Summary
このメソッドは、ウサギの頚動脈の血管内皮細胞に、遺伝子を導入することです。遺伝子させず正常動脈または疾患モデルでの生物学的役割の検討ができます。メソッド、また規制的 dna の活性の測定に役立ちます。
Abstract
このメソッドの目的は、分離セグメント両方ウサギ総頚動脈の内皮に transgene を導入することです。方式により、内皮発現遺伝子の生物学的役割を決定して大きな動脈の DNA 配列の生体内での転写活性を定量化する捜査焦点の内皮細胞選択的遺伝子導入血管内皮細胞。メソッドは、血管内腔に遺伝子発現ウイルスのベクトルを提供するウサギ頸動脈と、切開の手術の分離を使用します。ルーメン内容の後続の吸引と、ルーメンのベクトルの短い潜伏期間は効率的かつ耐久性のある検出可能な伝達や表現の外の血管内皮細胞での遺伝子発現を達成するために十分な分離動脈セグメント。メソッドによりマウスレニンの生物活性の評価正常動脈とひと血管疾患のモデルの両方可能性がありますいずれかのターゲット (e.g他のサイトへの遺伝子導入による全身効果を回避しながら。肝臓)、生殖系列の遺伝子導入による血管内皮細胞に遺伝的構造を提供する方法。法の適用は、熟練した外科医と麻酔、設備の整った手術室の購入および住宅のウサギ、費用の必要性と遺伝子導入ベクターの構築とその利用に関する専門知識の必要性によって制限されます。この方法で得られた結果を含める: 動脈構造、セル、細胞外のマトリックス、または血管運動機能の変化を遺伝子関連増加または減少動脈の炎症。血管内皮細胞のアポトーシス; の変化進行、遅滞、または内膜肥厚や動脈硬化などの病気の回帰。メソッドことができますを含む検索結果を提供する内皮細胞の遺伝子発現を変更するネイティブおよび合成 DNA 規制シーケンスの能力の測定: レベル導入遺伝子の mRNA、遺伝子蛋白質のレベル、遺伝子のレベル酵素活性。
Introduction
この方法の目標は、ウサギ頸動脈の血管内皮細胞に、遺伝子を導入することです。遺伝子の導入により遺伝子製品の生物学的役割の検討、正常動脈とウサギ人間の動脈疾患のモデルの両方。疾患モデルにおける遺伝子の過剰発現は、遺伝子 (とその蛋白質の製品) が治療薬1,,,234として約束を示すかどうかを明らかにできます。遺伝子発現カセットのシスエレメント規制要素を含めることができます5,6生体内で動脈の内皮細胞でこれらの要素の活動の評価。アクティブな式カセットを設計し、7生体内で大きな動脈内皮細胞の遺伝子の規則のメカニズムを調査する、特定のシスエレメント規制要素の活動の知識を使用できます。
ウサギは、人間の血管の生理と疾患のさまざまな側面の貴重なモデルです。ウサギは、人間の血管の多くの機能を共有します。たとえば、血液の基準値、止血の調節、血管軸張力は、ウサギとヒトの8間似ています。血管疾患の家兎モデルを複製を含む多くの人間の病気の主要な機能: 動脈瘤 (似たような幾何学的および流動特性)9, 脳血管攣縮 (血管内治療に類似した応答)10,11, と動脈硬化 (線維性被膜の脂質、マクロファージ、平滑筋細胞における豊富なコアを含む類似の機能と内膜肥厚斑)12,13。したがって、ウサギ モデルは、血栓症、脳血管攣縮、脳動脈瘤、糖尿病、血管狭窄、動脈硬化症8,13,14,など多くの血管疾患のため開発されている15,16。
血管生理学および病気の動物モデルの中から選択する研究者ウサギいくつか利点があります。齧歯動物に比べると、ウサギの大きな船は簡単に手術操作、血管内デバイスの使用および定量的測定のための組織の量を大きくを許可します。ウサギ、齧歯動物17よりは霊長類に近縁なはるかに近いしザイモグラム ウサギの大きい遺伝的多様性はより良い人間の遺伝の可変性を近似する.遺伝的多様性は前臨床研究は、特に重要なある-遺伝的に多様な人口に適用できる治療法を開発する彼らの自然狙いで。多くの場合ない他のすべてのモデル種ウサギ遺伝子が簡単に複製や合成ため高い被覆率でずっとウサギ ゲノムが配列として (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]。(犬、豚、羊など) その他の大型動物モデルと比較して、ウサギは比較的高価なを購入して家と彼らが繁殖し、処理を容易にします。各家兎における特定の血管疾患モデルこの原稿8,12,18の範囲を超えているひと疾患のモデルとして、独自の利点と欠点があります。調査官は、これらの利点と欠点について、ウサギが特定の実験の質問に答えるための最高のモデルであるかどうかを確認ください。
デオキシリボ核酸 (DNA) の規制シーケンスを生体内で血管内皮細胞の導入は、複雑な生理学的環境でこれらの一連の活動の調査を実行できます。Transfected 内皮細胞の in vitro研究は、規制的 dna; の初期評価に役立ちますただし、組織培養モデルの表現のレベルは時々 再現されません研究が繰り返される生体内で5,19,20。生体外でシステムも培養血管細胞間タンパク質シグナル伝達、内皮細胞生理学、コミュニケーションの基本的な経路を調べる場合に便利にすることができます。ただしより複雑な経路や隣接血管細胞や免疫システムの複雑な人口に影響される規制のネットワーク最高、体内システム6,20で研究されています。記載方法は、そのまま容器、疾患の有無のコンテキスト内で血管内皮細胞の遺伝子発現調節を探索するためのプラットフォームを提供します。生体内のシステムは、また遺伝子式6の規制する免疫システムの貢献の生理学的および病理組織学的細胞のクロストークの調査と特定を許可します。
(マウス) を中心に生殖系列の遺伝子導入は、内皮細胞に遺伝子発現を導くために代わるアプローチです。このアプローチは、内皮特異的プロモーターまたは規制地域21,22を介したターゲットを生涯発現を提供できます。しかし、トランスジェニック マウスの生成は時間がかかり、高価なトランスジェニック数行をしばしばテスト目的のセルのタイプおよび達成十分な導入遺伝子発現レベルで実験的に遺伝子のターゲットを確認する必要があります。マウス システムの結果は、ひずみに依存をすることができます。内皮細胞をターゲットとした遺伝子と遺伝子導入マウスモデルは多くの利点を持っている: 遺伝子導入を実現するために、すべての実験動物の手術を実行する必要はありません、実験マウスでの多数の他の利用可能なトランスジェニック マウス飼育することができます遺伝的・形態の相互作用をテストするため、様々 な表現型の特性を促進するマウスの蛋白質と反応する抗体があります。しかし、血管系、22遺伝子プロダクトを演技するサイトを決定する困難を通して遺伝子発現の結果通常生殖線を介して血管内皮細胞に遺伝子のターゲットします。これは遺伝子プロダクトが分泌されているときに特にを通して血管内皮細胞から分泌される遺伝子プロダクトが動物内のサイトの任意の数で生物学的活性を持つことが。本稿で説明した方法には、技術的な専門知識、専門設備が必要ですより時間がかかると内皮特異トランスジェニック マウス ラインの開発よりも安価にことです。それは大きな動脈セグメントの内皮細胞に選択的にタンパク質の機能の評価を可能にし (実験によって異なることが全身的要因を排除対コントロールとして対側頸動脈の使用が可能動物-たとえば、血圧やコレステロール値-自由な変数として)。
遺伝子療法は血管疾患の治療のための有望なアプローチ、特に慢性疾患治療遺伝子23の持続的または多分生涯式、単一アプリケーションできますので。遺伝子療法の治療の約束は、しばしばターゲットに比較的簡単なターゲットは、血液媒介ウイルスのベクトルの多くは肝肝24,25に、体細胞遺伝子の動物モデルで検討されています。ただし、血管疾患の影響を受けやすい肝臓を対象とした遺伝子治療は全身蛋白質過剰発現を達成しなければなりません。これは通常、有害または致命的26をすることができますベクトルの大量投与を必要です。また、タンパク質昇給も無名の実験結果の解釈を複雑にあるターゲットを副作用のリスクの全身のレベルを増加しました。本稿で説明したように血管内皮細胞をターゲット ローカル遺伝子治療は注入のベクトルが導入された動脈セグメントを超えて広く配布されていないとなし、ローカル血管効果を達成することができますので全身的副作用を避けることができます。全身血漿蛋白質の変化。27また、ベクトルのはるかに低い量は堅牢な肝伝達を達成するために必要であるより動脈セグメントを変換するが必要です。肝臓から遺伝子発現は、おそらくのために細胞のターン オーバー、高度な遺伝子発現が維持される場合、繰り返し投与を必要とする、時間の経過とともに減少する報告されています。28対照的に、血管内皮細胞の低離職率は、チョウ飼育家兎では少なくとも 48 週間と 24 週間、少なくともウサギのコレステロールの動脈硬化病変における安定した表現を提供します。1,27
ウサギ共通頸動脈血管内皮細胞への遺伝子導入のこの方法が適切なかどうかを決定するには、利点と欠点 (表 1) が具体的な研究目標の文脈で考慮必要があります。このメソッドの利点があります: ザイモグラムのウサギは人間の遺伝的多様性代表より近交系マウス (前臨床の仕事のために重要);ウサギは簡単に操作できる大型船舶と分析のためのより多くの組織を提供します。メソッドは、生殖細胞内皮トランスジェニック マウスのターゲットよりもはるかに多くすばやく内皮細胞をターゲットとした遺伝子発現を実現できます。ベクトル用量を遺伝子発現の; のモデル変数のレベルに簡単に調整できます。大きな動脈の内皮細胞に固有のプロセスを調べることができます。ローカル血管遺伝子により制御されていない変数として全身的要因を排除するコントロールとして使用する同じ動物で、反対側の頸動脈。デメリット: 特別な設備と専門知識が必要です。実験するより少ない遺伝子組み換え背景がネズミよりもウサギで利用できます。より少なく豊富なマウス蛋白質 (バイオアセッテイ遺伝子蛋白質の実験結果の解釈に重要なことができる他の抗原) の対のウサギに抗体があります。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッド ワシントン事務所の動物福祉と関連する機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認された、すべての遵守や完成した関連する規制・制度ガイドライン。
注: ウサギ頸動脈への遺伝子導入は、麻酔科医や助手の援助と外科医によってウサギに実行されます。
1 ウサギ頸動脈遺伝子の伝達: 試運転
- ウサギを麻酔します。ウサギの重量を量る。注射器に 30 mg/kg のケタミン ・ キシラジン 2 mg/kg を組み合わせます。麻酔を誘導する棘筋におけるケタミン ・ キシラジン筋肉 (IM) を挿入します。
- 麻酔になるウサギを待っている間、準備室と手術室 (OR) テーブルを準備します。
- OR 準備室で: 眼軟膏とフェンタニル パッチの準備テーブルの手の届くところに配置バリカンとウサギの首と耳のシェービングのための真空を設定します。アルコール準備パッド、ウサギの耳静脈に点滴 (IV) をセキュリティで保護するサージカル テープ、24 × ¾"カテーテル注入ポート、置いておきます。
- または: 監視機器を設定し、またはテーブルに [心電図 (心電図)、酸素飽和度 (スポ2)、温度] プローブの位置酸素とイソフルランを準備します。ウサギに固定し、テーブルの頭の端にマスク フェイス マスクにガーゼ ストリップを結ぶ。
注: フェイス マスクにガーゼ ストリップ約 45 cm の 2 尾が必要です。 - 地球温暖化の水毛布 OR テーブルに入れます。水の毛布の上に首サポートと (後でウサギの背中の下に配置) 分散電極板の圧延タオルを配置します。
- 18-19 G の針添付され 1 kg あたり 10 mL/h に流量を設定または IV ポンプ 100 ml の生理食塩水 IV バッグを設定します。
- リドカイン塩酸 1 mL を組み合わせる (2% 原液) と bupivicaine 塩酸 1 mL (0.5% 原液) で注射器で局所麻酔薬として使用されます。
- ウサギは完全に麻酔、手術のウサギを準備します。
注: チェック (つま先のピンチ; 手足撤退捜す) ペダル反射の欠如のため、麻酔の深さを確認し手術中ペダルの反射を監視し続けます。- 目に眼軟膏を適用します。手袋をはめた指 (直腸) 上記の前方下腹部と肛門へ指を移動する押すと、ウサギの直腸から便を削除します。これは直腸温度プローブの後で配置になります。
- エリアを清潔に保つための真空を使用しながら下顎の端に胸骨切痕から前方の首を剃る。また IV 配置とフェンタニル パッチの添付ファイルの両方の耳を剃る、パルス酸素濃度計のプローブの左中間のリアトーを剃る。
注: プロトコルは、外科医はプロシージャ全体のウサギの右側にあることを前提とします。またはセットアップは、反対側を外科医を配置した場合逆にワイヤーと外科医の反対の IV を維持するこの手順の側面。必要に応じて、今後のステップの側面を切り替えるもする必要があります。 - アルコール準備パッドで左耳を拭く、左の耳静脈に、24 G IV カテーテルを配置、注入口キャップ、それを確保するためのウサギの耳にカテーテルとポートをテープします。ウサギの右耳にフェンタニル パッチ (25 μ g/h) を適用します。
- OR にウサギを輸送や頭のすぐ下のウサギの首の下の圧延首サポート タオルで手術台に仰臥位場所します。優しくまっすぐであり、およそ水平までは、ウサギの首を拡張します。
- 1 L/分、O2とフェイス マスクまでウサギをフックし、イソフルラン投与を開始します。ウサギの下首サポート タオル周りマスクに縛らガーゼ ストリップの端をラップすることによってマスクを保護します。(に基づいて心拍数, 呼吸数, ペダル反射) プロシージャの残りの部分に適切な麻酔を維持するために必要に応じて、イソフルラン (通常 1-2%) を調整します。
- 分散電極板がウサギの背中の下で中央揃えされていることを確認します。温度・ パルス パルスオキシメータのプローブを置き、ウサギに心電図リードを適用します。
- うさぎの耳、1 kg あたり 10 mL/h で生理食塩水のポンプを始動カテーテル ポートに IV を生理食塩水をフックします。
注: 1 h 後生理食塩水ポンプは 1 kg あたり 5 mL/h を削減できます。 - 疎テーブルにそれらを結ぶことによってウサギの前足を抑制します。必要に応じて、外科医はウサギの胸部・腹部に圧力をかけてから胸/腹部の圧力にさらされているからウサギを守るためにウサギを小さなプラスチック製のテーブルを配置します。
注: 小さなテーブルは、腹部の内容の強制逆流を防ぐを助けるかもしれない。 - 事前に準備されたリドカイン (2% 株式) 2 mL を注入/ブピバカイン (0.5% 株式) (50/50 ミックス) 局所麻酔の計画された首切開線に沿って皮下。
- アシスタント 3 交互にクロルヘキシジンと、イソプロパノール、betadine でスプレーのスクラブと手術部位の準備をしましょう。スクラブ、ガウン、手袋、次の適切な無菌テクニック。
注: 外科医は、手術の最初の半分を支援する手術用ルーペ × 2 を着用する必要があります。サバイバル手術中に外科医と手術野の無菌性を維持することが重要です。アシスタントのみ必要があります任意の非滅菌アイテムの処理と滅菌材料を無菌外科医に渡されるまたはドレープ楽器テーブル上に配置必要があります。滅菌タオルは、顕微鏡などの非滅菌装置を操作しながら無菌性を維持するために外科医によって使用できます。
2. 生存術 (遺伝子)
- 器具滅菌フィールドを準備します。
- テーブル ドレープ、ウサギのための 1 つの紙ドレープといくつかのタオルを含む滅菌ドレープ パックを開くアシスタントをしましょう。無菌外科医にアイテムを転送します。
- 計測器表をドレープします。場所、6 滅菌タオルとペーパーに覆われたテーブルの上にドレープします。
- 4 タオルのみ手術サイト公開 (約 4 cm × 10 cm) を残して、ウサギの首をおいましょう。ウサギの上に紙のドレープを横たわっていた。
- アシスタント滅菌器械のパックを開き、無菌装置のテーブルの上に配置をしましょう。
- 次の機器を開き、無菌装置のテーブルの上に配置または外科医に手助を聞かせて: 3 1 mL 注射器 (および 1 つ針針と注射器が既に読み込まれていない場合) 1 つの 20 mL 注射器、1 つの 21 G 針、19 G の針、3-0ポリグ リコール酸 (PGA) 縫合、5-0 PGA 縫合、7-0 ポリプロピレン縫合 2 24 G 静脈留置針。
- 使用してテーブルの終了 Kantrowitz 鉗子と、ドロップ プラグ"7.25 ウサギ ドレープに電気焼灼器ケーブル固定します。電気手術ユニットにケーブルを接続し、電源をオンにアシスタントをさせます。
- 滅菌生理食塩水 20 mL 注射器を埋める IV バッグまたはアシスタントによって開催されたバイアルから描画されます。プロシージャの間に公開される組織の潤いを保つために必要に応じてこの生理食塩水を使用します。
- ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM、動脈を洗浄するため) 1 mL と 1 つの 1 mL シリンジを準備します。導入が頚動脈各希釈ウイルスの 0.35 mL が必要です。両側に同じウイルスを使用すると、0.7 mL の容積に DMEM で希釈したウイルス 1 つ 1 mL 注射器を準備します。別の側面が異なるウイルス [たとえば 1 つの側面の"Null"ウイルス コントロール] を受信している場合は、ウイルス ソリューションの 0.35 ml 各 1 mL 注射器、2 を準備します。ヘルパー依存アデノ ウイルス濃度は 2 x 1011ウイルス粒子 (vp)/mL。
注意: は、ウイルスを準備アシスタントをさせてください。外科医は DMEM とウイルスの懸濁液を滅菌注射器に描画します。 - ドレープの穴をカットします。穴の大きさは、2.1.3 の手順でタオルに囲まれたウサギの首に手術部位と同じサイズにする必要があります。タオルのクランプでウサギの首の上にドレープされた基になるタオルに紙のドレープの穴の角をクランプします。
- 一般的な頚動脈を分離します。
注: この部分の手術用ルーペ × 2 を使用ください。- 下顎頭側に向かって約 7-9 cm の拡張正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカット、タオルのクランプで開いて皮をクランプします。
- 尾側端、電気焼灼で筋膜の短い水平カットを作る。大きなハサミを挿入カットそしてぶっきらぼう全体の正中線に沿って筋膜を解剖します。電気焼灼で正中線を切り裂かれた筋膜をカットします。
- 小さな解剖はさみで右側にあるから、一般的な頚動脈を公開する、気管上 V 字筋 (sternocephalic 筋) と胸骨舌骨筋の間解剖します。
- 周囲組織、咽頭神経の交差点に尾の方の首の付け根から、すべての枝を頭側分割から無料右総頸動脈を切り裂きます。解剖時に動脈を取り消すを支援する手術シリコン ループを使用します。
注: 迷走神経、頸動脈に平行または頸動脈を渡る小さい神経を邪魔しないように注意する必要があります。 - 頸動脈の 4-5 cm のセグメントを解放する遠位枝をカットする前に 5-0 絹糸で総頸動脈 (側面ごとの 1-2) をオフに来て、大きな枝を縛る。ネクタイをオフにスリップしていませんので、結紮枝ネクタイから 1-2 mm をカットします。
- 左側にある (手順 2.2.3 - 2.2.5) 郭清を繰り返します。
- 総頚動脈にベクトルを吹き込みます。
注: 手術顕微鏡 (16 X) は、ベクトル/制御ソリューションと切開修理注入切開を実行するために必要に応じて使用されます。- アシスタントの外科医から手術用のルーペを外し、手術顕微鏡を所定の位置に移動ができます。滅菌フィールドを汚染することがなく顕微鏡の操作を許可するために、顕微鏡の上に滅菌タオルを羽織る。
- IV カテーテルにヘパリン [150 国際単位 (IU)/kg] を挿入して生理食塩水 10 mL でフラッシュします。
- 孤立した右頸動脈に戻ると、動員の頚動脈セグメントの中間部分の周りの 2 つのシルク ネクタイを入れてそれぞれ合っていることなしに単一オーバーハンド ノットを結ぶ。
- 大きな針ドライバーを使用して約 80 ° に傾斜面直上 19 G の針を曲げる (曲げていないかさ;図 1)。
- 血管クリップ、充填、動脈を許可する最初の頭蓋のクリップを配置し尾側のクリップを配置すると分離のセグメントの各端に動脈をクランプします。
- ベント 19 G の針を尾側血管クリップでは、背面や側面の壁穴をあけないでに大きな世話にちょうど頭蓋と総頚動脈を穿刺します。内腔に針の先端を進むし、2 回切開は完全に動脈壁を通過するかどうかを確認するそれを撤回します。その後、慎重に針を撤回します。
ノート: それはきれいに動脈壁の全層を貫通しない (外膜とメディア通過軸) で動脈壁を解剖しない切開を作成することが重要です。これを達成するために、頸動脈は動脈壁 (図 1) に 90 ° の角度にできるだけ近くに配置されている針の先端でパンクする必要があります。90 ° の角度で頸動脈穿刺は動脈外膜によって微細鉗子でつかんでリフト ポイントにちょうど尾針の先端を押しながら動脈表面を軽く持ち上げるによって支援されています。この演習は、(図 1) の後ろの壁を打つことのリスクも低減します。 - 展開し、束をいくつかガーゼを注入用注射器をレイアウトするために巣に。ウサギの胸部切開に尾側に巣の場所。
- 含まれている注射器に IV カテーテルを置く DMEM 専用 (きつすぎる) と約 75 ° ベンドを保持するそれが解放された後、先端からカテーテル 〜 4 ミリメートルを曲げます。
- ベンド ポイントまで動脈 IV カテーテルを挿入し、DMEM に動脈から血液はすべてを洗い流す (〜 0.25 mL × 2)。各洗浄のためには、動脈を詰めて DMEM、手袋をはめた指で、始めてちょうど頭蓋血管クリップ仙骨動脈を軽く押す血管内腔から残留 DMEM を取り外します。穏やかな圧力を維持しながら、頭蓋から尾側に指をスライドします。内容は、切開を介してを洗い流し。
- 動脈にカテーテルを続けるし、ウイルス ソリューションの入った注射を DMEM シリンジを交換します。空気にカテーテルが入らないことを確認します。
- 彼らは動脈カテーテル先端の位置を囲むが、締め付けていない動脈をシルクのネクタイをスライドさせます。
- 0.03 mL のカテーテルから残り DMEM をプッシュし、動脈を空にウイルス溶液を注入します。再び指で、(ステップ 2.3.9) のように尾を頭蓋内腔からすべての液体を除去する、それを折りたたみます。
- 内腔をシールにカテーテル先端部周辺のネクタイを 2 本を締めます。ウイルス ソリューションを吹き込む (〜 0.25 mL; 2 x 1011 vp/アデノ ウイルスの mL) 生理学的な口径に動脈が膨張するまで、シリンジのプランジャーを軽く押して。
注: それは動脈生理口径に拡大、ウイルス注入中に膨張したまま重要です。されていない場合は、遺伝子導入の度合いが著しく低下します。 - ガーゼの巣をシリンジそっと置きます。
- 遺伝子伝達の頭蓋の境界をマークする場所だけ仙骨頭蓋血管クリップの一般的な頸動脈外膜で 7-0 ポリプロピレン縫合糸
- ウイルス含有溶液が 20 分間動脈内腔にしたら、ウイルスを含んだ注射器を削除し、空の注射器でそれを置き換えます。船が崩壊し、注射器を削除まで優しくウイルス含有溶液を吸い出しなさい。カットまたはシルク ネクタイを元に戻すし、カテーテルを慎重に取り外します。
注: は、それらを除去するに非常に短いエイズ結束テープを切る。頸動脈の血管内皮細胞へのダメージを避けるために注意深くカテーテルを削除します。 - 7-0 ポリプロピレン X-パターン (図 2) を使用して、切開を閉じる手術顕微鏡を使用して。
- 左下の船に出入りする、切開の右下の最初のパスを作る。開口部を横断し、左上に右上から 2 番目のパスを確認します。
- 縫合を抱き合わせて、前に非常に簡単に頭蓋血管クリップ解放することによって、動脈をフラッシュします。血流が、切開からクリップを離すと、内腔から空気と残留ウイルスを削除します。
- 優しく、切開を閉じると 2 スクエア ノットと縫合糸を結ぶ縫合糸を引き出します。
注: はきつすぎる縫合糸を引いて流れを邪魔する組織のバンチング、血栓症リスクを増加させると疾患モデルでの重要な制御変数をすることができますフローの変更が発生します。
- 頭蓋血管クリップしガーゼで光の圧力を使用して任意の出血を停止する尾びれの血管クリップをリリースします。出血が続く場合は、1-2 分のための圧力を続行します。切開が正常に閉じている場合は出血この時間枠の内で常に停止します。
- アシスタントでフェンタニル血中濃度が治療になるまで、術後鎮痛を提供するこの時間について [0.02 mg/kg; 皮下 (SQ)] ブプレノルフィンを注入しましょう。
注: 2 番目ブプレノルフィン注射器 (0.02 mg/kg。SQ) がフェンタニル血中濃度が治療になるまで鎮痛効果を維持するために、最初の注射後 6 h を必要します。 - 手順 2.3.2 - 2.3.19 の左側にウイルス注入プロトコルを繰り返します。
- 傷の閉鎖
- 5-0 PGA 縫合糸を使用して、連続縫合と正中線筋膜を閉じます。
- 3-0 PGA 縫合糸で両端に埋没の結び目を使用して皮パターンで皮膚を閉じます。
- 手術後の回復とクリーンアップ。
注: ウサギ監視する必要が継続的に適切な酸素と体の温度の麻酔から回復中。回復は、穏やかな、静かな環境で起こるべきであります。- イソフルランと酸素の流れを切り、ウサギからフェイス マスクを削除します。
- 静脈内輸液を外し IV ポートを IV ・ エマージェンシー ・ アクセスのための場所に残ります。
- リカバリ領域にウサギを取るし、オンになって地球温暖化水毛布 (または必要に応じてベア フェイスハガー ヒーター) をケージに横に倒します。
- SpO2が安定するまでは、マスクによって O2を与えます。
- ウサギを反転すること反対側に 15 分毎に、ウサギの後ろ足で起きて、移動できるまで、ケージ内回復しましょう。
- ウサギがモバイルの場合、ケージに戻る前にその耳から IV を削除します。
注: それは完全に麻酔から回復するまで、他の動物の会社にウサギを返しません。
- ベクトルと接触していたや術野にあったものの処分は、次の適切なバイオハザードとシャープ無駄プロトコル。
3. ウサギ頸動脈遺伝子の伝達: 術後ケア
- 外科、創傷治癒のチェック、感染症、食欲不振、呼吸と痛みの兆候証拠後毎日ウサギの全体的な状態を評価します。
- (耳を特にことができます痛みや苦痛のサインだらしのない外観と相まって) ウサギの耳の位置を確認します。ウサギのまま携帯電話やアクティブなことを確認します。喘鳴なし通常呼吸のウサギを確認します。傷口がきれい、乾燥するそしてそのままであることを確認。正常な体温のウサギを確認します。ウサギが携帯電話と正常な体温、すっきりした外観、きれいな傷で、積極的や通常呼吸でない場合は、獣医サービスを参照してください。
- 通常の食物摂取と新鮮な便と尿中の証拠を確認します。
注: 食物摂取術後低下可能性があります。 が、2 日以内に正常に返す必要があります。必要に応じて、栄養補助食品を提供します。
- 術後 3 日目には、フェンタニル パッチを削除します。
注: フェンタニル パッチによって管理されていない術後の疼痛のため必要に応じて、または場合にフェンタニル パッチが早く削除されます、ブプレノルフィンを管理できます。
4. ターミナル収穫手術: 前の操作
- ウサギを麻酔します。達成し、麻酔の維持に関するセクション 1.3、1.3.5 を参照してください。
- ウサギの重量を量る。注射器に 30 mg/kg のケタミン ・ キシラジン 2 mg/kg を組み合わせます。ケタミン ・ キシラジン IM 麻酔を誘導する棘筋を挿入します。
- 麻酔になるウサギを待っている間、準備室やテーブルを準備します。
- OR 準備室で: バリカンとウサギの首と耳のシェービングのための真空をセットアップします。
- 手術室: 監視装置をセットアップし、またはテーブル上 (SpO2温度) のプローブの位置酸素とイソフルランを準備します。ウサギに固定し、テーブルの頭の端にマスク フェイス マスクにガーゼ ストリップを結ぶ。
注: フェイス マスクの裏にガーゼ ストリップ約 45 cm の 2 尾が必要です。 - またはテーブルの上の地球温暖化の水毛布を入れます。水の毛布の上に首サポートと (後でウサギの背中の下に配置) 分散電極板の圧延タオルを配置します。
- リドカイン塩酸 1 mL を組み合わせる (2% 株式) と bupivicaine 塩酸 1 mL (0.5% 株式) (50/50 ミックス) として局所麻酔薬の注射器。
- ウサギは完全に麻酔、手術のウサギを準備します。
- 1.3.1 温度プローブの後での配置を許可するで説明するよう、直腸から便を削除します。
- エリアを清潔に保つための真空を使用しながら下顎角に胸骨切痕からウサギを剃る。パルス酸素濃度計のプローブの左の後部の中間のつま先をまた剃る。
注: プロトコルでは、外科医がウサギの右側にあることを前提としています。またはセットアップが反対側に、外科医、外科医の反対側のワイヤーを維持するこの手順で側面を逆に。必要に応じて、今後のステップの側面を切り替えるもする必要があります。 - OR にウサギを輸送や頭のすぐ下のウサギの首の下の圧延首サポート タオルで手術台に仰臥位場所します。優しくまっすぐであり、およそ水平までは、ウサギの首を拡張します。
- 1 L/分、O2とフェイス マスクまでウサギをフックし、イソフルラン投与を開始します。ウサギの下首サポート タオル周りマスクに縛らガーゼ ストリップの端をラップすることによってマスクを保護します。プロシージャの残りの部分に適切な麻酔を維持するために必要に応じて、イソフルラン (通常 1-2%) を調整します。
- ウサギの背中の下で分散電極板を中心を確認します。温度・ パルス パルスオキシメータのプローブを配置します。
- 疎テーブルにそれらを結ぶことによってウサギの前足を抑制します。
注: 必要に応じて、外科医はウサギの胸部・腹部に圧力をかけてから胸/腹部の圧力にさらされているからウサギを守るためにウサギに小さなプラスチック製のテーブルを配置します。ここでの目標は、腹部の内容の強制逆流を防ぐためです。 - リドカイン (2% 原液) 2 mL を注入/ブピバカイン (0.5% 原液) (50/50 ミックス; からステップ 2.4) 局所麻酔の計画された首切開線に沿って皮下。
- Betadine で手術部位をスプレーします。手術クリーン手袋を入れてください。
5. ターミナル手術 (容器収穫)
- 楽器と手術野を準備します。
- テーブルのドレープとウサギのため 1 つの紙のドレープを含むきれいなドレープ パックを開きます。計測器表をドレープします。
- 器械のパックを開き楽器テーブルの上に置く商品を手配します。楽器のテーブルの上に次の機器を配置: 1 つの 20 mL 注射器と 1 つの 21 G 針。
- 7.25"Kantrowitz 鉗子を使用してウサギ ドレープに電気焼灼器ケーブルを固定します。電気手術ユニットにプラグを接続し、それをオンに。
- 滅菌生理食塩水で 20 mL の注射器を満たしなさい。プロシージャの間に公開される組織の潤いを保つために必要に応じてこの生理食塩水を使用します。
- ウサギの上紙のドレープを置き、ウサギの首に手術部位にドレープの穴をカットします。タオルのクランプでウサギの皮膚に穴の角をクランプします。
- 総頚動脈を分離します。
注: この部分の手術用ルーペ × 2 を使用ください。- タオルのクランプで開いた下顎骨およびクランプ皮頭側に向かって約 7-9 cm を拡張する正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカットします。
注: 収穫は以前の手術後数日、電気焼灼器は必要ありません。縫合糸を切って、軽く引いて開いて切開手術前から。 - 尾側端、電気焼灼で筋膜の短い水平カットを作る。大きなハサミを挿入カットそしてぶっきらぼう全体の正中線に沿って筋膜を解剖します。電気焼灼で正中線を切り裂かれた筋膜をカットします。
- 小さな解剖はさみで右側にあるから、一般的な頚動脈を分離するため、気管に V 字筋 (sternocephalic 筋) と胸骨舌骨筋の間解剖します。
- 頭側の首の付け根から尾側咽頭神経の交差点への組織を周囲から無料の右の動脈を解剖します。解剖時に動脈を取り消すを支援する手術シリコン ループを使用します。
- 左側にある (5.2.4 5.2.3 - ステップ) 郭清を繰り返します。
- 3-0 絹糸で結紮頸動脈頭蓋セグメントに注入されたベクトル (ベクトル注入の頭蓋の範囲を検索する最初の手術に配置使用外の縫合。それから修理の切開に尾側の頸動脈を縛る。
- 消費税を間内頸動脈のセグメントと生理食塩水で内腔をフラッシュします。船から離れて過剰な外組織をトリミングし、別の小さな断片に頸動脈のセグメントを切断エンドポイント解析 (タンパク質、組織学、DNA、リボ核酸 (RNA)、移植文化、等)。
- 安楽死、Beuthanasia IV の 1 mL を注入し、ウサギの安楽死を確認します。
- タオルのクランプで開いた下顎骨およびクランプ皮頭側に向かって約 7-9 cm を拡張する正中線に沿って電気焼灼で皮膚をカットします。
- ベクトルと接触していたや術野にあったものの処分は、次の適切なバイオハザードとシャープ無駄プロトコル。
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Representative Results
このメソッドを実装すると、自信を持って、予備実験がオペレーターが内腔内皮細胞に主に発現との効率的かつ再現可能な遺伝子導入を実現できることを確立する必要があります。我々 の経験でこれは最も簡単に β-ガラクトシダーゼを表すベクトルを使用して評価されます。定量的逆転写ポリメラーゼの鎖と β-ガラクトシダーゼ mRNA (メッセンジャー RNA) の測定と同様に、ベクトル注入後 3 日間を削除 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) は一般的な頚動脈セグメントの染色反応 (qRT PCR)、効率性、再現性、および導入されたセルの位置が表示されます。遺伝子発現の効果を調査またはシスエレメント転写要素の活性を測定する実験のためには遺伝子を測定する通常 mRNA レベルの最初の徴候と遺伝子導入の再現性。
私たちの研究室で新しい演算子ウサギ頸動脈アデノウイルスベクター (2 x 1011 vp/mL) とサイトメガロ ウイルス (CMV) による β-ガラクトシダーゼ遺伝子の表現の伝達によってこのメソッドで能力を確立するように努めたプロモーター。導入された動脈は、収穫の 3 日後をされ、セグメントに横をカットしました。個々 のセグメントは、開いているいずれかのカットを軸に当時もそのままリングのまま。すべてのセグメントは、X ギャル マイクロ遠心チューブ用の染色だった。軸オープン カットされていたセグメントは水平面と最大限に、縮こまってからセグメントを防ぐために必要に応じてピンを使用して公開される内腔面に置かれました。内腔面のアン顔画像は、X-gal (図 3 aと3 b) と堅牢な内皮濃染像を認めた。そのまま頸動脈リングの内腔の表面の画像は、X gal (図 3および3 D) の内腔の表面にのみ染色を示した。軸開かれたセグメントされたパラフィンに加工、断面、およびカウンター ヘマトキシリンとエオシンまたは核高速赤に染まった。イメージ ショー X gal の外の層 (図 3Eと3階) で染色の少量があるものの、血管内皮細胞で主に汚損。外細胞の情報伝達は、切開サイトを通じてまたは側枝結紮のサイトに近位の小さな枝を介して漏洩によるベクターの漏洩によって発生します。29
別の実験で発現、遺伝子の生物学的活動の調査を目的とした実験へのプレリュードとしての再現性の高いレベルを達成する能力を確立する新しい演算子を求めた。ウサギ頸動脈がヘルパー依存アデノ ウイルス (2 x 1011 vp/mL) いずれかアポ A を含む増殖型-私 (HDAdApoAI) または IL-10 (HDAdIL10) 遺伝子、CMV プロモーターの制御の下で両方。導入された動脈伝達後 3 日間収穫をされた、横のセグメントにカットします。RNA は容器のセグメント、および apo A から抽出された-私は、IL-10 mRNA 発現の qRT PCR による定量を行った、グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼの正規化と同じ (GAPDH) mRNA を抽出 (図 4)。HDAdIL10 導入の動脈にのみ 1 のうち 6 動脈が非常に低いが、検出可能なアポ A-私 mRNA 信号。アポ A の表現の意味-私 mRNA が HDAdIL10 で導入した血管よりも HDAdApoAI で導入した船で大きかった 700-fold。動脈の HDAdApoAI 導入で検出された内因性 IL 10 mRNA のレベルが低い、平均値を持つ式は 6 で HDAdIL10 導入動脈を増加しました。注記のうち、変動は, かなり内間 artery 伝達効率で遺伝子発現、それぞれ図 3と4で示すように。我々 は、経験豊富なオペレーターともこの変動を見つけます。
図 1.総頚動脈に切開します。微細鉗子は、内頚動脈外膜を把握し上方牽引を動脈に適用されます。この演習は、血管内腔を拡大し、ベントの 19 G の針を挿入する、それにより動脈の後ろの壁に穴をあけるリスクを最小限に抑える垂直サーフェスを生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.一般的な頸動脈切開の閉鎖。X パターンを使用して 7-0 ポリプロピレン縫合と、切開が閉じられます。縫合針の最初のパスは切開 (サイト 1) の右下に動脈内腔を出入り (サイト 2) 左下の内腔をします。針、縫合は、クロス、切開し右上のルーメン (サイト 3) を再入力します。針は、左上のルーメン (4 サイト) を終了します。縫合糸の両端で穏やかなトラクションは、切開を閉じます。(サイト 1 からサイト 4 終了) 縫合糸の末端は、2 スクエア ノットと関連付けられています。灰色の円は、縫合糸は血管壁を通過のサイトを表しています。縫合が血管壁の外は青い実線で示します。青の点線は、縫合が内腔内にある領域を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.内皮細胞遺伝子発現の効率的な。ウサギ頸動脈が β-ガラクトシダーゼ遺伝子と収穫の 3 日後を表現するアデノウイルスベクターで導入しました。導入された動脈セグメントされた X ギャルそのままリングまたは軸方向切込みで開かれているステンド グラスします。(A・B)En 軸オープン カットされた頸動脈リングの内腔の表面の顔画像。(C・D)そのまま頸動脈リングの管腔の空間に軸のビュー。(E・F)X gal ステンド、頚動脈セグメントのパラフィン包埋切片、カウンター (E) ヘマトキシリンとエオシンまたは (F) 核高速赤に染まった。スケールバー = 100 μ m。私 = 内膜;M = メディア;外膜を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.遺伝子発現定量します。ウサギ頸動脈されたいずれかのアポ A を表現するヘルパー依存アデノ ウイルスで導入した-私 (HDAdApoAI) または IL-10 (HDAdIL10) CMV プロモーターの制御下で。動脈は、3 日後に収穫されました。(A) Apo A の発現-私と il-10 (B) された qRT pcr 法による定量化、同じ動脈における GAPDH の mRNA に正規化および任意の単位 (AU) で表されます。バーは、平均値を示すP値は、順位和検定からです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 利点 | 不利な点 | |
| 齧歯動物モデルと比較してください。 | 近縁な霊長類に近い | 購入し、家のより高価です |
| 大きい遺伝的多様性、臨床的翻訳を緩和 | 繁殖や処理が困難 | |
| 大きな船は簡単に手術操作を許可して定量分析のためのより多くの組織を提供しています | 広範な規制要件 | |
| 人間のために設計された血管内デバイスの使用が可能します。 | 少ない遺伝子組み換え背景 | |
| ウサギ蛋白質への抗体のより少なく広汎な選択 | ||
| 大規模な動物モデルと比較してください。 | 購入し、家の比較的安価です | 血管系疾患のいくつかの他の大きい動物のモデルよりもおそらく少ない臨床的に関連します。 |
| 簡単に繁殖し、処理するには | ||
| 生殖系列の遺伝子導入と比較してください。 | 大きな動脈のみで発現遺伝子興味のあるサイトで具体的には導入遺伝子の効果を定めることができます。 | 血管内皮細胞以外の細胞に対する法の適用は難しい |
| 対コントロールとして対側内頸動脈を使用することができます。全身パラメーターを排除 (e.g、血圧、コレステロール) 自由な変数として。 | 手術室や外科の専門知識が必要です。中核施設が利用できません | |
| 大血管内皮細胞の DNA 規制 sequence アクティビティをテストするためのより高いスループット | ほとんどの血管ベッドで遺伝子は表現できません。 | |
| 可能性があります迅速かつ安価 | ||
| 遺伝子組換えタンパク質の低い全身暴露-オフターゲット効果を最小限に抑える | ||
| 全身の遺伝子療法のアプローチと比較してください。 (例えば。末梢静脈注射による肝シグナル伝達) |
全身 (肝) 遺伝子治療よりもより安定発現 | ベクトル配信は、外科的介入を必要とします。 |
| Transgene 動脈壁で表現される遺伝子組換えタンパク質を高レベルのローカル配信を許可します。 | 手術室や外科的専門知識が必要 | |
| 遺伝子組換えタンパク質の低い全身暴露-オフターゲット効果を最小限に抑える | 介入の具体的対象となる動脈に限られた治療全身的要因は扱いません (e.g、脂質)。 | |
| 対コントロールとして対側内頸動脈を使用することができます。自由な変数として全身パラメーター (血圧、コレステロールなど) を排除します。 | ||
| はるかに低いベクター投与必要 |
表 1。ウサギ頚動脈内皮細胞選択的遺伝子の長所と短所は、モデルを転送します。
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Discussion
手術手技の特定の側面のメリットは特に注意。完全な露出と遺伝子の転送と切開の修復を容易にするため細かくは経由で総頸動脈の動員。ただし、脳血管攣縮を防ぐために、解剖中、頚動脈の直接操作を最小限必要があります。さらに、ガーゼで光の圧力を適用することによって停止する必要があります任意の出血は、動脈に隣接して鬱血は食塩を使用して領域を洗浄によってすぐにクリーンアップする必要があります。また、頸動脈に平行に走っている迷走神経の損傷を防ぐことが重要です。予定切開部の外膜をトリミング演算子清潔で機能的な切開を実行して、切開を修復するのに役立ちます。最後に、総頸動脈の枝を識別し、頚動脈の内腔からベクトルの漏れを防ぐために安全に結紮する必要があります。
また、ベクトル注入・切開修理の重要な側面があります。ベクトル液注入時に、効率的な伝達を達成するために生理学的なまたはわずかに大きい口径に頸動脈を広げるために重要です。切開を修復するとき縫合必要があります、切開の端にできるだけ近い血管壁に浸透し必要がありますきれいに入力し内腔を終了ではなく血管壁を通過する軸。場合にのみギャップ壁通過放射状内腔を入力して、内膜の残り、血栓症のリスクが増加するよりもむしろに縫合が血管壁を軸方向に通過するため、血管壁の外側の層が一緒に引き出されます。貫通部は縫合糸の間隔があまりにも広く、縫合糸は、縛ら過剰強化する場合や、組織のひだを切開で作成されます。これらの褶曲は、通常層流血流、また血栓症リスクの増加を混乱させます。一貫した流れ特性を維持は病気の動物モデルの実験のために重要 (e.g。、アテローム性動脈硬化) 変更された流れが病気プロセス30に貢献できるので。
新しい演算子は、収穫時の血栓性動脈をしばしば発生します。腔の血栓症は、動脈を実験試料として使用できなくレンダリング、壊滅的な合併症です。血栓症を防ぐためには、我々 は日常的に遺伝子導入前にヘパリンを管理します。血栓症は、前述の通りも、切開の注意の閉鎖によって防がれます。血栓症を防ぐためにヘパリン投与量を高めることができるまたは術後アスピリンを与えることができます。しかし、ヘパリンの高用量が出血性合併症の可能性が高まるも、アスピリンは炎症を検討している場合は特に、実験の終了点を妨げます。したがって、だは血栓症を予防する手段として手術手技の改良に集中することが望ましい。
操作も精力的に、頸動脈は流れの減少によって血栓症に貢献できるものけいれんを受ける可能性があります。脳血管攣縮が発生した場合は、局所パパベリンのアプリケーションによって取り除くことができます。容器収穫を導入後、2-3 日以上の計画し、血栓症が懸念される経皮的超音波は非侵襲的血管の開存性を評価するために使用できます。血栓性動脈の発見は、住宅費を節約するために安楽死をもたらすかもしれない。付加的な動物は、実験群に合わせて、速やかに登録できます。ペリとポスト intervention 死亡このメソッドに関連付けられている必要があります < 1% (すなわち。 健康なウサギで他の手術に関連付けられている死亡異なっていない)31。
演算子の後外科プロトコル、代表の結果に上記のセクションで説明した方法を使用して検証される内皮ニーズに効率的な遺伝子導入を行うことの技術的な側面と快適になります。再現可能な遺伝子導入を達成するために問題が発生した場合、犯人は 2 つの領域のいずれかで可能性が高いです。船が分離、内腔から血液を洗浄後注入ベクトル ソリューションの伝達の間に希薄化は DMEM 洗浄バッファーを削除することが重要です。ベクトル液注入時に生理的またはわずかに大きい口径に血管を広げるためには、他の重要です。我々 の経験で完全に膨張がないか残らない膨張した 20 分間注入中に確実に内頚動脈が低発現、動脈の生理学的な口径の膨満感が向上、伝達することと思われます効率。しかし、決して行ったこの体系的に。生理的レベル上の注入圧力を増加させる伝達効率を向上でき、また血管のメディアにおける細胞の伝達のハイレベルを許可可能です。ただし、内皮の障壁の破壊だろう可能性が高い容器の損傷、血栓症のリスクを高めます。船は、全体の 20 分のベクトル-潜伏期間の膨張した残らない場合、ベクトルは、総頚動脈の枝から漏水している可能性が高いです。識別し、頚動脈の内腔からベクトルの漏れを防ぐためにすべての枝を結紮切離時に注意。
このメソッドには、ウサギの使用に関連するいくつかの制限があります。ウサギは家および他の大きい動物 (犬、豚、羊) より供給する安価ただし、購入の費用、住宅とウサギの餌は、かなり以上マウスおよびラット。手術室設備、ウサギの手術に関する規制要件は、齧歯動物のよりもはるかに広範ないます。さらに、かなりの技術的な専門知識は、外科遺伝子の転送プロトコルを効率的に実行する必要です。手術の正式な訓練を持っていない業者では、この専門知識を取得できます。(この原稿の主な著者を含む) 当社グループの少なくとも 2 人を手術手技を習得し、生産的それらを適用しました。それにもかかわらず、オペレーターが高品質のデータを生成する開始する前に、綿密なトレーニングとオペレーターの遺伝子伝達効率と再現性 (代表的な結果のセクションで説明) との慎重な検証が必要です。
ほぼ独占的にこの方法29,32,33,34,35,36,37内皮細胞遺伝子発現の閉じ込めは、します。できる血管内皮細胞における遺伝子効果の調査と cis 演技規制内皮細胞の dna の活性の測定に便利です。外や内側の細胞の数が少ないを導入可能性があります。ただし、このメソッドの nonendothelial 細胞を効率的に変換できない法の適用 (平滑筋細胞やマクロファージ) など血管壁細胞の他のタイプの研究。導入された血管内皮細胞から分泌されるタンパク質の過剰発現は他の血管細胞に対するこれらの蛋白質の効果の調査を許可できますが種類、これらその他の血管の細胞型の非分泌蛋白質の役割 (例えば. 受容体または、シグナル伝達に関与するタンパク質) この方法で調査することはできません。
として動脈壁をターゲットとした遺伝子治療をテストするための手段、方法は 2 つの主要な方法で他の臨床方法から異なります。最初に、メソッドは、生体内でより一般的齧歯動物モデル8,12,15,38,39を使用するのではなく、遺伝子療法の実験家兎モデルを利用しています。ウサギの使用は、近交系齧歯動物よりも人間の遺伝的多様性のより多くの代表者であるザイモグラムの動物モデルにおける遺伝子発現の評価および導入製品の生物学的役割をできます。モデルは、遺伝子療法どちらか通常ウサギ動脈または病気にかかった人間の動脈で見られるような動脈の病理を持つウサギの動脈を評価するために使用できます。また、家兎動脈壁は齧歯動物の動脈は、分析齧歯動物の動脈から利用できるよりもはるかに多くの組織を提供するよりひと動脈にサイズに近い。2 番目の主要な違いは、このメソッドが血管内皮細胞に遺伝子ベクトルを提供する外科的アプローチを使うことです。体細胞遺伝子治療はしばしば、全身最も頻繁によって配信プラズマ遺伝子蛋白質25,40のレベルを変えることを目標に肝臓をターゲットします。血管の内皮細胞をターゲットにメソッドは、それが血管疾患治療で必要な正確に動脈の壁内のピーク濃度と局所的に治療上の遺伝子の製品を提供します。ローカルでのみ遺伝子を提供することによりメソッドは遺伝子プロダクトの全身性の副作用もなくなります。他のグループは、健康または病気の内皮を全身に注入されたベクトルの対象化ペプチド、抗体、キャプシド改造などを使用して、ローカル血管遺伝子治療41,42を提供する手法を開発します。,43します。 ただし、これらのターゲット設定方法は開発の下に残ると実質的な全身伝達、特に肝42,43,44でまだ複雑になり。私たちの手術法は、他の場所で - もしあれば - 最小限の伝達と血管内皮細胞に遺伝子の正確かつ効率的な導入を提供します。1メソッドはまたより便利で効率的、かつ高い-大型の容器の規制の DNA シーケンスのアクティビティのテストの平均 (細菌ライン遺伝子またはベクトルの内皮細胞をターゲットとした全身投与と比較して) 全体内皮細胞、動脈壁のテストの遺伝子蛋白質機能および容器壁標的遺伝子療法の試験。
大きな動脈内皮細胞で表す場合、このメソッドは任意の遺伝子の生物学的役割の解明をできます。支配的な否定的な受容体や短いヘアピン RNA などの機能喪失のエクスプレス試薬へ変更、それは内因性の内皮細胞蛋白質とシグナル伝達経路の役割の検討を許可しました。大きな動脈内皮細胞5,6、7シスエレメントの dna の転写活性を測定する方法が使えます。さらに、メソッドは、効率と安全性内皮へローカルに配信するときの遺伝子の転送ベクトルの任意の種類のテストを可能にし、耐久性遺伝子発現を達成するためにベクトルの能力を明らかにします。最後に、メソッドはベクトルと血管壁をターゲットとした遺伝子治療を提供するように設計された遺伝子の組み合わせを開発およびテストできます。メソッドは、将来的に可能性がありますが治療用の遺伝子を識別するために、スクリーニング ツールとして役立つことができる-すべて太い動脈 (またはすべての病気にかかった大きな動脈) 血管内皮細胞, 経皮的に挿入された血管壁をターゲットとしたベクトルで配信されます。ヒト アデノ ウイルス 5 型45で既存の免疫、臨床応用のアデノ ウィルスのタイプ 5 ベース ベクトルを使用する課題となります。AAV は血管遺伝子治療をクリニックに持参する必要があるなどの代替のアデノ ウイルス血清型46、少ない免疫原性のベクトルの使用の使用 5 アデノ ウイルス キャプシドのエンジニア リングします。実験ツールとしてしかし、我々 は、知らなかったヘルパー依存アデノ ウイルス 5 血管1発現の効率と耐久性を達成するためと競うことができるベクトルの。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は AdVec、株式会社 HDAd 試薬、ジュリア Feyk 行政支援のため、手術のアドバイスを比較医学部獣医サービスを使用する許可のために感謝し、サポートします。この作品は、HL114541、ジョン l. ロック ジュニア公益信託によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
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