Summary
Denna metod är att införa en transgen i endotel kanin halspulsåder. Införandet av transgenens tillåter bedömning av transgenens produkten antingen i normala artärer eller sjukdomsmodeller biologiska roll. Metoden är också användbar för att mäta aktiviteten av regulatoriska DNA-sekvenser.
Abstract
Målet med denna metod är att införa en transgen i endotel isolerade segment av både kanin gemensamma halspulsåder. Metoden uppnår fokal endothelial-selektiv genmodifiering, vilket innebär att en utredare att bestämma de biologiska rollerna av endothelial-uttryckta transgener och kvantifiera invivo transkriptionell aktiviteten av DNA-sekvenser i stora artär endotelceller. Metoden använder kirurgiska isolering av kanin gemensamma halspulsåder och en arteriotomin för att leverera en transgenens-uttryckande viral vektor i arteriell lumen. En kort inkubationstid av vektorn i lumen, med efterföljande aspiration av lumen innehållet, är tillräckligt för att uppnå effektiv och slitstark uttryck för transgenens i endotel, utan påvisbara transduktion eller uttryck utanför de isolerade arteriell segment. Metoden tillåter bedömning av transgenens produkter biologiska verksamhet både i normala artärer och i modeller av human vaskulär sjukdom, samtidigt undvika systemiska effekter som kan orsakas antingen av inriktning gen leverans till andra webbplatser (t.ex. levern) eller av den alternativa metoden för att leverera genetiska konstruktioner till endotelet av germ line genmodifiering. Tillämpningen av metoden begränsas av behovet av en skicklig kirurg och narkosläkare, ett välutrustat operationssalen, kostnaderna för inköp och bostäder kaniner, och behovet av expertis i genöverföring vektorn konstruktion och användning. Resultat som erhålls med denna metod inkluderar: transgenens-relaterade förändringar i arteriell struktur, cellularitet, extracellulär matrix eller vasomotoriska funktion; ökning eller minskning av arteriell inflammation; förändringar i vaskulära cell apoptos; och progression, utvecklingsstörning eller regression av sjukdomar som intimans hyperplasi eller åderförkalkning. Metoden kan också mätning av infödda och syntetiska regulatoriska DNA-sekvenser förmåga att förändra transgenens uttryck i endotelceller, som ger resultat som innehåller: nivåer av transgenens mRNA, nivåer av transgenens protein och nivåer av transgen enzymaktivitet.
Introduction
Målet med denna metod är att införa en transgen i endotel kanin gemensamma halspulsåder. Införandet av transgenens tillåter bedömning av produktens transgenens biologiska roll såväl i normala artärer kanin modeller av mänsklig arteriell sjukdom. Överuttryck av transgenens i sjukdomsmodeller kan avslöja om transgenens (och dess proteinprodukt) visar löfte som terapeutiska medel1,2,3,4. Införandet av cis verkande reglerande element i transgenens uttryck kassett gör bedömning av aktiviteten av dessa element i arteriell endotel i vivo5,6. Kunskap av aktiviteten hos särskilda cis verkande reglerande faktorer kan användas för att utforma mer aktiva uttryck kassetter och sond mekanismer för genreglering i stora artär endotel i vivo7.
Kaniner är en värdefull modell för olika aspekter av människans vaskulär fysiologi och sjukdom. Kaniner har många gemensamma vaskulär funktioner med människor. Till exempel är hematologiska utgångsvärden, hemostatiska förordning och vaskulär längsgående spänning liknande mellan kaniner och människor8. Kanin modeller av vaskulära sjukdomar replikera nyckelfunktioner till många sjukdomar inklusive: aneurysm (liknande geometriska och flödesegenskaper)9, vasospasm (liknande svar på endovaskulär behandling)10,11, och åderförkalkning (intimans plack med liknande funktioner inklusive en kärna som är rik på lipider, makrofager och smidig muskel cellerna i en fibrös cap)12,13. Följaktligen kanin modeller har utvecklats för många vaskulära sjukdomar såsom trombos, vasospasm, aneurysm, diabetes, vaskulär transplantat stenos och åderförkalkning8,13,14, 15,16.
För forskare att välja bland djurmodeller av vaskulär fysiologi och sjukdom, har kaninen flera fördelar. De större fartygen av kaniner jämfört med gnagare, och kan lättare kirurgisk manipulation, användning av utrustning för transluminal och en större mängd vävnad för kvantitativa mätningar. Kaniner är mycket närmare fylogenetiskt primater än gnagare17, och den största genetiska mångfalden av utkonkurrerat dö ut kaniner bättre approximerar den genetiska variabilityen av människor. Genetisk mångfald är särskilt viktigt för prekliniska studier, som-genom sin natur-målet att utveckla terapier som kan tillämpas på den genetiskt olika mänskliga befolkningen. Som med många om inte alla andra modell arter, kanin gener är enkelt klonade eller syntetiseras eftersom kanin genomet har varit sekvenseras med hög täckning (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Jämfört med andra stora djurmodeller (t.ex. hundar, grisar eller får), kaniner är relativt billiga att köpa och hus och de är lättare att föda upp och hantera. Specifika kärlsjukdom modeller i kaniner varje har sina egna fördelar och brister som modeller för humana sjukdomar som ligger utanför tillämpningsområdet för detta manuskript8,12,18. En utredare bör granska dessa fördelar och brister att avgöra om kaninen är den bästa modellen för att besvara en specifik experimentella fråga.
Införandet av deoxiribonukleinsyra (DNA) reglerande sekvenser i endotelceller i vivo möjliggör undersökning av aktiviteten av dessa sekvenser i en komplex fysiologisk miljö. In vitro -studier med transfekterade endothelial celler kan vara användbar för den första bedömningen av regulatoriska DNA-sekvenser; dock återges uttrycksnivåerna i vävnadsodling modeller ibland inte när studierna är upprepade i vivo5,19,20. In vitro -system kan också vara användbart för att utforska grundläggande vägar av protein signalering och endotel fysiologi samt kommunikation mellan odlade vaskulära celler; dock studeras mer komplexa vägar eller regleringsnät som påverkas av komplexa populationer av angränsande vaskulära celler eller immunsystemet bäst i en in vivo system6,20. Den metod som beskrivs häri ger en plattform för att utforska reglering av transgenens uttryck i endotel inom kontexten av en intakt fartyg, med eller utan sjukdom. I vivo systemet möjliggör också undersökning av fysiologiska och patologiska cellulära överhörning och identifiering av bidrag av immunförsvaret att regleringen av gen uttryck6.
Grodden-line genmodifiering (särskilt i möss) är en alternativ metod för att styra transgenens uttryck till endotelceller. Detta tillvägagångssätt kan ge livslånga transgenens uttryck, endothelial inriktning medieras av specifika promotorn eller regulatoriska regioner21,22. Generering av transgena möss är tidskrävande och dyra dock, flera transgena linjerna måste testas ofta så målinriktning av transgenens till önskad celltyp och uppfyllandet av adekvat transgenens uttryck nivåer, och experimentella resultat i murina system kan vara stam-beroende. Murina transgena modeller med endothelial riktade transgener har många fördelar: det finns ingen anledning att operera på varje experimentella djur för att uppnå genmodifiering, experimentell möss kan uppvuxna med många andra tillgängliga transgena möss i för att testa genetiska och fenotypiska interaktioner, och det finns ett brett urval av antikroppar som reagerar med murina proteiner, underlätta karaktärisering av fenotyper. Dock inriktning av transgener till endotelet via könsceller vanligen resulterar i transgenens uttryck i hela kärlsystemet,22 vilket gör det svårt att avgöra den plats där transgenens produkt agerar. Detta är särskilt sant när transgenens produkten utsöndras, eftersom en transgenens produkt utsöndras av endotelceller i hela vaskulatur kunde ha biologisk aktivitet på valfritt antal platser inom ett djur. Även om den metod som beskrivs i detta manuskript kräver teknisk expertis och specialiserade anläggningar, kan det vara mindre tidskrävande och mindre kostsamt än att utveckla en endothelial-specifika transgena möss linje. Det tillåter för bedömning av funktionen hos ett protein selektivt i endotelceller i ett segment av stora artär, och den tillåter användning av den kontralaterala gemensamma halspulsådern som Parade kontroll (eliminera systematiska faktorer som kan variera bland experimental djur-exempelvis blodtryck eller kolesterolnivåer-som okontrollerad variabler).
Genterapi är en lovande strategi för behandling av vaskulära sjukdomar, särskilt kroniska sjukdomar, eftersom en enda ansökan kan ge ihållande eller möjligen livslångt uttryck för en terapeutisk gen23. Terapeutiska löftet om genterapi har undersökts i djurmodeller av somatiska genöverföring, ofta inriktning lever24,25, vilket är ett relativt enkelt mål eftersom många blodburna virala vektorer är hepatotropic. Men för att ha en effekt på vaskulär sjukdom, måste genterapi riktade till levern uppnå systemiska överuttryck av proteiner. Detta kräver vanligtvis stora doser av vektor, som kan vara giftiga eller jämn dödlig26. Dessutom ökade systemiska nivåer av ett protein höjer risken för off-target biverkningar, vilket kan komplicera eller ens dölja tolkning av experimentella resultat. Lokala genterapi inriktning vaskulära endotel som beskrivs i detta manuskript kunde undvika systemiska biverkningar eftersom infunderas vektorn inte är spridning bortom det transduced arteriell segmentet, och lokala vaskulära effekter kan uppnås utan förändringar i systemisk plasmanivåer av protein. 27 dessutom en betydligt lägre mängd vektor som behövs för att transduce en arteriell segment än som behövs för att uppnå robust nedsatt transduktion. Transgenens uttryck från levern har rapporterats minska över tid, förmodligen på grund av cellens omsättning, som kräver upprepad dosering om hög nivå transgenens uttryck är att bibehållas. 28 däremot den låg Omsättningshastigheten på endotelet ger stabilt uttryck för minst 48 veckor i chow-matade kaniner och i minst 24 veckor i aterosklerotiska lesioner av kolesterol-matade kaniner. 1 , 27
För att avgöra om denna metod för genöverföring till kanin gemensamma halspulsådern endotelet är lämpliga, övervägas fördelar och nackdelar (tabell 1) inom ramen för de särskilda forskning mål. Fördelarna med denna metod är: utkonkurrerat dö ut kaniner är bättre företrädare för mänskliga genetiska mångfalden än inavlade möss (viktigt för prekliniska arbete); kaniner ge större fartyg för lättare manipulation och mer vävnad för analys. metoden kan uppnå endotel-riktade transgenens uttryck långt snabbare än gör groddar-line endothelial inriktning på transgena möss; Vector dos kan enkelt justeras till modell variabla nivåer av transgenens uttryck. processer som är specifika för stora-artär endotelet kan utredas. och lokala vaskulär genmodifiering gör motsatt halspulsådern på samma djur som ska användas som en kontroll, eliminera systematiska faktorer som okontrollerad variabler. Nackdelarna inkluderar: särskilda anläggningar och expertkunskaper krävs; färre genetiskt modifierade bakgrunder att experimentera på finns i kaniner än i möss; och det finns en mindre omfattande urval av antikroppar mot kanin kontra musproteiner (för immunodetection av transgenens protein och andra antigener som kan vara viktiga i tolkningen av experimentella resultat).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här godkändes av University of Washington Office av djurskydd och tillhörande institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC), och färdigställdes i enlighet och efterlevnaden av alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer.
Obs: Genöverföring till kanin gemensamma halspulsåder utförs på kaniner av en kirurg med hjälp av en anestesiolog eller assistent.
1. genöverföring till kanin gemensamma halspulsåder: före operationen
- Söva kaninen. Väg kaninen. Kombinera 30 mg/kg ketamin och 2 mg/kg xylazin i en spruta. Injicera ketamin/xylazin intramuskulärt (IM) i paraspinous musklerna att inducera anestesi.
- Väntan på kanin att bli sövd, förbereda beredningslokalen och operationssalen (OR) tabeller.
- I beredningslokalen OR: placera den oftalmologiska salvan och fentanyl plåstret inom räckhåll tabellen förberedelse; Ställ in hårklippningsmaskiner och ett vakuum för rakning kaninens nacke och öra; avsätta en alkohol prep pad, en 24G x ¾ ”kateter, en injektionsport och kirurgisk tejp för att säkra intravenösa (IV) i kaninens öron anda.
- I OR: Ställ in utrustningen och placera sonderna [elektrokardiogram (EKG), syremättnad (SpO2), temperatur] på tabellen OR; förbereda syre och isofluran; binda gasväv remsa till ansiktsmask att säkra det till kaninen och placera masken på huvudändan av bordet.
Obs: Gasbinda remsor knutna på ansiktsmasken bör ha 2 svansar av cirka 45 cm vardera. - Slå på värmande vatten filten på tabellen OR. Ovanpå vatten filt, placera en rullade handduk för nackstöd och en dispersiv elektrod platta (senare placeras under kaninens rygg).
- Ställa in eller IV pumpen med 100 mL av en saltlösning IV-väska med ett 18-19G nål fäst och ställa in flödet till 10 mL/h per kg.
- Kombinera 1 mL lidokain HCl (2% stamlösning) och 1 mL bupivicaine HCl (0,5% stamlösning) i en spruta, att användas som en lokal smärtstillande.
- När kaninen är fullt anesthetized, förbereda kaninen för kirurgi.
Obs: Kontrollera för avsaknaden av en pedal reflex (nypa en tå, leta efter lem uttag) att säkerställa bedövningsmedel djup, och fortsätta att övervaka pedal reflexen under hela operationen.- Tillämpa oftalmologiska salva till ögonen. Ta bort avföring från kaninens ändtarmen genom att trycka med behandskade fingrar på nedre främre delen av buken (ovanför ändtarmen) och rörliga fingrar mot anus. Detta kommer att möjliggöra senare placering av en rektal temperatursond.
- Raka främre halsen från sternala skåran till kanten av underkäken samtidigt med en dammsugare för att hålla området rent. Även raka båda öronen för IV placering och fentanyl plåster kvarstad, och raka en vänster bakre mellersta tå för pulsoximetri sonden.
Obs: Protokollet förutsätter att kirurgen är kaninens höger för hela förfarandet. Om inställningen för OR lägger kirurgen på motsatta sidan, vända sidor i det här steget att hålla trådarna och IV mittemot av kirurgen. Sidorna av framtida åtgärder bör också kopplas som behövs. - Torka i vänster öra med en alkohol prep pad, placera en 24G IV katetern i vänster öra ven, keps med injektion hamnen och tejpa den kateter/porten på kaninens öron att säkra det. Applicera en fentanyl plåster (25 µg/h) till kaninens högra öra.
- Transportera kaninen till eller och placera liggande på operationsbordet med valsade hals stöd handduk under kaninens nacke strax under huvudet. Försiktigt förlänga kaninens nacke tills den är rak och ca horisontella.
- Krok kanin upp till ansiktsmasken med O2 på 1 L/min och starta isofluran administration. Säkra masken genom att Linda ändarna av gasväv remsan knutna till masken runt halsen stöd handduken under kaninen. Justera isofluran (vanligen 1-2%) vid behov (baserat på hjärtfrekvens, andningsfrekvens och pedal reflexen) att upprätthålla korrekt anestesi för återstoden av förfarandet.
- Säkerställa att dispersiva elektroden plattan är centrerad under kaninens rygg. Temperatur och pulsoximeter sonder och tillämpa EKG leder till kaninen.
- Koppla upp IV koksaltlösning till katetern porten i kaninens öron, uppstart av saltlösning pumpen på 10 mL/h per kg.
Obs: Efter 1 h, saltlösning pumpen kan minskas till 5 mL/h per kg. - Hindra kaninens frambenen genom att löst knyta dem till bordet. Du kan också placera en liten plast bord över kaninen att skydda kaninen från att utsättas för bröstet/buktryck från kirurgen lutande på kaninens bröstet/magen.
Obs: Det lilla bordet kan förebygga Tvingad uppstötningar av buken innehåll. - Injicera 2 mL tidigare beredda lidokain (2% lager) / bupivakain (0,5% lager) (50/50 mix) subkutant längs den planerade snitt nacken för lokalbedövning.
- Låt assistenten förbereda operationsområdet med 3 omväxlande scrubs av klorhexidin och isopropanol och sedan en spray med betadine. Scrub, klänning och handske, efter korrekt aseptisk teknik.
Obs: Kirurgen bör vara klädd 2 x kirurgiska luppar till stöd med första halvan av operationen. Det är mycket viktigt att upprätthålla sterilitet av kirurgen och operationsområdet under överlevnad operationen. Endast assistenten ska hantera icke-steril objekt och steriliserat material måste skickas till kirurgen aseptiskt eller placeras på tabellen draperad instrument. Sterila handdukar kan användas av kirurgen för att upprätthålla sterilitet medan manipulera icke-steril utrustning såsom mikroskopet.
2. överlevnad kirurgi (genöverföring)
- Utarbeta instrument och sterila fältet.
- Låt assistenten öppna den sterila duk pack som innehåller en tabell drapera, ett papper drapera för kaninen, och flera handdukar. Aseptiskt överföra artiklarna till kirurgen.
- Drapera tabellen instrument. Plats 6 sterila handdukar och papper drapera till tabellen draperade.
- Med 4 handdukar, drapera kaninens nacke, lämnar bara operationsområdet utsatt (ca 4 cm x 10 cm). Lägg papper drapera över kaninen.
- Låt assistenten öppna steriliserade instrument förpackningen och placera aseptiskt på tabellen instrument.
- Låt assistenten öppna följande utrustning och aseptiskt placera på tabellen instrument eller hand till kirurgen: tre 1 mL sprutor (och en nål om sprutorna inte redan har lästs in med nålar), en 20 mL spruta, en 21G nål, en 19G nål, 3-0 polyglycolic syra (PGA) sutur, 5-0 PGA sutur, 7-0 polypropylen suturen och två 24 G IV-katetrar.
- Säkra diatermi kabeln till kanin drapera använder den 7,25 ”Kantrowitz pincett och sedan släppa kontakten avslutas utanför tabellen. Låt guiden Anslut kabeln till den elektrokirurgiska enheten och slå på strömmen.
- Fyll en 20 mL spruta med steril koksaltlösning, dras från en IV väska eller injektionsflaskan innehas av assistenten. Använd denna saltlösning som behövs för att hålla exponerade vävnaden fuktig under förfarandet.
- Förbereda en 1 mL spruta med 1 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM, för att tvätta artären). För varje halspulsådern som kommer vara sensorik, behövs 0,35 mL utspädd virus. Om samma virus används för båda sidor, förbereda en 1 mL spruta med virus utspätt i DMEM till 0,7 mL volym. Om olika sidor får olika virus [till exempel en ”Null” virus kontroll på ena sidan], förbereda två 1 mL-sprutor, var och en med 0,35 mL virus lösning. För helper-beroende adenovirus, virus koncentrationen är 2 x 1011 viruspartiklar (vp) / mL.
Obs: Låt assistenten förbereda viruset. Kirurgen ritar upp DMEM och virus fjädring i sterila sprutor. - Skär ett hål i drapera. Storleken på hålet bör vara samma storlek som den kirurgiska platsen på kaninens nacke som ramas in av handdukar i steg 2.1.3. Klämma i hörnen av hålet i papper drapera till de underliggande handdukar som är draperad över kaninens nacke med handduk klämmorna.
- Isolera gemensamma halspulsåder.
Obs: 2 x kirurgiska luppar bör användas för denna del.- Skära i huden med en diatermi längs mittlinjen sträcker sig ca 7-9 cm cranially mot underkäken och klämma den hud öppen med handduk klämmor.
- Göra ett kort laterala snitt genom fascian med diatermi i kaudala slutet. Sätt sedan in stora saxen i snittet och rakt på sak dissekera fascian längs hela mittlinjen. Skär dissekerade fascian ner mittlinjen med diatermi.
- Med liten dissekera sax, dissekera mellan V-formade muskler (sternocephalic muskel) och sternohyoid muskler över luftstrupen, att exponera gemensamma halspulsåder, börjar på höger sida.
- Dissekera den fria från omgivande vävnader, dividera alla grenar, från basen av halsen caudally till passage av faryngeal nerven cranially just gemensamma halspulsådern. Använd kirurgisk kisel loopar till stöd i Upprullningskraften artären under dissektion.
Obs: Bör vara försiktig att inte störa vagusnerven som löper parallellt med den gemensamma halspulsådern eller mindre nerverna som korsar över den gemensamma halspulsådern. - Ligera några stora grenar som kommer från den gemensamma halspulsådern (1-2 per sida) med 5-0 silk suturer före styckning grenen distalt för att frigöra en 4-5 cm segment av halspulsådern. Skär sammanskrivna grenar 1-2 mm från slips så att slipsen inte glider av.
- Upprepa dissektion på vänster sida (steg 2.2.3 - 2.2.5).
- Ingjuta vektorer i gemensamma halspulsåder.
Obs: Kirurgiska Mikroskop (16 X) används som behövs för att utföra arteriotomin, infusion vektor-och/eller kontrollösning och arteriotomin reparation.- Låt assistenten bort de kirurgiska luppar från kirurgen och flytta det kirurgiska mikroskopet till position. Drapera en steril handduk över mikroskopet att möjliggöra manipulation av mikroskopet utan att förorena det sterila fältet.
- Injicera heparin [150 internationella enheter (IE) /kg] i IV katetern och spola med 10 mL koksaltlösning.
- Återvänder till den isolera just gemensamma halspulsådern, sätta två siden band runt den mellersta del av segmentet mobiliserade halspulsådern och knyta en enkel överhandsknop på varje - utan skärpa dessa.
- Böja 19G nålen strax ovanför avfasningen till ca 80° med stor nål-drivrutinen (böj inte avfasningen; (Se figur 1).
- Klämma artären på varje ände av segmentet isolerade med vaskulär klipp, utsläppande kraniala klippet först för att möjliggöra artär fyllning och sedan placera kaudala klippet.
- Punktera den gemensamma halspulsådern med böjda 19G nålen bara kraniala av stjärtfenan vaskulär klippet, tar stor omsorg att inte punktera rygg eller sida väggarna. Avancera nålens spets in i lumen och dra tillbaka två gånger för att kontrollera arteriotomin helt färdas genom kärlväggen. Sedan försiktigt dra ut injektionsnålen.
Anteckningar: Det är viktigt att skapa en arteriotomin som penetrerar alla lager i kärlväggen renlig och inte att dissekera kärlväggen (genom att passera axiellt genom den adventitia och media). För att åstadkomma detta, ska halspulsådern punkteras med kanylspetsen placerad så nära som möjligt till en 90° vinkel mot kärlväggen (figur 1). Halspulsådern punktering i 90° vinkel är understödda av högintressant artären av adventitia med fin pincett och försiktigt lyfta artär ytan medan du trycker på spetsen av nålen bara stjärtfenan till lyftpunkt. Denna manöver minskar också risken för att slå den baksida väggen (figur 1). - Veckla och gäng-upp flera Flor Madrassera i ett rede att lägga sprutan används för infusioner. Placera boet på kaninens bröstet stjärtfenan till snittet.
- Sätta en IV-kateter på sprutan som innehåller endast DMEM (inte för hårt) och böj katetern ~ 4 mm från spets så att böjen håller på ca 75° efter det släpps.
- Infoga IV-katetern i artären fram till krök och tvätta ur allt blod från artär med DMEM (~ 0,25 mL x 2). För varje tvätt, Fyll artären med DMEM, och ta sedan bort kvarvarande DMEM från fartyget lumen genom att försiktigt trycka på artären med en behandskade finger, börjar bara kaudalt av kraniala vaskulär klippet. Bibehållen lätt tryck, Svep fingret från kraniala till stjärtfenan. Luminala innehållet kommer tvätta via arteriotomin.
- Håll katetern i artären och utbyta DMEM sprutan sprutan innehållande virus lösning. Kontrollera att ingen luft kommer in katetern.
- Skjut de siden band ner artären så att de omger artären på läget av kateterspetsen, men dra inte åt dem.
- Ingjuta 0,03 mL av virus lösningen att driva den återstående DMEM ur katetern och töm sedan artären. Komprimera den genom igen att ta bort all vätska från lumen med ett finger, kraniala till kaudalt (som i steg 2.3.9).
- Dra åt de två band runt kateterspetsen att försegla lumen. Ingjuta virus lösningen (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL för adenovirus) genom att trycka sprutkolven försiktigt tills artären är utspänd till fysiologiska kaliber.
Obs: Det är viktigt att artären expanderar till fysiologiska kaliber och förblir utspänd virus infusionen. Om så inte är fallet, graden av genöverföring kommer att sjunka avsevärt. - Lägg försiktigt sprutan i boet av gasväv.
- Placera en 7-0 polypropylen sutur i gemensamma halspulsådern adventitia bara kaudalt av kraniala vaskulär klippet att markera den kraniala gränsen av genen transduktion
- Efter virusinnehållande lösningen blivit i artär lumen för 20 min, ta bort virusinnehållande sprutan och ersätta den med en tom spruta. Aspirera virusinnehållande lösningen försiktigt tills kärlet kollapsar och ta ut sprutan. Skär eller ångra de siden band och ta försiktigt ut katetern.
Obs: Klippa banden mycket kort aids i att ta bort dem. Ta bort katetern noga för att undvika att skada halspulsådern endotelet. - Använder det kirurgiska mikroskopet, nära arteriotomin med 7-0 polypropylen med en X-mönster (figur 2).
- Gör ett första pass på nere till höger av arteriotomin och urstigningsteknik fartyget längst ned till vänster. Sedan korsa öppningen och göra ett andra pass från övre högra till längst upp till vänster.
- Innan binda ner suturen, spola ut artären genom att mycket kortfattat släppa kraniala vaskulär klippet. Blod rinner ut ur arteriotomin när klippet släpps, borttagning av luft och kvarstående virus från lumen.
- Dra suturen för att försiktigt stänga arteriotomin och knyt en sutur med 2 kvadrat knop.
Anmärkning: Dra suturen alltför tätt kommer att orsaka högar av vävnad som kommer att störa flödet, ökar risken för trombos och förändra flödet vilket kan vara en viktig okontrollerad variabel i sjukdomsmodeller.
- Släpp kraniala vaskulär klippet och sedan kaudala vaskulär klippet med lätt tryck med gasväv för att stoppa eventuella blödningar. Om blödning kvarstår fortsätta påtryckningarna för 1-2 min. Om arteriotomin var ordentligt stängd, slutar blödningen inom denna tidsram.
- Låt assistenten injicera buprenorfin [0,02 mg/kg; subkutan (SQ)] vid ungefär den här tiden att ge postoperativ analgesi tills plasmanivåerna av fentanyl blivit terapeutiskt.
Obs: En andra buprenorfin injektion (0,02 mg/kg; SQ) kan behövas 6 h efter den första injektionen att upprätthålla analgesi tills plasmanivåerna av fentanyl blivit terapeutiskt. - Upprepa virus infusion protokoll vänster följande steg 2.3.2 - 2.3.19.
- Sårslutning
- Använda en 5-0 PGA sutur för att stänga mittlinjen fascia med en kontinuerlig sutur.
- Med en 3-0 PGA sutur, nära huden med ett intrakutant mönster med en begravd Knut i båda ändar.
- Postoperativ återhämtning och rensning.
Obs: Kaninen måste övervakas kontinuerligt för ordentlig syresättning och kroppstemperatur tillfriskna från anestesi. Återvinning bör ske i en lugn och tyst miljö.- Stäng av isofluran och syre flöde och avlägsna ansiktsmasken från kanin.
- Haka av IV vätskor men lämna IV hamn för nödåtkomst IV.
- Ta kaninen till området återställning och låg på sin sida i en bur med en värmande vatten filt påslagen (eller alternativt en Bair Hugger värmare).
- Ge O2 av masken tills den SpO2 är stabil.
- Låt kaninen återhämta sig i en bur, vända det till andra sidan varje 15 min, tills kaninen kan sitta upp på bakbenen och flytta runt.
- När kaninen är mobila, ta bort IV från dess öra innan han återvände till buren.
Obs: Returnera inte kanin till sällskap av andra djur tills det är helt återhämtat sig från anestesi.
- Förfoga över något som haft kontakt med vektorn eller var i fältet operativa, följande lämpliga biohazard och sharps avfall protokoll.
3. genöverföring till kanin gemensamma halspulsåder: postoperativ vård
- Bedöma kaninens allmäntillstånd dagligen efter kirurgi, kontroll för sårläkning, tecken på infektion, aptit, respiration och tecken på smärta.
- Kontrollera kaninens öron position (öronen ner kan vara ett tecken på smärta eller ångest, speciellt när den kombineras med en slarvigt utseende). Kontrollera att kaninen förblir mobil och aktiva. Kontrollera kaninen för normal andning utan stridor. Kontrollera att såret är rent, torrt och intakt. Kontrollera kaninen för en normal kroppstemperatur. Konsultera veterinär tjänster om kaninen inte är mobila och aktiv, med normal kroppstemperatur, ett snyggt utseende, en rent såret och normal andning.
- Kontrollera om normala födointag och bevis av färsk avföring och urin.
Obs: Födointag kan minskas efter operation, men bör återgå till det normala inom 2 dagar. ge kompletterande mat som behövs.
- Ta bort fentanyl plåstret på postoperativ dag 3.
Obs: Buprenorfin kan administreras som behövs för postoperative smärta som inte hanteras av fentanyl plåstret eller om fentanyl plåstret tas bort tidigt.
4. terminal skörda kirurgi: före operationen
- Söva kaninen. Se avsnitt 1.3 och 1.3.5 angående prestation och underhåll av anestesi.
- Väg kaninen. Kombinera 30 mg/kg ketamin och 2 mg/kg xylazin i en spruta. Injicera ketamin/xylazin IM i paraspinous musklerna att inducera anestesi.
- Förbereda beredningslokalen och eller tabeller i väntan på kaninen att bli sövd.
- I beredningslokalen OR: setup hårklippningsmaskiner och ett vakuum för rakning kaninens nacke och öron.
- I operationssalen: setup övervakningsutrustning och placera sonderna (SpO2, temperatur) på tabellen OR; förbereda syre och isofluran; Knyt en gasbinda remsa till ansiktsmask att säkra det till kaninen och placera masken på huvudändan av bordet.
Obs: Gasbinda remsor knutna på ansiktsmask bör ha 2 svansar av cirka 45 cm vardera. - Slå på värmande vatten filt på tabellen OR. Ovanpå vatten filten, placera en rullade handduk för nackstöd och en dispersiv elektrod platta (senare placeras under kaninens rygg).
- Kombinera 1 mL lidokain HCl (2% lager) och 1 mL bupivicaine HCl (0,5% lager) (50/50 mix) i en spruta som en lokal smärtstillande.
- När kaninen är fullt anesthetized, förbereda kaninen för kirurgi.
- Ta bort avföring från ändtarmen, som beskrivs i 1.3.1, att möjliggöra senare placering av en temperatursensor.
- Raka kaninen från sternala skåran att vinkeln på underkäken samtidigt med en dammsugare för att hålla området rent. Även raka vänster bakre mellersta tån för pulsoximetri sonden.
Obs: Protokollet förutsätter att kirurgen kommer att vara på kaninens högra sida. Om OR installationen placerar kirurg på motsatssidan, omvända sidor i det här steget att hålla ledningar mittemot av kirurgen. Sidorna av framtida åtgärder bör också kopplas som behövs. - Transportera kaninen till eller och placera liggande på operationsbordet med valsade hals stöd handduk under kaninens nacke strax under huvudet. Försiktigt förlänga kaninens nacke tills den är rak och ca horisontella.
- Krok kanin upp till ansiktsmask med O2 på 1 L/min och starta isofluran administration. Säkra masken genom att Linda ändarna av gasväv remsan knutna till masken runt halsen stöd handduken under kaninen. Justera isofluran (vanligen 1-2%) som behövs för att upprätthålla korrekt anestesi för återstoden av förfarandet.
- Säkerställa dispersiva elektroden plattan är centrerad under kaninens rygg. Placera temperatur och pulsoximeter sonder.
- Hindra kaninens frambenen genom att löst knyta dem till bordet.
Obs: Placera alternativt ett litet plast bord över kaninen att skydda kaninen från att utsättas för bröstet/buktryck från kirurgen lutande på kaninens bröstet/magen. Målet här är att förhindra Tvingad uppstötningar av buken innehåll. - Injicera 2 mL lidokain (2% stamlösning) / bupivakain (0,5% stamlösning) (50/50 mix; från steg 2,4) subkutant längs den planerade snitt nacken för lokalbedövning.
- Spraya den kirurgiska platsen med betadine. Sätta på rena handskar för kirurgiska ingrepp.
5. terminal kirurgi (fartyget Harvest)
- Utarbeta instrument och operationsområdet.
- Öppna en ren drapera förpackning innehållande en tabell drapera och pappers-draperi för kaninen. Drapera tabellen instrument.
- Öppna den instrument-Packet, placera på tabellen instrument och ordna instrument. Placera följande utrustning till tabellen instrument: en 20 mL spruta och en 21G nål.
- Säkra diatermi kabeln till kanin drapera använder den 7,25 ”Kantrowitz pincett. Anslut till den elektrokirurgiska enheten och slå på den.
- Fyll en 20 mL spruta med steril koksaltlösning. Använd denna saltlösning som behövs för att hålla den exponerade vävnaden fuktig under förfarandet.
- Placera papper drapera över kaninen och skär ett hål i drapera över operationsområdet på kaninens nacke. Klämma i hörnen av hål att kaninens hud med handduk klämmorna.
- Isolera gemensamma halspulsåder.
Obs: 2 x kirurgiska luppar bör användas för denna del.- Skära i huden med en diatermi längs mittlinjen sträcker sig ca 7-9 cm cranially mot underkäken och klämma huden öppen med handduk klämmor.
Obs: Om skörden är bara några dagar efter tidigare kirurgi, diatermi inte behövs. Bara klippa suturerna och dra försiktigt öppna snittet från den tidigare kirurgin. - Göra ett kort laterala snitt genom fascia med en diatermi i kaudala slutet. Sätt sedan in stor sax i snittet och rakt på sak dissekera fascian längs hela mittlinjen. Skär dissekerade fascian ner mittlinjen med diatermi.
- Med liten dissekera sax, dissekera mellan V-formade muskler (sternocephalic muskel) och sternohyoid muskler över luftstrupen, att isolera gemensamma halspulsåder, börjar på höger sida.
- Dissekera rätt fria från omgivande vävnader från basen av halsen caudally till passage av faryngeal nerven cranially artären. Använd kirurgisk kisel loopar till stöd i Upprullningskraften artären under dissektion.
- Upprepa dissektion på vänster sida (steg 5.2.3 - 5.2.4).
- Med en 3-0 silk sutur, ligera den gemensamma halspulsådern kraniala till segmentet som var berikad med vektorn (användning adventitial suturen placeras på första operation för att lokalisera kraniala omfattningen av vektor infusion. Sedan ligera halspulsådern stjärtfenan till den reparerade arteriotomin.
- Punktskatt halspulsådern segmentet mellan nering och spola lumen med saltlösning. Trimma bort överflödig adventitial vävnad från fartyget och skär halspulsådern segmentet i mindre bitar för de olika endpoint analyser (histologi, DNA, RNA (ribonukleinsyra), protein, explant kultur, etc.).
- Injicera 1 mL Beuthanasia IV till eutanasi, och bekräfta eutanasi av kaninen.
- Skära i huden med en diatermi längs mittlinjen sträcker sig ca 7-9 cm cranially mot underkäken och klämma huden öppen med handduk klämmor.
- Förfoga över något som haft kontakt med vektor eller var i fältet operativa, följande lämpliga biohazard och sharps avfall protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att implementera denna metod med tillförsikt, är preliminära experiment nödvändigt att fastställa att operatören uppnår effektiva och reproducerbara genöverföring, med transgenens uttryck främst i luminala endotelceller. Vår erfarenhet är detta lättast utvärderas med hjälp av en vektor som uttrycker β-galaktosidas. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) färgning av gemensamma halspulsådern segment bort 3 dagar efter vektor infusion, samt mätning av β-galaktosidas mRNA (messenger RNA) med kvantitativa omvänd Transkription polymerase chain reaktion (qRT-PCR), kommer att avslöja effektivitet, reproducerbarhet och läge av transduced celler. För experiment att undersöka effekterna av transgenens uttryck eller mäta aktiviteten av cis verkande transkriptionell element, vi brukar mäta transgenens mRNA som en första indikation på och reproducerbarhet av genöverföring.
En ny aktör i vårt laboratorium försökte etablera kunskaper med denna metod av transducing kanin gemensamma halspulsåder med en adenovirala vektor (2 x 1011 vp/mL) att uttrycka en β-galaktosidas transgenens, driven av en cytomegalovirus (CMV) arrangören. Sensorik artärer var avverkat 3 dagar senare och var skuren tvären i segment. Enskilda segment var sedan antingen skära öppen axiellt eller lämnade som intakt ringar. Alla segment var X-gal betsad i mikrocentrifugrör. Segment som hade skurits öppen axiellt placerades på en horisontell yta och luminala ytan maximally utsatt, använda pins som behövs för att förhindra att segmentet curling. En face bilder av luminala ytan visade robust endothelial färgning med X-gal (siffror 3A och 3B). Axiella bilder av intakt halspulsådern ringar luminala ytor visade X-gal färgning bara på luminala ytan (siffrorna 3 c och 3D). De segment som hade öppnats axiellt var bearbetas till paraffin, sektioneras och kontra färgas med hematoxylin och eosin eller nukleära snabb röd. Bilder Visa X-gal färgning primärt i endotelet, även om det finns en liten mängd fläckar i det adventitial lagret (siffror 3E och 3F). Transduktion av adventitial celler kan förekomma via läckage av vektor genom webbplatsen arteriotomin eller genom läckage via små grenar proximalt till platser av sida gren ligering. 29
I en separat experiment försökt en ny operatör att etablera skicklighet i att uppnå reproducerbara nivåer av transgenens uttryck, som ett förspel till experiment som syftar till att undersöka biologiska aktiviteter av transgener. Kanin gemensamma halspulsåder var sensorik med helper-beroende adenovirus (2 x 1011 vp/mL) som innehåller antingen en apo A-I (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) transgenens, båda under kontroll av en CMV-främjare. Sensorik artärer var avverkat 3 dagar efter transduktion och skär tvären i segment. RNA extraherades från fartygssegment och apo A-I och IL-10 mRNA uttryck kvantifierades genom qRT-PCR, med normalisering till glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) mRNA i samma extrakt (figur 4). I HDAdIL10-sensorik artärer, endast 1 av 6 artärer hade en mycket låg, men detekterbara apo A-I mRNA signal. Menar uttryck för apo A-I mRNA var 700 gånger större större i kärlen sensorik med HDAdApoAI än i fartyg sensorik med HDAdIL10. Låga nivåer av endogent IL-10 mRNA påvisades hos HDAdApoAI-sensorik artärer, med medelvärde ökat uttryck 6-fold i HDAdIL10-sensorik artärer. Notera finns det betydande intra - och inter - artery variabilitet i transduktion effektivitet och transgenens uttryck, som visas i figur 3 och 4, respektive. Vi finner denna variation även med erfarna operatörer.
Figur 1 . Arteriotomin i gemensamma halspulsådern. Fin pincett används för att förstå halspulsådern adventitia och gälla artären uppåtgående dragkraft. Denna manöver expanderar fartyget lumen och genererar en vertikal yta där den böjd 19G nål sätts, vilket minimerar risken för punktering den baksida väggen i artären. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Nedläggning av gemensamma halspulsådern arteriotomin. Arteriotomin är stängd med en 7-0 polypropylen sutur, använder en X-mönster. Det första passet av nål och sutur träder artär lumen på nedre högra hörnet av arteriotomin (plats 1) och avslutar lumen nere till vänster (plats 2). Nålen och sutur sedan korsa arteriotomin och ange lumen överst till höger (plats 3). Nålen sedan avslutas lumen överst till vänster (plats 4). Mild dragkraft på båda ändarna av suturen stänger arteriotomin. Sutur ändarna (spännande från plats 1 och plats 4) binds med 2 kvadrat knop. Grå cirklar representerar platser av suturer som passerar genom kärlväggen. Heldragna blå linjer visar områden där suturen är utanför kärlväggen. Prickig blå linjer visar områden där suturen är inom lumen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Effektiv endothelial transgenens uttryck. Kanin gemensamma halspulsåder var sensorik med en adenovirala vektor uttrycker en β-galaktosidas transgenens och skördade 3 dagar senare. Sensorik blodkärlet segment var X-gal målat som intakt ringar eller efter öppnas med en axiella snitt. (A-B) Sv ansikte bilder av halspulsådern ringar som var uppskuren axiellt luminala ytor. (C-D) Axiell utsikt in i luminala utrymme av intakt halspulsådern ringar. (E-F) X-gal målat, paraffin-inbäddat halspulsådern segment var sektioneras och kontra färgas med antingen (E) hematoxylin och eosin eller (F) kärntekniska snabb röd. Skalstapeln = 100 µm. Jag = intima; M = media; och en = adventitia. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Kvantifiering av transgenens mRNA uttryck. Kanin gemensamma halspulsåder var sensorik med helper-beroende adenovirus uttrycker antingen apo A-I (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) under kontroll av en CMV-främjare. Artärer skördades 3 dagar senare. mRNA uttryck för (A) Apo A-I och (B) IL-10 var kvantifieras av qRT-PCR, normaliserade till GAPDH mRNA i samma artären och uttryckt som godtyckliga enheter (AU). Stapel anger medelvärdet; P -värdet är från rank sum test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fördelar | Nackdelar | |
| Jämfört med gnagare modeller | Fylogenetiskt närmare primater | Dyrare att köpa och hus |
| Större genetisk mångfald, lindra kliniska Översättning | Svårare att föda upp och hantera | |
| Större fartyg tillåter enklare kirurgisk manipulation och ger mer vävnad för kvantitativ analys | Mer omfattande myndighetskrav | |
| Tillåter användning av transluminal utformad för människor | Färre genetiskt modifierade bakgrunder | |
| Mindre omfattande urval av antikroppar mot kanin proteiner | ||
| Jämfört med större djurmodeller | Relativt billiga att köpa och hus | Kanske mindre kliniskt relevanta än andra stora djurmodeller för vissa vaskulära sjukdomar |
| Lättare att föda upp och hantera | ||
| Jämfört med groddar-line genmodifiering | Transgenens uttrycks endast i stora artär; effekten av transgenens specifikt på platsen av intresse kan bestämmas | Tillämpningen av metoden till celler än endotelet är svårt |
| Kan använda kontralaterala halspulsådern som Parade kontroll; eliminerar systemisk parametrar (t.ex., blodtryck, kolesterolnivå) som okontrollerad variabler | Operationssalen och kirurgisk expertis krävs; Core faciliteter sannolikt inte tillgängliga. | |
| Högre genomströmning för att testa DNA reglerande sekvens aktivitet i stort fartyg endotel | Transgenens inte kan uttryckas i de flesta kärlbäddar | |
| Potentiellt snabbare och billigare | ||
| Systemisk exponering för transgena protein osannolikt — minimerar off-target effekter | ||
| Jämfört med systemisk genterapi tillvägagångssätt (t.ex. Lever signaltransduktion via perifer ven injektion) |
Mer-stabil transgenens uttryck än systemisk (levern) genterapi | Vector leverans kräver kirurgisk intervention |
| Transgenens uttryckt i kärlväggen, medger lokal tillförsel av höga nivåer av transgena protein | Operationssalen och kirurgisk kompetens som krävs | |
| Systemisk exponering för transgena protein osannolikt — minimerar off-target effekter | Behandling begränsas till artärerna som är speciellt avsedda för intervention. inte behandla systemisk faktorer (t.ex., lipider) | |
| Kan använda kontralaterala halspulsådern som Parade kontroll; eliminerar systemisk parametrar (blodtryck, kolesterolnivå) som okontrollerad variabler | ||
| Långt lägre vektor dos krävs |
Tabell 1. Fördelar och nackdelar med kanin gemensamma halspulsådern endothelial-selektiv gen överföra modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vissa aspekter av operationsteknik förtjänar särskild uppmärksamhet. Full exponering och mobilisering av den gemensamma halspulsådern via noggrann dissektion kommer underlätta gen överföring och arteriotomin reparation. Dock under dissektion, ska direkt manipulation av halspulsådern minimeras för att förhindra vasospasm. Dessutom någon blödning intill artären avbrytas av lätt tryck med en kompress och extravasering blod ska rensas omedelbart genom att skölja området med fysiologisk koksaltlösning. Det är också viktigt att undvika att skada vagusnerven, som löper parallellt med den gemensamma halspulsådern. Trimma adventitia i området i den planerade arteriotomin hjälper Operatören att utföra en ren och funktionell arteriotomin såväl som att reparera arteriotomin. Slutligen, grenar av den gemensamma halspulsådern måste identifieras och säkert sammanskrivna för att förhindra läckage av vektorn från halspulsådern lumen.
Det finns också kritiska aspekter av vektor infusion och arteriotomin reparation. Under vektor infusion är det viktigt att distend den gemensamma halspulsådern till fysiologiska eller något större kaliber att uppnå effektiv transduktion. När du reparerar arteriotomin, bör suturen tränga igenom kärlväggen så nära som möjligt till kanterna på arteriotomin, och bör renlig ange och avsluta lumen snarare än passera axiellt genom kärlväggen. Om bara de yttre skikten av kärlväggen är drog ihop eftersom suturen passerar axiellt genom kärlväggen snarare än passerar radiellt genom väggen och ange lumen, en lucka kommer att förbli i intima och risken för blodpropp ökar. Om de sutur genomföringar är alltför brett radavstånd, eller om suturen är överdrivet skärpt när bunden, skapas vävnad veck på webbplatsen arteriotomin. Dessa veck störa normala laminärt blodflöde, ökar också risken för trombos. Att upprätthålla konsekvent flödesegenskaper är viktigt för experiment som utförs i djurmodeller av sjukdomar (t.ex., ateroskleros) eftersom förändrad flöde kan bidra till sjukdomen processen30.
Nya aktörer stöter ofta thrombosed artärer vid skörd. Luminala trombos är en förödande komplikation, vilket gör artären obrukbar som en experimentell prov. För att förhindra trombos, administrera vi rutinmässigt IV heparin före genöverföring. Trombos är också förhindras genom försiktig förslutning av arteriotomin, som beskrivs ovan. Heparin dosen kunde ökas för att förhindra trombos eller acetylsalicylsyra kan ges postoperativt. Dock en högre dos av heparin skulle också öka risken för blödningskomplikationer och aspirin kan störa experimentella slutpunkter, särskilt om inflammation som studeras. Därför är det bättre att fokusera på förbättrad kirurgisk teknik som ett sätt att förebygga trombos.
Om manipulerade alltför kraftigt, kan halspulsåder genomgå spasm, som också kan bidra till Trombos genom att minska flödet. Om vasospasm påträffas, kan den lindras genom tillämpning av aktuell papaverin. När fartyget skördar planeras för mer än 2-3 dagar efter transduktion och trombos är ett bekymmer, kan transkutan ultraljud användas till noninvasivt bedöma fartyget patency. Upptäckten av thrombosed artärer kan leda till dödshjälp för att spara in på boendekostnaderna. Ytterligare djur kan också registreras utan dröjsmål, för att fylla experimentella grupper. Peri - och post - intervention dödlighet som förknippas med denna metod bör vara < 1% (dvs., inte skiljer sig från dödlighet associerade med andra operationer som utförs på friska kaniner)31.
Efter en aktör blir bekväm med de tekniska aspekterna av kirurgiska protokollet, en förmåga att utföra effektiv genöverföring till endotelet behov verifieras med hjälp av metoder som beskrivs i avsnittet ovan på representativa resultat. Om det uppstår problem med att uppnå reproducerbara genöverföring, sannolikt skyldige i ett av två områden. Efter fartyget är isolerade och blodet tvättas från lumen, är det viktigt att ta bort DMEM tvättbuffert så att infunderas vektor lösningen inte späds under transduktion. Den andra viktiga aspekten är att distend fartyget till fysiologiska eller något större kaliber vektor infusionen. Eftersom det i vår erfarenhet, en halspulsådern som inte är fullt utspänd eller inte förblir utspänd under 20 minuters infusion tillförlitligt låg transgenens uttryck, är det troligt att buk med fysiologiska kaliber förbättrar transduktion effektivitet. Men har vi aldrig studerat detta systematiskt. Det är möjligt att öka infusion trycket över fysiologiska nivåer kunde effektivisera transduktion, och också tillåta högre nivåer av transduktion av celler i vaskulär media. Störningar av endotel barriären skulle dock sannolikt skada fartyget och öka risken för trombos. Om fartyget inte förblir utspänd för hela 20 minuters vektor-inkubationstiden, är det troligt att vektorn läcker från grenar av den gemensamma halspulsådern. Var försiktig under dissektion att identifiera och ligera alla grenar för att förhindra läckage av vektorn från halspulsådern lumen.
Denna metod har flera begränsningar som är relaterade till användningen av kaniner. Kaniner är billigare hus och foder än andra stora djur (hundar, svin och får); kostnader för inköp, bostäder och mata kaniner är dock betydligt mer än för möss och råttor. Operationssalen faciliteterna och myndighetskrav för kanin operationer är också långt mer omfattande än för gnagare. Dessutom som betydande tekniska expertis behövs för att utföra kirurgiska gen överföringsprotokollet effektivt. Denna expertis kan förvärvas av aktörer som har haft ingen formell kirurgisk utbildning. Minst 2 personer i vår grupp (inklusive primära författare till detta manuskript) har lärt sig de kirurgiska teknikerna och tillämpade dem produktivt. Dock behövs noggrann träning och en försiktig validering av operatörens gen överföring effektivitet och reproducerbarhet (enligt beskrivningen i avsnittet representativa resultat) innan operatören kan börja generera högkvalitativa data.
Inneslutning av transgenens uttryck nästan uteslutande till endotelet med denna metod29,32,33,34,35,36,37 är användbar eftersom det medger undersökning av transgenens effekter i endotelceller och mätning av aktiviteten av cis verkande regulatoriska DNA-sekvenser i endotelceller. Ett litet antal adventitial eller mediala celler kan vara sensorik; Denna metod oförmåga att effektivt transduce nonendothelial celler hindrar emellertid tillämpningen av metoden för att studera andra typer av kärlväggen celler (såsom glatta muskelceller och makrofager). Även om överuttryck av utsöndrade proteiner från sensorik endotelceller kan möjliggöra undersökning av effekterna av dessa proteiner på andra vaskulära cell typer, icke-utsöndras proteinerna i dessa andra typer av vaskulära celler roller (t.ex. receptorer eller proteiner involverade i signaltransduktion) kan inte undersökas med denna metod.
Som ett medel för att testa artär väggen riktade genterapi, metoden skiljer sig från andra prekliniska metoder på två viktiga sätt. Första utnyttjar metoden en kanin modell för i vivo tester av genterapi snarare än mer vanligt förekommande gnagare modeller8,12,15,38,39. Användningen av kaniner gör bedömning av transgenens uttryck och produktens transgenens biologiska roll i en outbred djurmodell, som är mer representativ för mänsklig genetisk mångfald än inavlade gnagare. Modellen kan användas för att bedöma genterapi i antingen normal kanin artärer eller kanin artärer som har arteriell patologi som är liknande som finns i sjuka människors artärer. Kanin artärerna är också närmare i storlek mänskliga artärer än är gnagare artärer och ge långt mer vävnad för analys än är tillgänglig från gnagare artärer. Den andra stora skillnaden är att denna metod använder en kirurgisk metod för att leverera transgenens vektor till den vaskulära endotelet. Somatisk genterapi levereras ofta systemiskt, oftast genom att rikta levern med målet att förändra plasmanivåerna av transgenens protein25,40. Genom att rikta vaskulära endotel, levererar metoden terapeutiska transgenens produkten lokalt, med dess maximal koncentration inom kärlväggen, just där det behövs för vaskulär sjukdomsbehandling. Genom att leverera transgenens endast lokalt, eliminerar metoden också systemiska biverkningar av transgenens produkten. Andra grupper utvecklar metoder med peptider, antikroppar eller andra kapsid ändringar för inriktning systemiskt injicerade vektorer till friska eller sjuka endotelet för att tillhandahålla lokala vaskulär gen terapi41,42 , 43. dock dessa inriktningsmetoder kvarstå under utveckling och försvåras fortfarande av betydande systemiska transduktion, särskilt i levern42,43,44. Våra kirurgisk metod ger en exakt och effektiv introduktion av transgener till den vaskulära endotelet med minimal - om någon - transduktion på andra platser. 1 metoden är också en mer bekväm, effektiv och högre-under medelvärdet (jämfört med groddar-line genmodifiering eller systemisk injektion av endothelial riktade vektorer) för att testa aktiviteten av regulatoriska DNA-sekvenser i stora kärl endotelet, för testning transgenens proteinfunktion i kärlväggen och testning fartyget-vägg-targeted genterapi.
Denna metod kan utredning av eventuella transgenens, biologiska roll när det uttrycks i stora artär endotel. Om ändras till snabb förlust-av-funktion reagenser såsom dominerande negativa receptorer eller kort hårnål RNA, skulle det möjliggöra utredning av endogena endothelial proteiner och signalvägar roller. Metoden kan också användas för att mäta transkriptionell aktiviteten av alla cis-verkande DNA-sekvens i stora artär endotelceller5,6,7. Dessutom metoden tillåter testning av någon typ av genen överföring vektor för effektivitet och säkerhet när de levereras lokalt till endotelet, och kommer att avslöja vektorn förmåga att uppnå hållbara transgenens uttryck. Slutligen, metoden tillåter utveckling och testning av kombinationer av vektorer och transgener som är utformade för att leverera vaskulära väggen riktade genterapi. Metoden skulle kunna fungera som en screeningmetod för att identifiera terapeutiska gener som kanske-i framtiden-levereras till endotel alla stora artärer (eller alla sjuka stora artärer) av perkutant injicerade vaskulära väggen riktade vektorer. På grund av redan existerande immunitet hos människor till adenovirus typ 545, kommer det vara svårt för att använda adenovirus typ 5-baserade vektorer i kliniska tillämpningar. Konstruktion av adenovirus 5 kapsid, användning av alternativa adenovirus serotyperna46, eller användning av mindre-immunogent vektorer som AAV kan krävas att vaskulär genterapi till kliniken. Som en experimentell verktyg, dock är vi omedvetna om varje vektor som kan konkurrera med helper-beroende adenovirus 5 för att uppnå effektiva och driftsäkra transgenens uttryck i blodkärlen1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar AdVec, Inc. för tillstånd att använda HDAd reagens, Julia Feyk för administrativt stöd och Institutionen för Komparativ medicin veterinärmyndigheterna för kirurgiska råd och stöd. Detta arbete stöds av HL114541 och John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J.
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A.
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
