمستويات عالية من البروتين المحورة وراثيا | غرفة العمليات والخبرة الجراحية المطلوبة | |
| التعرض المنهجي للبروتين المحورة وراثيا من غير المرجح – يقلل من آثار خارج الهدف | العلاج محدودة للشرايين التي تستهدف على وجه التحديد للتدخل؛ لا تعالج العوامل النظامية (على سبيل المثال-، الدهون) | |
| ويمكن استخدام السباتي contralateral كعنصر تحكم مقترن؛ يلغي معلمات الجهازية (مثل ضغط الدم ومستوى الكوليسترول في الدم) كمتغيرات غير المنضبط | ||
| أقل بكثير ناقلات الجرعة اللازمة |
الجدول 1. مزايا وعيوب الجينات غشائي انتقائية الشريان السباتي المشترك أرنب نقل النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بعض جوانب تقنية جراحية تستحق اهتماما خاصا. التعرض الكامل وتعبئة الشريان السباتي المشترك عن طريق تشريح دقيق إرادة تسهيل إصلاح أرتيريوتومي ونقل الجينات. ومع ذلك، خلال التشريح، ينبغي تقليل التلاعب المباشر الشريان السباتي لمنع بالتشنج. وبالإضافة إلى ذلك، يجب إيقاف أي نزيف المتاخمة للشريان بتطبيق الضغط الخفيف مع شاش والدم اكسترافاساتيد يجب أن يكون تنظيف فورا بدهن المنطقة بالمحلول الملحي العادي. من المهم أيضا لتجنب إتلاف العصب المبهم، الذي يمتد موازيا للشريان السباتي المشترك. تقليم الغلالة في منطقة أرتيريوتومي المخططة ستساعد المشغل لأداء أرتيريوتومي نظيفة والوظيفية ولإصلاح في أرتيريوتومي. وأخيراً، يجب تحديد فروع خارج الشريان السباتي المشترك ومتصلة بشكل أمن لمنع تسرب ناقلات من التجويف السباتي.
وهناك أيضا الجوانب الحرجة لضخ المتجهات وإصلاح أرتيريوتومي. أثناء ضخ ناقلات الأمراض، من المهم أن انتفخ السباتي المشترك للعيار الفسيولوجية أو أكبر قليلاً لتحقيق كفاءة توصيل. عند إصلاح أرتيريوتومي، الخياطة أن تخترق جدار الوعاء أقرب ما يمكن إلى حواف أرتيريوتومي، وينبغي نظيفة أدخل والخروج من التجويف بدلاً من تمرير محوريا من خلال جدار الوعاء. إذا كان فقط يتم سحب الطبقات الخارجية لجدار الوعاء معا لأنه يمر الخياطة محوريا من خلال جدار الوعاء بدلاً من أن يمر الجدار إشعاعيا ودخول التجويف، ستظل فجوة في البطانية وسيزيد من خطر تجلط الدم. إذا الاختراقات خياطة متباعدة جداً على نطاق واسع، أو إذا شددت الإفراط الخياطة عند مرتبطة، سيتم إنشاء طيات الأنسجة في موقع أرتيريوتومي. هذه الطيات عرقلة تدفق الدم الصفحي العادي، كما يزيد من خطر تجلط الدم. الحفاظ على خصائص تدفق متسقة مهم للتجارب التي أجريت في نماذج حيوانية للأمراض (على سبيل المثال-، تصلب الشرايين) لتغيير تدفق يمكن أن تسهم في عملية المرض30.
غالباً ما تواجه المشغلين الجدد الشرايين مخثور في موسم الحصاد. تجلط الدم لومينال مضاعفات مدمرة، مما يجعل الشريان غير صالحة للاستعمال كنموذج تجريبي. لمنع تجلط الدم، ونحن بشكل روتيني إدارة الهيبارين الرابع قبل نقل الجينات. كما تمنع تجلط الدم بإغلاق حذراً من أرتيريوتومي، كما هو موضح أعلاه. ويمكن زيادة جرعة الهيبارين لمنع تجلط الدم، أو يمكن أن تعطي الأسبرين بعد. ومع ذلك، جرعة أعلى من الهيبارين يؤدي أيضا إلى زيادة احتمال حصول مضاعفات النزيف، والاسبرين يمكن أن تتداخل مع نقاط النهاية التجريبية، لا سيما إذا كان يجري دراسة التهاب. ولذلك، من الأفضل التركيز على تحسين تقنية جراحية كوسيلة لمنع تجلط الدم.
إذا معالجته أيضا بقوة، فقد يخضع الشرايين السباتي تشنج، التي يمكن أن تسهم أيضا تجلط الدم بتقليل تدفق. إذا تم مصادفة بالتشنج، فإنه يمكن أن يزول بتطبيق بابافرين الموضعية. عندما يزمع الحصاد السفينة لأكثر من 2-3 أيام بعد توصيل، وتجلط الدم مصدر قلق، يمكن استخدام ترانسكوتانيوس بالموجات فوق الصوتية لتقييم سالكيه السفينة نونينفاسيفيلي. اكتشاف مخثور الشرايين قد تؤدي إلى القتل الرحيم توفيرا في تكاليف الإسكان. الحيوانات إضافية يمكن أيضا المسجلين على وجه السرعة، لملء مجموعات تجريبية. ينبغي أن تكون المناطق المحيطة بالمدن وما intervention معدل الوفيات المرتبطة بهذا الأسلوب < 1% (أي.، لا يختلف عن معدل الوفيات المرتبطة بعملية جراحية أخرى أجريت على الأرانب صحية)31.
بعد عامل التشغيل تصبح مريحة مع الجوانب التقنية للبروتوكول الجراحية، وقدرة على إجراء نقل الجينات تتسم بالكفاءة لاحتياجات البطانة ليتم التحقق منها، باستخدام النهج الموصوفة في المقطع أعلاه على النتائج الممثلة. إذا نشأت مسائل مع تحقيق نقل الجينات استنساخه، يرجح المذنب في واحد من هذين المجالين. بعد أن السفينة معزولة وتغسل الدم من التجويف، من المهم إزالة المخزن المؤقت أغسل دميم بحيث لا تمييع الحل المتجهات التي غرست أثناء توصيل. والجانب المهم الآخر انتفخ السفينة إلى عيار الفسيولوجية أو أكبر قليلاً خلال التسريب متجه. نظراً لتجربتنا، يحتوي شريان السباتي الذي هو ليس منتفخة تماما أو لا تظل منتفخة أثناء ضخ 20 دقيقة موثوق بها تعبير التحوير منخفضة، فمن المحتمل أن يحسن انتفاخ الشريان للعيار الفسيولوجية توصيل الكفاءة. ومع ذلك، ابدأ درسنا هذا بصورة منتظمة. فمن الممكن أن زيادة ضغط ضخ أعلى المستويات الفسيولوجية يمكن زيادة كفاءة توصيل، وأيضا السماح بمستويات أعلى من توصيل الخلايا في وسائط الإعلام والأوعية الدموية. ومع ذلك، يرجح أن الإخلال بحاجز غشائي سيضر بالسفينة وتزيد من خطر تجلط الدم. إذا كانت السفينة لا تبقى منتفخة لفترة الحضانة متجه 20 دقيقة كاملة، فمن المحتمل أن الناقل هو تسرب من فروع الشريان السباتي المشترك. كن حذراً أثناء تشريح لتحديد وسد جميع فروع لمنع تسرب ناقلات من التجويف السباتي.
يحتوي هذا الأسلوب العديد من القيود التي تتعلق باستعمال الأرانب. الأرانب أقل تكلفة لإيواء وإطعام من الحيوانات الكبيرة الأخرى (الكلاب والخنازير، الأغنام)؛ تكاليف شراء، الإسكان، وتغذية الأرانب غير إلى حد كبير أكثر من للفئران والجرذان. مرافق التشغيل والمتطلبات التنظيمية لعملية جراحية أرنب أيضا أكثر بكثير واسعة النطاق للقوارض. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب قدرا كبيرا من الخبرة الفنية لأداء بروتوكول نقل الجينات الجراحية بشكل فعال. ويمكن اكتساب هذه الخبرة من المشغلين الذين لديهم أي تدريب رسمي الجراحية. الأفراد على الأقل 2 في مجموعتنا (بما في ذلك كاتب هذه المخطوطة الأولية) تعلم التقنيات الجراحية وتطبقها منتجة. على الرغم من ذلك، يلزم التدريب الدقيق وعملية التحقق حذراً من كفاءة نقل الجينات للمشغل وإمكانية تكرار نتائج (كما هو موضح في المقطع النتائج التمثيلية) قبل أن يبدأ المشغل لتوليد بيانات عالية الجودة.
الحبس التحوير التعبير حصرا تقريبا على البطانة مع هذا الأسلوب29،32،،من3334،35،،من3637 مفيدة في ذلك أنه يسمح لتحقيق آثار التحوير في خلايا بطانية وقياس نشاط لرابطة الدول المستقلة-النيابة تسلسل الحمض النووي التنظيمية في خلايا بطانية. وقد ترانسدوسيد عدد صغير من الخلايا أدفينتيتيال أو الآنسي؛ ومع ذلك، عجز هذا الأسلوب كفاءة ترانسدوسي الخلايا نونيندوثيليال يمنع تطبيق الأسلوب لدراسة أنواع أخرى من خلايا جدار الأوعية الدموية (مثل خلايا العضلات الملساء والضامة). على الرغم من أن overexpression بروتينات يفرز من خلايا بطانية ترانسدوسيد يمكن السماح بالتحقيق في آثار هذه البروتينات في الخلية والأوعية الدموية الأخرى أنواع، الأدوار غير يفرز البروتينات في هذه الأنواع الأخرى من خلايا الأوعية الدموية (على سبيل المثال-مستقبلات أو البروتينات المشاركة في توصيل الإشارة) لا يمكن أن يتم التحقيق مع هذا الأسلوب.
كوسيلة لاختبار العلاج الجيني المستهدفة لجدار الشريان، يختلف الأسلوب الأساليب الإكلينيكية الأخرى بطريقتين الرئيسية. أولاً، الأسلوب الذي يستخدم نموذج أرنب في فيفو اختبار العلاج الجيني بدلاً من أكثر استخداماً نماذج القوارض8،،من1215،،من3839. يسمح استخدام الأرانب تقييم التعبير التحوير والدور البيولوجي للمنتج التحوير في نموذج حيوان أووتبريد، وأكثر تمثيلاً للتنوع الجيني البشري من القوارض الفطرية. يمكن استخدام النموذج لتقييم العلاج الجيني في الشرايين أما الأرنب العادي أو في الشرايين الأرنب التي لديها أمراض الشرايين التي مماثلة لتلك الموجودة في الشرايين البشرية المريضة. أرنب الشرايين أيضا أقرب في الحجم للشرايين البشرية من الشرايين القوارض وتوفر أكثر بكثير من الأنسجة للتحليل مما متاح من الشرايين القوارض. والفرق الرئيسي الثاني أن هذا الأسلوب يستخدم نهج جراحية لتسليم ناقلات التحوير للبطانة الوعائية. العلاج الجيني الجسدي غالباً ما تسليم عناصره، غالباً باستهداف الكبد بهدف تغيير مستويات البلازما من التحوير البروتين25،40. باستهداف البطانة الوعائية، اللوازم الطريقة التحوير العلاجية المنتج محلياً، مع تركيز الذروة داخل جدار الشريان، تحديداً حيث أنه مطلوب لعلاج أمراض الأوعية الدموية. بتسليم التحوير محلياً فقط، يلغي الأسلوب أيضا الآثار الجانبية الجهازية المنتج التحوير. مجموعات أخرى تقوم بتطوير أساليب استخدام الببتيدات، والأجسام المضادة، أو غيرها من التعديلات في قفيصه لاستهداف ناقلات حقن النظامية للبطانة سليمة أو مريضة لتوفير العلاج بالجينات والأوعية الدموية المحلية41،42 , 43-ومع ذلك، هذه تستهدف أساليب ما زالت قيد التطوير، ولا تزال معقدة بتوصيل منهجية كبيرة، لا سيما في الكبد42،،من4344. لدينا طريقة جراحية يوفر مقدمة واضحة وفعالة المتسلسلات البطانة الوعائية مع توصيل الحد الأدنى-أن وجدت-في مواقع أخرى. 1 الأسلوب أيضا أكثر ملاءمة وكفاءة وأعلى-طوال يعني (مقارنة بجرثومة-خط ترانسجينيسيس أو حقن الجهازية غشائي استهداف ناقلات) لاختبار نشاط تنظيمي تسلسل الحمض النووي في السفينة الكبيرة البطانة، لاختبار وظيفة البروتين التحوير في جدار الشريان، واختبار العلاج الجيني استهدفت السفينة-الجدار.
هذا الأسلوب يسمح التحقيق في دور البيولوجية أي التحوير، عندما يتم التعبير عنه في البطانة شريان كبير. في حالة تعديل للتعبير عن فقدان وظيفة الكواشف مثل المستقبلات السلبية السائدة أو دبوس قصيرة الجيش الملكي النيبالي، سيسمح التحقيق في دور البروتينات غشائي الذاتية ومسارات الإشارات. يمكن أيضا استخدام الأسلوب لقياس النشاط الترانسكربتي من أي تسلسل الحمض النووي رابطة الدول المستقلة-النيابة في شريان كبير خلايا بطانية5،،من67. وبالإضافة إلى ذلك، الأسلوب يسمح لاختبار أي نوع من ناقلات نقل الجينات للكفاءة والسلامة عند تسليم محلياً للبطانة، وسوف تكشف عن قدرة الموجه لتحقيق التعبير التحوير دائمة. وأخيراً، يسمح الأسلوب تطوير واختبار مجموعات المتجهات والمتسلسلات التي صممت لتقديم العلاج بالجينات المستهدفة لجدار الأوعية الدموية. الأسلوب يمكن أن تخدم كأداة فحص لتحديد الجينات العلاجية التي يمكن في المستقبل-تسليمه إلى البطانة جميع الشرايين الكبيرة (أو جميع الشرايين الكبيرة المريضة) بحقن يغرز ناقلات المستهدفة لجدار الأوعية الدموية. بسبب الحصانة موجودة مسبقاً في البشر إلى إتش 5 نوع45، سوف تكون صعبة لاستخدام ناقلات المستندة إلى 5 نوع إتش في التطبيقات السريرية. هندسة قفيصه إتش 5، استخدام اللقاح البديلة إتش46، أو استخدام ناقلات أقل مكسبه مثل إف قد يلزم تقديم العلاج الجيني والأوعية الدموية إلى العيادة. كأداة تجريبية، بيد أننا غير مدركين لأي ناقل يمكن أن تتنافس مع مساعد-تعتمد على إتش 5 في تحقيق التعبير التحوير فعالة ودائمة في الأوعية الدموية1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أدفيك, Inc. للحصول على إذن لاستخدام الكواشف حداد وفيك جوليا للمساعدة الإدارية والخدمات البيطرية قسم "الطب المقارن" للمشورة الجراحية والدعم. أيد هذا العمل HL114541 والمبرات لام جون لوك، الابن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J.
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A.
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
