Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

I Vivo Genoverføring til kaninen felles arteria carotis endotelet

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/56982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, University of Washington

Summary

Denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av kanin carotis arteriene. Innføringen av transgene lar vurdering av biologiske rollen av transgene produktet i normale arterier eller sykdom modeller. Metoden er også nyttig for å måle aktivitet av regulatoriske DNA-sekvenser.

Abstract

Målet med denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av isolerte deler av begge kanin felles carotis arteriene. Metoden oppnår fokal endothelial-selektive transgenesis, og dermed slik at etterforsker å bestemme biologiske rollene endothelial-uttrykt effekter av transgener og kvantifisere i vivo transcriptional aktiviteten til DNA-sekvenser i store arterie endotelceller. Metoden bruker kirurgisk isolering av kanin felles carotis arteriene og en arteriotomy for å levere en transgene-uttrykke viral vektor i arterial lumen. En kort inkubasjonstiden av vektoren i lumen, med påfølgende aspirasjon av lumen innholdet, er tilstrekkelig til å oppnå og varig uttrykket av transgene i endotelet, uten synlig signaltransduksjon eller uttrykket utenfor det isolert arteriell segment. Metoden gjør vurdering av de biologiske aktivitetene av transgene produkter både i normale arterier og modeller for menneskelig vaskulær sykdom, mens du unngår systemiske effekter som kan være forårsaket enten av målretting gen levering til andre nettsteder (f.eks. leveren) eller av alternativ tilnærming å levere genetisk konstruksjoner til endotelet av bakterie linjen transgenesis. Påføringsmetode begrenses av behovet for en dyktig kirurg og anesthetist, en velutstyrt operasjonsstuen, kostnadene ved innkjøp og bolig kaniner, og behovet for kompetanse i genoverføring vektor bygging og bruk. Resultater oppnådd med denne metoden inkluderer: transgene-relaterte endringer i arterial struktur, cellularity, ekstracellulær matrix eller vasomotor funksjon; økning eller reduksjon i arterial betennelse; endringer i vascular celle apoptose; og fremdrift, retardasjon eller regresjon av sykdommer som intimal hyperplasia eller åreforkalkning. Metoden kan også måling av evnen av innfødte og syntetisk DNA regulatoriske sekvenser å endre transgene uttrykk i endotelceller, gir resultater som omfatter: nivåer av transgene mRNA, nivåer av transgene protein og nivåer av transgene enzymatisk aktivitet.

Introduction

Målet med denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av kanin felles carotis arteriene. Innføringen av transgene lar vurdering av biologiske rollen av transgene produktet både i normale arterier og kanin modeller av menneskelig arterial sykdom. Overuttrykte transgene sykdom modeller kan avsløre om transgene (og protein produktet) viser lover som terapeutiske agenter1,2,3,4. Inkludering av cis-fungerende regulatoriske elementer i transgene uttrykk kassetten gjør vurdering av aktiviteten til disse elementene i arterial endotelet i vivo5,6. Kunnskap om aktiviteten til bestemte cis-fungerende regulatoriske elementer kan brukes til å utforme aktive uttrykk kassetter og å undersøke mekanismer av genet regulering i store arterien endotelet i vivo7.

Kanin er en verdifull modell for ulike sider ved menneskelige vaskulær fysiologi og sykdom. Kanin aksje mange vaskulær funksjoner med mennesker. For eksempel er opprinnelige Hematologisk verdier, hemostatic regulering og vaskulær langsgående spenning like mellom kaniner og mennesker8. Kanin modeller av vaskulær sykdom gjenskape nøkkel vise egenskaper av mange menneskelige sykdommer, inkludert: aneurismer (lignende geometriske og flyt)9, vasospasme (lignende svar til endovascular behandling)10,11, og aterosklerose (intimal plaketter med lignende funksjoner inkludert en kjerne rik på lipid, makrofager og glatt muskel celler i en fibrøs cap)12,13. Følgelig kanin modeller har blitt utviklet for mange vascular sykdommer som blodpropp, vasospasme, aneurisme, diabetes, vaskulære pode stenose og aterosklerose8,13,14, 15,16.

For forskere å velge blant dyr modeller av vaskulær fysiologi og sykdom, har kaninen flere fordeler. Sammenlignet med gnagere, kan de større fartøyene kaniner lettere kirurgisk manipulasjon, bruk av endovascular enheter, og en større mengde vev for kvantitative mål. Kanin er mye nærmere phylogenetically primater enn gnagere17, og større genetisk mangfold av outbred kanin bedre tilnærmet genetisk variasjon av mennesker. Genetisk mangfold er spesielt viktig for prekliniske studier, som-av natur-målet å utvikle terapier som kan brukes til genetisk ulike menneskelige befolkningen. Som med mange om ikke alle andre modellen arter, kanin gener er lett klonet eller syntetisert fordi kanin genomet har blitt sekvensert med høy dekning (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Sammenlignet med andre store dyr modeller (som hunder, griser og sauer), kanin er relativt billig å kjøpe hus og de er enklere å avle og håndtere. Bestemt vaskulær sykdom modeller i kaniner hver har sine egne fordeler og svakheter som modeller for menneskelig sykdom som er utenfor omfanget av dette manuskriptet8,12,18. En etterforsker bør se disse fordeler og mangler å avgjøre hvis kaninen er den beste modellen for å svare på et bestemt eksperimentelle spørsmål.

Innføring av deoksyribonukleinsyre (DNA) regulatoriske sekvenser i endotelceller i vivo gjør det mulig for undersøkelse av aktiviteten til disse sekvensene i komplekse fysiologiske omgivelser. In vitro studier i transfekterte endotelceller kan være nyttig for den innledende vurderingen av regulatoriske DNA-sekvenser; men er uttrykket nivåer i vev kultur modeller noen ganger ikke reprodusert når studiene er gjentatt i vivo5,19,20. In vitro systemer kan også være nyttig for å utforske grunnleggende veiene av protein signalering og endothelial fysiologi samt kommunikasjon mellom kulturperler vaskulære celler. men er mer kompliserte gangstier eller regulatoriske nettverk som er påvirket av komplekse bestander av nærliggende vaskulære celler eller immunsystemet best studerte i en i vivo systemet6,20. Metoden beskrevet her gir en plattform for å utforske regulering av transgene uttrykk i endotelet innen rammen av et intakt fartøy, med eller uten sykdom. I vivo systemet tillater også undersøkelse av fysiologiske og patologiske mobilnettet crosstalk og identifisering av bidrag av immunsystemet til regulering av gene expression6.

Bakterie-line transgenesis (spesielt i mus) er en alternativ tilnærming for regissere transgene uttrykk til endotelceller. Denne tilnærmingen kan gi livslang transgene uttrykk, endothelial målretting formidlet av bestemte arrangøren eller regulatoriske regioner21,22. Men generasjonen av transgene mus er tidkrevende og kostbar, flere transgene linjer ofte må testes for å sikre målretting av transgene til ønsket celle type og prestasjon av tilstrekkelig transgene uttrykk nivåer, og eksperimentelle resultatene i murine systemer kan være press-avhengige. Murine transgene modeller med endotelial målrettede effekter av transgener har mange fordeler: det er ikke nødvendig å utføre kirurgi på hver eksperimentelle dyr for å oppnå transgenesis, eksperimentelle mus kan bred med mange andre tilgjengelige transgene mus i for å teste genetiske og fenotypiske interaksjoner, og det er et bredt utvalg av antistoffer som reagerer med murine proteiner, tilrettelegge karakteristikk av fenotyper. Men målretting av effekter av transgener til endotelet via bakterie linjen vanligvis resulterer i transgene uttrykk gjennom blodkar,22 gjør det vanskelig å finne ut hvilket område som transgene produktet fungerer. Dette gjelder særlig når transgene produktet utskilles, fordi et transgene produkt utskilles av endotelceller gjennom er blodkar kunne ha biological aktivitet på en rekke områder innenfor et dyr. Selv om metoden beskrevet i dette manuskriptet krever teknisk ekspertise og spesialiserte anlegg, kan det være mindre tidkrevende og billigere enn utvikle en endothelial-spesifikke transgene musen linje. Det tillater for vurdering av funksjonen av et protein selektivt i endotelceller av et segment i store arterien, og det tillater bruk av kontralateral carotis communis som en tilkoblet (eliminere systemiske faktorer som kan variere fra experimental dyr-for eksempel blodtrykk eller kolesterol nivåer-som ukontrollert variabler).

Genterapi er en lovende metode for behandling av vaskulær sykdom, spesielt kroniske sykdommer, fordi en enkelt applikasjon kan gi vedvarende eller muligens livslang uttrykk for en terapeutisk genet23. Terapeutiske løftet av genterapi har blitt utforsket i dyr modeller av somatiske genoverføring, ofte målretting leveren24,25, som er en relativt lett mål fordi mange blodbårne virus vektorer er hepatotropic. Men for å ha en effekt på vaskulær sykdom, må genterapi rettet mot leveren oppnå systemisk overuttrykte proteiner. Dette krever vanligvis store doser av vektor, som kan være giftig eller med dødelig26. Videre økt systemisk nivåer av lønnsforhøyelse protein risikoen for off-målet bivirkninger, som kan komplisere eller selv skjule tolkning av eksperimentelle resultater. Lokale genterapi målretting vaskulære endotelet som beskrevet i dette manuskriptet kunne unngå systemisk bivirkninger fordi infundert vektoren ikke er allment spres utover transduced arteriell segmentet, og lokale vaskulær effekter kan oppnås uten endringer i systemisk Plasmanivåer av protein. 27 i tillegg en langt lavere mengde vektor er nødvendig å transduce en arteriell segmentet enn nødvendig å oppnå robust hepatic signaltransduksjon. Transgene uttrykk fra leveren har blitt rapportert å avta over tid, trolig på grunn av celle omsetning, krever gjentatte dosering hvis høyt nivå transgene uttrykket er opprettholdt. 28 derimot den lave omløpshastighet av endotelet gir stabil uttrykk for minst 48 uker i chow-matet kaniner og minst 24 uker i aterosklerotisk lesjoner av kolesterol-matet kaniner. 1 , 27

For å fastslå om denne metoden for genoverføring til kaninen felles carotis endotelet er hensiktsmessig, bør fordeler og ulemper (tabell 1) vurderes i sammenheng med de spesifikke forskning mål. Fordeler ved denne metoden inkluderer: outbred kanin er bedre representant for menneskelig genetisk mangfold enn er innavlet mus (viktig for prekliniske arbeid); kaniner gi større fartøy for lettere manipulasjon og flere vev for analyse; metoden kan oppnå endotelet målrettede transgene uttrykk langt raskere enn bakterie-line endothelial målretting i transgene mus; Vector-dose kan enkelt justeres til modell variabel nivåer av transgene uttrykk. prosessene gjelder for store-arterie endotelet kan undersøkes; og lokale vaskulær transgenesis lar motsatt carotis i samme dyret som en kontroll, eliminere systemiske faktorer som ukontrollert variabler. Ulemper inkludere: spesielle fasiliteter og kompetanse er nødvendig; færre genmodifiserte bakgrunn på å eksperimentere finnes i kanin enn i mus; og det er en mindre omfattende utvalg av antistoffer mot kanin versus musen proteiner (for immunodetection av transgene protein og andre antigener som kan være viktige i å tolke eksperimentelle resultater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av University of Washington Office of Animal Welfare og tilknyttede institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC), og ble avsluttet i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer.

Merk: Genoverføring til kaninen felles carotis arteriene utføres på kanin av en kirurg ved hjelp av en anestesilegen eller assistent.

1. genoverføring til kaninen felles carotis arteriene: før operasjon

  1. Bedøve kaninen. Veie kaninen. Kombinere 30 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazine i en sprøyte. Injisere ketamin/xylazine intramuscular (IM) i paraspinous muskler å indusere anestesi.
  2. Stund venter for kaninen til å bli anesthetized, forberede forberedelse rommet og operasjonsstuen (OR) tabeller.
    1. På OR forberedelse rommet: ophthalmica salve og fentanyl oppdateringen innen rekkevidde tabellen forberedelse. definere hårklippere og et vakuum for barbering kaninens hals og øret; avsette en spritpute prep, en 24G x ¾" kateter, en injeksjon port og kirurgisk tape å sikre intravenøs linje (IV) i kaninens øret blodåre.
    2. I OR: sette opp overvåking utstyr og plassere sonder [elektrokardiogram (EKG), oksygenmetning (SpO2), temperatur] på tabellen OR. forberede oksygen og isoflurane; tie gasbind stripen til ansiktsmaske å sikre den til kaninen og plassere masken på hodet slutten av tabellen.
      Merk: Gasbind strimler på ansiktsmaske skal ha 2 haler av ca 45 cm hver.
    3. Slå på oppvarming vann teppet i tabellen OR. Oppå vann teppe, Plasser en rullet håndkle for halsen støtte og dispersiv elektrode plate (senere plassert under kanin tilbake).
    4. Definere eller IV pumpen med 100 mL en saltvann IV pose med en 18-19G nål knyttet og satt infusjonshastigheten til 10 mL/t per kg.
    5. Kombiner 1 mL av lidocaine HCl (2% lagerløsning) og 1 mL av bupivicaine HCl (0,5% lagerløsning) i en sprøyte, skal brukes som et lokale smertestillende.
  3. Når kaninen er fullt anesthetized, forberede kaninen kirurgi.
    Merk: Kontroller om mangelen på en pedal refleks (klemme en tå; se etter lem tilbaketrekning) å sikre bedøvende dybde, og fortsetter å overvåke den pedal refleks hele operasjonen.
    1. Ophthalmica salve gjelde øyne. Fjerne avføring fra kaninens endetarm ved å trykke med hansker fingrene på lavere fremre magen (over endetarmen) og flytte fingrene mot anus. Dette vil tillate senere plasseringen av en endetarms temperatur probe.
    2. Barbere fremre halsen fra sternal hakk til kanten av mandible mens du bruker et vakuum for å holde området rent. Også barbere begge ørene IV plasseringen og fentanyl oppdateringen og barbere en venstre bak midten tå for puls-oximetry sonden.
      Merk: Protokollen forutsetter at kirurgen er kaninens høyre for hele prosedyren. Hvis OR oppsettet steder kirurgen på motsatt side, reversere sidene i dette trinnet å holde ledninger og IV motsatt av kirurgen. Sidene av fremtidige trinnene skal også byttes etter behov.
    3. Tørk venstre øre med en spritpute prep, plassere en 24G IV kateter i venstre øre venen, lue med injeksjon port og tape kateter/porten kaninens øre for å sikre den. Bruke en fentanyl oppdatering (25 µg/h) på kaninens høyre øre.
    4. Transportere kaninen til OR og plasser supine i drifts tabellen med en rullet halsen støtte håndkle under kaninens halsen like nedenfor hodet. Forsiktig utvide kaninens hals før det er rett og ca vannrett.
    5. Feste kaninen til ansiktsmaske med O2 på 1 L/min, og start isoflurane administrasjon. Sikre masken ved innpakning endene av gasbind stripen knyttet til masken rundt halsen støtte håndkle under kaninen. Justere isoflurane (vanligvis 1-2%) etter behov (basert på hjertefrekvens, pustefrekvens og pedal refleks) å opprettholde riktig anestesi for resten av prosedyren.
    6. Kontroller at dispersiv elektrode platen er sentrert under kaninens tilbake. Temperatur og puls-oksymeter prober og bruke EKG fører til kaninen.
    7. Koble IV saline kateter porten i kaninens øret, starte saltvann pumpen på 10 mL/t per kg.
      Merk: Etter 1 h, saltvann pumpen kan bli redusert til 5 mL/t per kg.
    8. Holde kaninens forbena av løst knytte dem til tabellen. Eventuelt plassere en liten plast tabell over kaninen til å beskytte kaninen mot å bli utsatt for brystet/abdominal press fra kirurgen lener seg på kanin brystet/underliv.
      Merk: Lite bord kan hindre tvunget regurgitation av abdominal innholdet.
    9. Injisere 2 mL av tidligere forberedt lidocaine (2% stock) / bupivacaine (0,5% stock) (50/50 mix) subcutaneously langs planlagt snitt hals for lokalbedøvelse.
    10. La hjelperen forberede kirurgiske området med 3 vekslende scrubs chlorhexidine og isopropanol og deretter spray med betadine. Scrub, kappe og hansker, etter riktig steril teknikk.
      Merk: Kirurgen bør være seg 2 x kirurgisk forstørrelsesglass til å hjelpe med første halvdel av operasjonen. Under overlevelse operasjonen er det viktig å opprettholde sterilitet av kirurgen og kirurgiske feltet. Bare hjelperen skal håndtere ikke-sterilt elementer og sterilisert materialer må tas aseptisk sendt til kirurgen eller plassert på tabellen drapert instrument. Sterilt håndklær kan brukes av kirurgen for å opprettholde sterilitet mens manipulere ikke-sterilt utstyr som mikroskop.

2. overlevelse kirurgi (genoverføring)

  1. Forbered instrumenter og sterile feltet.
    1. La hjelperen åpne sterilt drapere pakken som inneholder en tabell drapere, en papir drapere for kaninen, og flere håndklær. Tas aseptisk overføre varene til kirurgen.
    2. Drapere tabellen instrument. Sted 6 sterilt håndklær og papiret drapere på tabellen drapert.
    3. Med 4 håndklær, drapere kaninens halsen, forlater bare det kirurgiske området utsatt (ca 4 cm x 10 cm). Legge papir drapere over kaninen.
    4. La hjelperen åpne sterilisert instrumentet pack og plasser tas aseptisk på tabellen instrument.
    5. La hjelperen åpne følgende utstyr og tas aseptisk plasser på tabellen instrument eller hånd til kirurgen: tre 1-mL sprøyter (og en nål hvis sprøyter ikke allerede er lastet med nåler), en 20 mL sprøyte, en 21G nål, en 19G p, 3-0 polyglycolic syre (PGA) Sutur, 5-0 PGA Sutur, 7-0 polypropylen Sutur og to 24 G IV-katetre.
    6. Sikre electrocautery kabelen til det kanin drapere bruker den 7.25" Kantrowitz tang og deretter falle pluggen ende av tabellen. La hjelperen koble kabelen til elektrokirurgi enhet og slått på.
    7. Fylle en 20 mL sprøyte med bakteriefri saline, trukket fra en IV bag eller hetteglass holdt hjelperen. Bruk denne saline behov for å holde eksponert vev fuktig under prosedyren.
    8. Forberede en 1 mL sprøyte med 1 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM, for vask arterien). For hver arteria carotis som vil være transduced, er 0,35 mL utvannet virus nødvendig. Hvis det samme viruset brukes for begge sider, Forbered en 1 mL sprøyte med virus fortynnet i DMEM til et volum på 0,7 mL. Hvis forskjellige sider får forskjellige virus [for eksempel en "Null" virus kontroll på den ene siden], forberede to 1 mL sprøyter, hver med 0,35 mL virus. Hjelper-avhengig adenovirus, virus konsentrasjonen er 2 x 1011 virus partikler (vp) / mL.
      Merk: La hjelperen forberede viruset. Kirurgen trekker opp DMEM og virus suspensjon i sterile sprøyter.
    9. Skjære hull i drapere. Størrelsen på hullet bør være samme størrelse som det kirurgiske området på kaninens hals som er innrammet av håndklær i trinn 2.1.3. Klemme hjørnene av hullet i papir drapere til de underliggende håndklær som er drapert over kaninens halsen med håndkle klemmer.
  2. Isolere felles carotis arteriene.
    Merk: 2 x kirurgisk forstørrelsesglass bør brukes for denne delen.
    1. Kutt huden med en electrocautery langs midtlinjen utvide ca 7-9 cm cranially mot mandible og klemme huden åpne håndkle festing.
    2. Gjør en kort lateral klippe gjennom fascia med electrocautery på caudal slutten. Sett inn store saksen i kuttet og rett ut dissekere fascia langs hele midtlinjen. Kuttet dissekert fascia ned midtlinjen med electrocautery.
    3. Med liten dissecting saks, dissekere mellom V-formet musklene (sternocephalic muskel) og sternohyoidus muskelen over luftrøret, å avdekke felles carotis arteriene, på høyre side.
    4. Dissekere den høyre arteria carotis communis gratis fra omkringliggende vev, dele alle bransjer, fra bunnen av halsen caudally til krysset av pharyngeal nerve cranially. Bruk kirurgisk silisium looper å hjelpe trekke arterien i disseksjon.
      Merk: Omsorg bør tas ikke forstyrre enten nervus vagus som går parallelt med carotis communis, eller mindre nerver som krysser carotis communis.
    5. Ligate noen store filialer kommer av carotis communis (1-2 hver side) med 5-0 silke suturer før kutte grenen distally for å frigjøre en 4-5 cm segment av carotis. Skjær samskrevet grener 1-2 mm fra slipset slik at slipset ikke slip av.
    6. Gjenta disseksjon til venstre (trinn 2.2.3 - 2.2.5).
  3. Tilfører vektorer i vanlige carotis arteriene.
    Merk: Et kirurgisk mikroskop (16 X) brukes som trengs for å utføre arteriotomy, infusjonen vektor/kontrolløsning og arteriotomy reparasjon.
    1. La hjelperen fjerne de kirurgiske forstørrelsesglass av kirurg og flytte kirurgisk mikroskopet på plass. Drapere et sterilt håndkle over mikroskopet tillater manipulering av mikroskopet uten forurensende sterile feltet.
    2. Injiser heparin [150 internasjonale enheter (IU) /kg] i IV kateter og skyll med 10 mL av saltvann.
    3. Tilbake til den isolerte høyre arteria carotis communis, sette to silke slips rundt midten av delen av mobilisert carotis segmentet og knytte en enkelt halvstikk knuten på hver - uten stramme dem.
    4. Bøye 19G nålen like over skråkant til ca 80° med stor nål driveren (gjør ikke bøye skråkant; Figur 1).
    5. Klemme arterien i hver ende av det isolert segmentet med vaskulær klipp, plassere skallen klippet først å tillate arterien fylle og deretter plassere caudal klippet.
    6. Punktering carotis med bøyde 19G nålen bare skallen til caudal vaskulær klippet, tar stor forsiktighet for å ikke punktere rygg eller side vegger. Fremme pinne-spissen i lumen og trekke det to ganger for å sikre at arteriotomy helt passerer blodåreveggen. Deretter forsiktig trekke nålen.
      Merknader: Det er viktig at du oppretter en arteriotomy som trenger alle lagene i blodåreveggen rent og ikke dissekere blodåreveggen (ved bestått aksialt gjennom adventitia og media). Dette skal carotis være punctured med pinne-spissen plassert så nært som mulig til en 90-graders vinkel mot blodåreveggen (figur 1). Carotis punktering i 90° vinkel er hjulpet av griper arterien i adventitia med fine tang og løfte forsiktig arterien overflaten mens du trykker på tuppen av p bare caudal til heis poenget. Denne manøveren også reduserer risikoen for å treffe bak veggen (figur 1).
    7. Brette og gjeng opp flere gasbind pads i et reir å legge sprøyten brukes for infusjoner. Plass reiret på kaninens brystet caudal til innsnitt.
    8. Sette en IV-kateter på sprøyten som inneholder bare DMEM (ikke strammer) og bøy kateter ~ 4 mm fra spissen slik at svingen holder på ca 75° etter utgivelse.
    9. Sett inn IV-kateter i arterien til bøyepunktet og vaske ut alle blod fra arteria med DMEM (~ 0,25 mL x 2). For hver vask, fylle arterien med DMEM, og deretter fjerne gjenværende DMEM fra fartøyet lumen ved forsiktig å trykke på arteria med en hansker finger, begynner bare caudal til skallen vaskulær klippet. Samtidig opprettholde lett trykk, skyv fingeren fra skallen til caudal. Luminal innholdet vil bleke via arteriotomy.
    10. Holde kateter arterien og utveksle DMEM sprøyten for sprøyten som inneholder virus løsning. Kontroller at ingen luft inn i kateter.
    11. Skyv silke båndene ned arterien slik at de omgir arteria der kateter spissen, men ikke trekk dem.
    12. Tilfører 0,03 mL av det virus løsningen å presse den gjenværende DMEM av kateter og deretter tømme arterien. Skjule det ved igjen å fjerne alle væske fra lumen med en finger, skallen til caudal (som i trinn 2.3.9).
    13. Stram de to båndene rundt kateter tips å forsegle lumen. Tilfører det virus løsningen (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus) ved å trykke sprøytestempelet forsiktig til arterien er distended til fysiologiske caliber.
      Merk: Det er viktig at arteria utvides til fysiologiske kaliber og forblir distended under virus infusjon. Hvis ikke, graden av genoverføring reduseres betydelig.
    14. Forsiktig legge sprøyten ned på nest av gasbind.
    15. Plass en 7-0 polypropylen Sutur i den vanlige carotis adventitia bare caudal av skallen vaskulær klippet merke skallen grensen genet signaltransduksjon
    16. Når virus inneholder løsningen er i arterien lumen for 20 min, fjerne virus inneholder sprøyten og erstatte den med en tom sprøyte. Sug opp virus inneholder løsningen forsiktig til fartøyet kollapser og fjerne sprøyten. Skjær eller angre silke båndene og fjern kateter.
      Merk: Kutte båndene kort aids i fjernes. Fjerne kateter forsiktig å unngå forårsaker skade på carotis endotelet.
    17. Bruker kirurgisk mikroskopet, lukke arteriotomy med 7-0 polypropylen ved hjelp av en X-mønster (figur 2).
      1. Gjør en første pass inn nederst til høyre i arteriotomy og spennende fartøyet nederst til venstre. Deretter krysser åpningen og gjøre en andre pass fra øvre høyre til øvre venstre.
      2. Før binde suture, skylle ut arterien av veldig kort frigir skallen vaskulær klippet. Blod vil flyte ut av arteriotomy når klippet slippes, fjerne luft og gjenværende virus fra lumen.
      3. Trekk suture for å forsiktig lukke på arteriotomy og slips en Sutur 2 plassen knop.
        Merk: Trekke suture strammer føre bunching i vev som vil forstyrre flyten, øke trombose risiko og endre flyt som kan være en viktig ukontrollerte variabel i sykdom modeller.
    18. Slipp skallen vaskulær klippet, og deretter caudal vaskulær klippet bruke lett trykk med gasbind stoppe blødninger. Hvis blødningen vedvarer, fortsatt press for 1-2 min. Hvis arteriotomy ble riktig stengt, stopper blødning alltid innen denne tidsrammen.
    19. La hjelperen injisere buprenorfin [0.02 mg/kg; subcutaneous (SQ)] på omtrent denne tiden å gi postoperativ analgesi til fentanyl Plasmanivåer blir terapeutisk.
      Merk: En andre buprenorfin injeksjon (0.02 mg/kg; SQ) kanskje behøves 6 h etter første injeksjon å opprettholde analgesi til fentanyl Plasmanivåer blir terapeutisk.
    20. Gjenta virus infusjon protokollen venstre følgende 2.3.2 - 2.3.19.
  4. Såret nedleggelse
    1. Bruk en 5-0 PGA Sutur lukke midtlinjen fascia med en Sutur kontinuerlig.
    2. Med en 3-0 PGA Sutur, nær huden med en intradermal mønster med en nedgravd knute i begge ender.
  5. Postoperativ utvinning og rengjøring.
    Merk: Kaninen må overvåkes kontinuerlig for riktig oksygenering og kroppstemperatur når du gjenoppretter bedøvelsen. Gjenoppretting bør skje i et rolig og fredelig miljø.
    1. Slå av isoflurane og oksygen og fjerne ansiktsmaske fra kanin.
    2. Løsne IV væsker men forlate IV havnen i stedet for nødstilfelle IV tilgang.
    3. Ta kaninen til utvinning området og legge på sin side i et bur med en oppvarming vann teppe aktivert (eller eventuelt en Bair Hugger oppvarmet).
    4. Gi O2 av til SpO2 er stabil.
    5. La kaninen gjenopprette i et bur, bla det til den andre siden hver 15 min., til kaninen kan sitte på bakbena og flytte rundt.
    6. Når kaninen er mobile, kan du fjerne IV fra øret dens før retur til buret.
      Merk: Ikke tilbake kaninen til selskapet av annet dyrene før det er helt tilbake fra anestesi.
  6. Kast noe som hadde kontakt med vektor eller var i feltet operative, følgende aktuelle biohazard og sharps avfall protokoller.

3. genoverføring til kaninen felles carotis arteriene: post-operativ vare

  1. Vurdere kaninens generelle helsetilstand daglig etter kirurgi, sjekke for sårheling, bevis for infeksjon, appetitt, åndedrett og tegn på smerte.
    1. Sjekk kaninens øre holdning (ørene ned kan være et tegn på smerte eller ubehag, særlig når kombinert med en uryddig opptreden). Kontroller at kaninen forblir mobil og aktiv. Sjekk kaninen for normal respirasjon uten stridor. Kontroller at såret er ren, tørr og intakt. Sjekk kaninen for en normal kroppstemperatur. Kontakt veterinærtjenester hvis kaninen ikke er mobil og aktiv, normal kroppstemperatur, et ryddig utseende, en ren såret og normalt åndedrett.
    2. Sjekk for vanlig matinntak og bevis på fersk avføring og urin.
      Merk: Matinntaket kan reduseres etter operasjonen, men bør gå tilbake til normalt innen 2 dager; gir ekstra mat etter behov.
  2. Fjerne fentanyl oppdateringen postoperativ dag 3.
    Merk: Buprenorfin kan administreres som trengs for postoperativ smerte som ikke behandles av fentanyl, eller i tilfelle fentanyl oppdateringen fjernes tidlig.

4. terminal høste kirurgi: før operasjon

  1. Bedøve kaninen. Se avsnittene 1.3 og 1.3.5 om prestasjon og vedlikehold av anestesi.
    1. Veie kaninen. Kombinere 30 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazine i en sprøyte. Injisere ketamin/xylazine IM i paraspinous muskler å indusere anestesi.
  2. Forberede forberedelse rommet og eller tabeller stund venter for kaninen til å bli anesthetized.
    1. På OR forberedelse rommet: setup hårklippere og et vakuum for barbering kaninens hals og øre.
    2. I operasjonsstuen: setup overvåking utstyr og plassere sonder (SpO2, temperatur) på tabellen OR. forberede oksygen og isoflurane; knytte en gasbind stripe til ansiktsmaske å sikre den til kaninen og plassere masken på hodet slutten av tabellen.
      Merk: Gasbind strimler på ansiktsmaske skal ha 2 haler av ca 45 cm hver.
    3. Slå på oppvarming vann teppe i tabellen OR. Oppå vann teppet, Plasser en rullet håndkle for halsen støtte og dispersiv elektrode plate (senere plassert under kanin tilbake).
    4. Kombiner 1 mL av lidocaine HCl (2% stock) og 1 mL av bupivicaine HCl (0,5% stock) (50/50 mix) i en sprøyte som et lokale smertestillende.
  3. Når kaninen er fullt anesthetized, forberede kaninen kirurgi.
    1. Fjerne avføring fra endetarmen, som beskrevet i 1.3.1, slik at senere plasseringen av en temperatur probe.
    2. Barbere kaninen fra sternal hakk til vinkelen på mandible mens du bruker et vakuum for å holde området rent. Også barbere venstre bakre midten tå for puls-oximetry sonden.
      Merk: Protokollen forutsetter at kirurgen vil være kaninens høyre. Hvis OR oppsettet vil plassere kirurg på motsatt side, reversere sidene i dette trinnet å holde ledningene motsatt av kirurgen. Sidene av fremtidige trinnene skal også byttes etter behov.
    3. Transportere kaninen til OR og plasser supine i drifts tabellen med en rullet halsen støtte håndkle under kaninens halsen like nedenfor hodet. Forsiktig utvide kaninens hals før det er rett og ca vannrett.
    4. Feste kaninen til ansiktsmaske med O2 på 1 L/min, og start isoflurane administrasjon. Sikre masken ved innpakning endene av gasbind stripen knyttet til masken rundt halsen støtte håndkle under kaninen. Justere isoflurane (vanligvis 1-2%) for å opprettholde riktig anestesi for resten av prosedyren.
    5. Sikre dispersiv elektrode platen er midtstilt under kanin tilbake. Plasser temperatur og puls-oksymeter sonder.
    6. Holde kaninens forbena av løst knytte dem til tabellen.
      Merk: Plass eventuelt en liten plast tabell over kaninen til å beskytte kaninen mot å bli utsatt for brystet/abdominal press fra kirurgen lener seg på kanin brystet/underliv. Målet her er å hindre tvunget regurgitation av abdominal innholdet.
    7. Injisere 2 mL lidocaine (2% lagerløsning) / bupivacaine (0,5% lagerløsning) (50/50 blanding, fra trinn 2.4) subcutaneously langs planlagt snitt hals for lokalbedøvelse.
    8. Spray det kirurgiske området med betadine. Sette på ren hansker for kirurgiske prosedyren.

5. terminal kirurgi (fartøyet Harvest)

  1. Forbered instrumenter og kirurgiske feltet.
    1. Åpne en ren drapere pakke som inneholder tabellen drapere og en papir drapere for kaninen. Drapere tabellen instrument.
    2. Åpne instrumentet pack, plasser på tabellen instrument og ordne instrumenter. Plasser følgende utstyr på tabellen instrument: en 20 mL sprøyte og en 21G pinnen.
    3. Sikre electrocautery kabelen til det kanin drapere bruker den 7.25" Kantrowitz tang. Koble pluggen til elektrokirurgi enhet og slå den på.
    4. Fyll en 20 mL sprøyte med bakteriefri saline. Bruk denne saline behov for å holde eksponert vevet fuktig under prosedyren.
    5. Legg papiret drapere over kaninen og skjære hull i drapere over kirurgiske området på rabbit's halsen. Klemme hjørnene av hull i stedet for den kaninhud håndkle festing.
  2. Isolere felles carotis arteriene.
    Merk: 2 x kirurgisk forstørrelsesglass bør brukes for denne delen.
    1. Kutt huden med en electrocautery langs midtlinjen utvide ca 7-9 cm cranially mot kjeven og klemme huden åpen med håndkle klemmer.
      Merk: Hvis harvest er bare noen få dager etter forrige operasjonen, electrocautery er ikke nødvendig. Bare klippe bildet og trekk forsiktig åpne innsnitt fra tidligere kirurgi.
    2. Gjør en kort lateral klippe gjennom fascia med en electrocautery på caudal slutten. Sett inn store saks i kuttet og rett ut dissekere fascia langs hele midtlinjen. Kuttet dissekert fascia ned midtlinjen med electrocautery.
    3. Med liten dissecting saks, dissekere mellom V-formet musklene (sternocephalic muskel) og sternohyoidus muskelen over luftrøret, isolere felles carotis arteriene, på høyre side.
    4. Dissekere høyre subclavia gratis fra omkringliggende vev fra bunnen av halsen caudally til krysset av pharyngeal nerve cranially. Bruk kirurgisk silisium looper å hjelpe trekke arterien i disseksjon.
    5. Gjenta disseksjon til venstre (trinn 5.2.3 - 5.2.4).
    6. Med en 3-0 silke Sutur, ligate carotis communis skallen på segmentet som ble tilført vektoren (bruk adventitial Sutur plassert på første kirurgi å finne skallen omfanget av vektor infusjon. Deretter ligate carotis caudal å på reparert arteriotomy.
    7. Avgiftsdirektoratet carotis segmentet mellom ligations, og rødme lumen med saltvann. Klippe bort overflødig adventitial vev fra fartøyet og kutt carotis segmentet i mindre biter for de forskjellige endepunktet analyser (histology, DNA, ribonukleinsyre (RNA), protein, explant kultur, etc.).
    8. Injisere 1 mL av Beuthanasia IV å avlive, og Bekreft euthanasia av rabbit.
  3. Kast noe som hadde kontakt med vektor eller var i feltet operative, følgende aktuelle biohazard og sharps avfall protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å implementere denne metoden med tillit, er foreløpig eksperimenter nødvendig for å etablere at operatøren oppnår effektiv og reproduserbar genoverføring, transgene uttrykk i luminal endotelceller. I vår erfaring vurderes dette lettest ved hjelp av en vektor som uttrykker β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) flekker av felles carotis segmenter fjernet 3 dager etter vektor infusjon, samt måling av β-galactosidase mRNA (messenger RNA) med kvantitative omvendt transkripsjon polymerase kjede reaksjon (qRT-PCR), vil avdekke effektivitet, reproduserbarhet og plassering av transduced celler. For eksperimenter som undersøke effektene av transgene uttrykk eller måle aktiviteten av cis-fungerende transcriptional elementer, vi vanligvis måle transgene mRNA som en første indikasjon på nivå og reproduserbarhet av genoverføring.

En ny operatør i vårt laboratorium forsøkte å etablere ferdigheter med denne metoden ved transducing kanin felles carotis arteriene med en adenoviral vektor (2 x 1011 vp/mL) uttrykker en β-galactosidase transgene, drevet av en cytomegalovirus (CMV) arrangøren. Transduced arterier ble høstet 3 dager senere og ble skåret tvers i segmenter. Enkeltstående segmenter ble deretter enten skjære aksialt eller som intakt ringer. Alle segmentene var X-gal beiset i microcentrifuge rør. Segmenter som hadde blitt kuttet åpne aksialt ble plassert på en horisontal overflate og luminal overflaten maksimalt utsatt, med pins behov for å hindre segmentet curling opp. En face bilder av luminal overflater viste robust endothelial farging med X-gal (tall 3A og 3B). Aksial bilder av luminal overflater intakt carotis ringer viste X-gal flekker bare på luminal (tall 3 c og 3D). Segmentene som hadde vært åpnet aksialt ble behandlet i parafin, delt og mot farget med hematoxylin og eosin eller kjernefysiske rask rød. Bildene viser X-gal flekker i endotelet, men det er en liten mengde flekker i adventitial laget (tall 3E og 3F). Signaltransduksjon adventitial celler kan skje via lekkasje av vektor gjennom arteriotomy nettsted eller lekkasje via små greiner proksimale til områder av siden gren hemorroider. 29

I et eget eksperiment forsøkte en ny operatør å etablere ferdigheter i å oppnå reproduserbar nivåer av transgene uttrykk, som et forspill til eksperimenter sikte på å undersøke biologiske aktiviteter på effekter av transgener. Kanin felles carotis ble transduced med helper-avhengige adenovirus (2 x 1011 vp/mL) som inneholder enten en apo A-jeg (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) transgene, både under kontroll av en CMV promoter. Transduced arterier ble høstet 3 dager etter signaltransduksjon og skjær tvers i segmenter. RNA ble trukket ut fra fartøyet segmenter og apo A-jeg og IL-10 mRNA uttrykk kvantifisert ved qRT PCR, med normalisering til glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA i samme ekstrakter (Figur 4). HDAdIL10-transduced arteriene, bare 1 til 6 arterier hadde en svært lav, men synlig apo A-jeg mRNA signal. Mener uttrykk for apo A-jeg mRNA var 700-fold større i fartøyer transduced med HDAdApoAI enn i fartøy transduced med HDAdIL10. Lave nivåer av endogen IL-10 mRNA ble oppdaget i HDAdApoAI-transduced arteriene, med gjennomsnitt uttrykk økt 6-fold i HDAdIL10-transduced arterier. Av notatet er det betydelig intra - og inter - artery variasjon i signaltransduksjon effektivitet og transgene uttrykk, som vist i tall 3 og 4, henholdsvis. Vi finner denne variasjonen selv med erfarne operatører.

Figure 1
Figur 1 . Arteriotomy i arteria carotis communis. Fin tang brukes til å forstå arteria carotis adventitia og oppover trekkraft gjelder arterien. Denne manøveren utvider fartøyet lumen og genererer en loddrett overflate som bøyd 19G nålen settes inn, og dermed minsker risikoen for punktering bakveggen av arterien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Nedleggelsen av felles carotis arteriotomy. Arteriotomy er lukket med en 7-0 polypropylen Sutur, ved hjelp av en X-mønster. I første omgang nål og Sutur inn arterien lumen nederst rett i arteriotomy (området 1) og avslutter lumen nederst til venstre (siden 2). Nål og Sutur krysse arteriotomy og skrive inn lumen øverst til høyre (siden 3). Nålen avslutter lumen øverst til venstre (siden 4). Mild trekkraft på begge ender av suture lukker arteriotomy. Sutur endene (spennende fra 1 og 4-området) er knyttet med 2 plassen knop. Grå sirkler representerer områder av suturer passerer gjennom fartøyet veggen. Hele, blå linjer angir områder der suture utenfor fartøyet veggen. Stiplede blå linjer angir områder der suture innenfor lumen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Effektiv endothelial transgene uttrykk. Kanin felles carotis ble transduced med en adenoviral vektor uttrykke en β-galactosidase transgene og høstet 3 dager senere. Transduced arterie segmentene var X-gal farget som intakt ringer eller etter tilværelse åpen med en aksial kuttet. (A-B) No ansikt bilder av luminal overflater av carotis ringer som ble kuttet åpne aksialt. (C-D) Aksial visninger i luminal plass intakt carotis ringer. (E-F) X-gal farget, parafin-embedded carotis segmenter ble delt og mot farget (E) hematoxylin og eosin eller (F) kjernefysiske rask rød. Skala bar = 100 µm. Jeg = intima; M = medier; og = adventitia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Kvantifisering av transgene mRNA uttrykk. Kanin felles carotis ble transduced med helper-avhengige adenovirus uttrykke enten apo A-jeg (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) under kontroll av en CMV promoter. Arterier ble høstet 3 dager senere. mRNA uttrykk av (A) Apo-jeg og (B) IL-10 ble kvantifisert ved qRT PCR normalisert til GAPDH mRNA i samme arterien og uttrykt som vilkårlig enheter (AU). Måleren indikerer middelverdien; P er fra rang-sum test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fordeler Ulemper
Sammenlignet med gnager modeller Nærmere phylogenetically primater Dyrere å kjøpe og huset
Større genetisk mangfold, lettelser klinisk oversettelse Vanskeligere å avle og håndtere
Større fartøy kan lettere kirurgisk manipulasjon og gir mer vev for kvantitativ analyse Mer omfattende krav
Tillater bruk av endovascular-enheter som er utformet for mennesker Færre genmodifiserte bakgrunner
Mindre omfattende utvalg av antistoffer kanin proteiner
Sammenlignet med større dyremodeller Relativt billig å kjøpe og huset Muligens mindre klinisk relevant enn andre store dyr modeller for noen vascular sykdommer
Enklere å avle og håndtere
Sammenlignet med bakterie-line Transgenesis Transgene bare i store arterien; effekt av transgene spesielt på området rundt kan fastslås Bruk av metoden celler enn endotelet er vanskelig
Kan bruke kontralateral carotis som en tilkoblet; eliminerer systemisk parametere (f.eks., blodtrykk, kolesterolnivået) som ukontrollert variabler Operasjonsstuen og kirurgisk kompetanse kreves; kjernen fasiliteter sannsynlig ikke tilgjengelig
Høyere gjennomstrømming for testing DNA regulatoriske sekvens aktivitet i store fartøy endotelet Transgene uttrykkes ikke i de fleste vaskulær senger
Potensielt raskere og billigere
Systemisk eksponering transgene protein usannsynlig, minimerer off-målet effekter
Sammenlignet med systemisk genterapi tilnærminger
(f.eks. Leveren signaltransduksjon via eksterne blodåre injeksjon)		 Mer-stabil transgene uttrykk enn systemisk (lever) genterapi Vector levering krever kirurgiske inngrep
Transgene uttrykt i blodåreveggen, tillater lokal leveranse av høye nivåer av transgene protein Operasjonsstuen og kirurgisk ekspertisen som kreves
Systemisk eksponering transgene protein usannsynlig, minimerer off-målet effekter Behandling begrenset til arteriene som er spesielt beregnet for intervensjon; ikke behandle systemiske faktorer (f.eks., lipider)
Kan bruke kontralateral carotis som en tilkoblet; eliminerer systemisk parametere (f.eks blodtrykket, kolesterolnivået) som ukontrollert variabler
Langt lavere vector-dose nødvendig

Tabell 1. Fordeler og ulemper av kanin felles arteria carotis endothelial-selektiv genet overføre modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Visse aspekter av kirurgisk teknikk fortjener spesiell oppmerksomhet. Full eksponering og mobilisering av carotis communis via forsiktig disseksjon vil lette genet overføring og arteriotomy reparere. Men under dissection, bør direkte manipulering av arteria carotis minimaliseres for å unngå vasospasme. I tillegg blødninger tilstøtende til arterien bør stoppes ved å bruke lett trykk med gasbind og extravasated blod skal ryddes opp umiddelbart ved å rense området med vanlig saltvann. Det er også viktig å unngå å skade nervus vagus, som går parallelt med carotis. Trimmer adventitia innen den planlagte arteriotomy vil hjelpe operatøren både å utføre en rent og funksjonelt arteriotomy og reparere arteriotomy. Endelig må grener av carotis identifiseres og sikkert samskrevet for å forhindre lekkasje av vektoren fra carotis lumen.

Det er også viktige sider ved vektor infusjonen og arteriotomy reparasjon. Under vektor infusjonen er det viktig å distend carotis communis til fysiologiske eller litt større caliber å oppnå effektiv signaltransduksjon. Når reparasjon av arteriotomy, skal suture trenge fartøyet veggen så nær som mulig til kantene av arteriotomy, og bør rent angi og avslutte lumen stedet aksialt passere fartøyet veggen. Hvis bare de ytre lag av fartøyet veggen er trukket sammen fordi suture passerer aksialt fartøyet veggen stedet passerer radielt gjennom veggen og inn i lumen, et gap vil forbli i intima og risiko for trombose vil øke. Hvis det suture Gjennomføringer er for stor avstand mellom, eller hvis suture over strammet når knyttet, opprettes vev folder på arteriotomy stedet. Disse folder forstyrre normal laminær blodstrøm, også øke trombose risiko. Opprettholde konsekvent flyt er viktig for eksperimenter utført i dyremodeller sykdommer (f.eks., aterosklerose) fordi endret flyt kan bidra til sykdommen prosessen30.

Nye operatører støte ofte thrombosed arterier på harvest. Luminal blodpropp er en ødeleggende komplikasjoner, rendering arterien ubrukelig som en eksperimentell prøve. For å forhindre blodpropp, administrere vi rutinemessig IV heparin før genoverføring. Blodpropp er også forebygges ved forsiktig nedleggelsen av arteriotomy, som beskrevet ovenfor. Heparin dosering kan økes for å forhindre blodpropp eller aspirin kan gis postoperatively. Imidlertid en høyere dose av heparin vil også øke potensialet for blødning komplikasjoner og aspirin kan forstyrre eksperimentelle sluttpunktene, spesielt hvis betennelse blir studert. Derfor er det best å fokusere på forbedret kirurgiske teknikken som et middel for å forebygge trombose.

Hvis manipulert for kraftig, kan carotis arteriene gjennomgå krampe, som også bidrar til blodpropp ved å redusere flyten. Hvis vasospasme, kan det bli avløst av anvendelsen av aktuelle papaverine. Når fartøyet avlinger er planlagt for mer enn 2-3 dager etter signaltransduksjon og blodpropp er en bekymring, kan transkutan ultralyd brukes til å vurdere noninvasively fartøy patency. Oppdagelsen av thrombosed arterier kan føre til euthanasia for å spare på boliger kostnader. Flere dyr kan også være registrert raskt, for å fylle eksperimentelle grupper. Peri - og post - intervention dødelighet forbundet med denne metoden bør være < 1% (dvs., ikke forskjellig fra dødelighet relatert til andre operasjoner utført på sunn kanin)31.

Etter en operatør blir komfortabel med de tekniske aspektene av kirurgisk-protokollen, en evne til å utføre effektive genoverføring til endotelet må bekreftes, bruke tilnærminger som er beskrevet i delen ovenfor på representant resultater. Hvis det oppstår problemer med å oppnå reproduserbar genoverføring, er skyldige sannsynligvis i en av to områder. Når fartøyet er isolert og blod er vasket lumen, er det viktig å fjerne vaskebuffer DMEM slik at infundert vektor løsningen ikke forsvinner under signaltransduksjon. Den andre viktig aspekten er å distend båten til fysiologiske eller litt større caliber under vektor infusjonen. Fordi, i vår erfaring, har en arteria carotis som ikke er fullt oppblåst eller ikke forblir distended under 20 minutters infusjon pålitelig lave transgene uttrykk, er det sannsynlig at distensjon av arterien til fysiologiske caliber forbedrer signaltransduksjon effektivitet. Men har vi aldri studert dette systematisk. Det er mulig at økende infusjon press over fysiologiske nivåer kan øke signaltransduksjon effektiviteten og også tillate høyere nivåer av signaltransduksjon celler i vaskulær media. Imidlertid vil avbrudd av endothelial barrieren sannsynligvis skade fartøyet og øke risikoen for trombose. Hvis skipet ikke forblir distended for hele 20 minutters vektor-vekst, er det sannsynlig at vektoren lekker fra grener av carotis. Vær forsiktig under disseksjon å identifisere og ligate alle grener for å forhindre lekkasje av vektoren fra carotis lumen.

Denne metoden har flere begrensninger som gjelder bruk av kanin. Kanin er billigere å huset og mate enn andre store dyr (hundene, pigs, sau); men kostnadene ved innkjøp, bolig og fôring kanin er betydelig mer enn for mus og rotter. Operasjonssalen fasiliteter og krav for kanin inngrep er også langt mer omfattende enn for gnagere. I tillegg er omfattende tekniske ekspertise nødvendig å utføre overføringsprotokollen kirurgisk genet effektivt. Denne ekspertisen kan erverves av operatører som har hatt noen formell kirurgisk opplæring. Minst 2 personer i vår gruppe (inkludert den primære forfatteren av dette manuskriptet) har lært kirurgiske teknikker og brukte dem produktivt. Likevel er grundig opplæring og en forsiktig validering av en operatørens genet overføring effektivitet og reproduserbarhet (som beskrevet i delen representant resultater) nødvendig før operatøren kan generere høy kvalitet data.

Confinement transgene uttrykk nesten utelukkende til endotelet med denne metoden29,32,33,34,35,36,37 er nyttig ved at den tillater undersøkelse av transgene effekter i endotelceller og måling av aktivitet av cis-fungerende DNA regulatoriske sekvenser i endotelceller. Et lite antall adventitial eller mediale celler kan være transduced; men hindrer russernes denne metoden å effektivt transduce nonendothelial celler bruk av metoden til studiet av andre typer vaskulære veggen celler (som glatt muskelceller og makrofager). Selv om overuttrykte utskilles proteiner fra transduced endotelceller kan tillate undersøkelse av effekten av disse proteinene på andre vascular celle skriver, rollene til ikke-utskilles proteiner i disse andre vaskulær celletyper (f.eks. reseptorer eller proteiner involvert i signaltransduksjon) kan ikke undersøkes med denne metoden.

Som et middel for å teste arterien veggen målrettede genterapi, metoden skiller seg fra andre prekliniske metoder på to viktige måter. Først benytter metoden en kanin modell for i vivo testing av genterapi stedet mer vanlig gnager modeller,8,,12,,15,,38,,39. Bruk av kaniner kan vurdering av transgene uttrykk og biologiske rollen av transgene produktet i en outbred dyr modell, som er mer representativt for menneskelig genetisk mangfold enn er innavlet gnagere. Modellen kan brukes til å vurdere genterapi i enten normal kanin arterier eller kanin arteriene som har arteriell patologi som ligner som syke menneskelige arterier. Kanin arterier også nærmere i størrelse menneskelige arterier enn gnager arterier og gir langt mer vev analyse enn finnes fra gnager arterier. Den andre store forskjellen er at denne metoden bruker en kirurgisk tilnærming til å levere transgene vektor til vaskulære endotelet. Somatiske genterapi leveres ofte systemisk, oftest av målretting leveren med mål om å endre Plasmanivåer av transgene protein25,40. Ved målretting vaskulære endotelet, gir metoden terapeutiske transgene produktet lokalt, topp konsentrasjonen i blodåreveggen, akkurat der det trengs for vaskulær sykdom behandling. Ved å levere transgene bare lokalt, eliminerer metoden systemisk bivirkninger av transgene produktet. Andre grupper utvikler metoder med peptider, antistoffer eller andre kapsid endringer for målretting systemisk injisert vektorer til sunn eller syke endotelet for å gi lokale vaskulær gene terapi41,42 , 43. imidlertid disse målretting metoder er fortsatt under utvikling, og er fortsatt komplisert av betydelig systemisk transduction, spesielt i leveren42,43,44. Vår kirurgisk metode gir en presis og effektiv innføring av effekter av transgener vaskulære endotelet med minimal - om noen - signaltransduksjon andre steder. 1 metoden er også en mer praktisk, effektiv og høyere-gjennom bety (sammenlignet bakterie-line transgenesis eller systemisk injeksjon av endothelial målrettede vektorer) for testing aktiviteten til regulatoriske DNA-sekvenser i store fartøyet endotelet, for testing transgene protein funksjon i blodåreveggen og testing fartøyet veggen-målrettede genterapi.

Denne metoden tillater undersøkelse av biologiske rollen som noen transgene, når det er uttrykt i store arterien endotelet. Hvis endret å uttrykke tap-av-funksjon reagenser som dominerende negative reseptorer eller kort hårnål RNA, ville det tillater gransking av rollene som endogene endothelial proteiner og signalnettverk trasé. Metoden kan også brukes til å måle transcriptional aktiviteten til en SUS-fungerende DNA sekvens i store arterien endotelceller5,6,7. I tillegg metoden gjør testing av alle typer genet overføring vektor for effektivitet og sikkerhet når leveres lokalt til endotelet, og vil avdekke muligheten av vektoren å oppnå varig transgene uttrykk. Endelig, metoden lar utvikling og testing av kombinasjoner av vektorer og effekter av transgener som er utformet for å levere vaskulære veggen målrettede genterapi. Metoden kan tjene som en screening verktøyet for å identifisere terapeutiske gener som kan i fremtiden-bli levert til endotelet av alle store arteriene (eller alle syke store arterier) av percutaneously injisert vaskulære veggen målrettede vektorer. På grunn av eksisterende immunitet hos mennesker til adenovirus type 545, vil det bli utfordrende for å bruke adenovirus type 5-baserte vektorer i kliniske applikasjoner. Prosjektering av adenovirus 5 kapsid, bruk av alternativ adenovirus serotyper46eller bruk av mindre immunogenic vektorer som AAV måtte bringe vaskulær genterapi til klinikken. Som en eksperimentell verktøy, men er vi klar over enhver vektor som kan konkurrere med helper-avhengige adenovirus 5 å oppnå og varig transgene uttrykk i blodkar1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker AdVec, Inc. for tillatelse til å bruke HDAd reagenser, Julia Feyk for administrativ hjelp og Institutt for sammenliknende indremedisin veterinary tjenestene for kirurgiske råd og støtte. Dette arbeidet ble støttet av HL114541 og John L. Locke, Jr veldedig tillit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24G x 3/4" Terumo Medical Products SROX2419V
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery only
21G needle Becton Dickinson 305165 For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4" Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182 Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A Gene transfer surgery only
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498 Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 05098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine HCl, 2% Pfizer 00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5% Pfizer 00409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL  Patterson Veterinary 12496075705 Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr  Apotex Corp. NDC 60505-7006-2 Gene transfer surgery only
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
Gene transfer vector Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900 Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412 Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496 Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm Roboz 2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Forced air warming unit 3M Bair Hugger Model 505 Gene transfer surgery only
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2 Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 Needs ~16x magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
  2. Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
  3. Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
  4. Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
  5. Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
  6. Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
  7. Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
  8. Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
  9. Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
  10. Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
  11. Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
  12. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
  13. Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
  14. Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
  15. Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
  16. Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J. Experimental atherosclerosis in rabbits. Arq Bras Cardiol. 95 (2), 272-278 (2010).
  17. Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
  18. Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
  19. Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
  20. Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
  21. Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
  22. Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
  23. Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
  24. Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
  25. Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
  26. Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
  27. Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
  28. Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
  29. Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
  30. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
  31. Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
  32. Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A. Endothelium-specific in vivo gene transfer. Circ Res. 77, 475-485 (1995).
  33. Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
  34. Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
  35. Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
  36. Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
  37. Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
  38. Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
  39. Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
  40. Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
  41. Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
  42. Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
  43. White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
  44. Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
  45. Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
  46. Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).

Tags

Medisin problemet 135 dyr modeller for menneskelig sykdom atherosclerosis endotelet genterapi translational studier kanin carotis communis vaskulær sykdom adenovirus
<em>I Vivo</em> Genoverføring til kaninen felles arteria carotis endotelet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wacker, B. K., Bi, L., Dichek, D. A. … More

Wacker, B. K., Bi, L., Dichek, D. A. In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium. J. Vis. Exp. (135), e56982, doi:10.3791/56982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter