Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vivo Gen transferi için tavşan ortak Karotid arter endotel

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/56982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, University of Washington

Summary

Bu yöntem bir transgene tavşan Karotid arter endotel tanıtmak için hazırlanmıştır. Transgene getirilmesi transgene ürün normal damar veya hastalık modelleri biyolojik rolü değerlendirmesini sağlar. Yöntem düzenleyici DNA dizilerinin etkinliği ölçmek için yararlıdır.

Abstract

Bu yöntem bir transgene izole segmentlerinin her iki tavşan ortak Karotid arter endotel tanıtmak için hedeftir. Böylece bir dedektif endotel ifade transgenes biyolojik rolleri belirlemek ve DNA dizilerinin büyük arter içinde vivo transkripsiyon etkinliği ölçmek için izin veren odak seçici endotel transgenesis yöntemi elde endotel hücreleri. Bir transgene ifade viral vektör Arteryel lumen teslim için tavşan ortak Karotid arter ve bir arteriotomy cerrahi yalıtım yöntemini kullanır. Lümen vektörde kısa kuluçka süresi Lümen içindekiler sonraki aspirasyon ile tespit iletim veya ifade dışında endotel transgene verimli ve dayanıklı ifade ulaşmak için yeterli izole arter kesimi. Yöntemi biyolojik etkinlikler transgene ürünlerin değerlendirilmesi normal arterler ve modelleri insan damar hastalığının gen teslim (örn. diğer sitelere hedefleme tarafından kaynaklanmış olabilir sistemik etkileri kaçınırken sağlar karaciğer) veya genetik yapıları için endotel germ hattı transgenesis tarafından teslim alternatif bir yaklaşım. Uygulama yönteminin yetenekli bir cerrah ve anestezi, iyi donanımlı ameliyathane, satın alma ve konut tavşan maliyetlerinin ihtiyacını ve uzmanlık gen transferi vektör yapım ve kullanım için ihtiyaç ile sınırlıdır. Bu yöntem ile elde edilen sonuçlar içerir: transgene ile ilgili değişiklikler arter yapısı, cellularity, hücre dışı matriks veya vasomotor işlevi; artar veya damar iltihabı indirimleri; vasküler hücre apoptosis içinde değişiklikler; ve ilerleme, geriliği veya regresyon intimal Hiperplazi veya ateroskleroz gibi hastalıkların. Yöntemi aynı zamanda doğal ve sentetik DNA düzenleyici diziler transgene ifade içeren sonuçları sağlayan endotel hücrelerinde değiştirme olanağı ölçümü sağlar: transgene düzeyde mRNA, transgene protein düzeyleri ve düzeyleri transgene enzimatik aktivite.

Introduction

Bu yöntem bir transgene tavşan ortak Karotid arter endotel tanıtmak için hedeftir. Transgene getirilmesi transgene ürün biyolojik rolü değerlendirilmesi normal arter hem de insan arter hastalığı tavşan modelleri sağlar. Hastalık modelleri transgene overexpression transgene (ve protein ürün) terapötik ajanlar1,2,3,4olarak umut verici olup olmadığını ortaya çıkarabilir. CIS etkili düzenleyici elemanlarının transgene ifade kaset içinde eklenmesi damar endotel vivo içinde5,6bu öğeleri etkinliğinin değerlendirmesi sağlar. Belirli CIS etkili düzenleyici elemanlarının faaliyet bilgi daha aktif ifade kaset tasarlamak için ve büyük damar endotel vivo içinde7gen düzenlemesi mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Adatavşanı are çeşitli yönlerini insan vasküler Fizyoloji ve hastalık için değerli bir model. Tavşan insanlarla birçok damar özellikleri şunlardır. Örneğin, temel hematolojik değerler, Kan durdurucu sargı yönetmelik ve vasküler boyuna gerginlik tavşan ve insanlar8arasında benzer. Tavşan modelleri vasküler hastalıklar çoğaltmak temel özellikleri de dahil olmak üzere birçok insan hastalıkları: anevrizma (benzer geometrik ve akış özellikleri)9, vasospasm (benzer tepki Endovasküler tedavi)10,11, ve ateroskleroz (intimal plaklar ile benzer özellikler bir çekirdek lipid, makrofajlar ve düz kas hücrelerinde zengin lifli bir kap içinde dahil)12,13. Buna göre tavşan modelleri tromboz, vasospasm, anevrizma, şeker hastalığı, damar grefti stenoz ve ateroskleroz8,13,14, gibi birçok vasküler hastalık gelişmiş için 15,16.

Vasküler Fizyoloji ve hastalık hayvan modelleri arasında seçme araştırmacılar için tavşan birçok avantajı vardır. Kemirgenler karşılaştırıldığında, tavşan daha büyük gemilerin kolay cerrahi işleme, Endovasküler cihazların kullanımı ve doku nicel ölçümler için daha büyük bir miktarda sağlar. Tavşan kemirgenler17daha filogenetik primatlar için çok daha yakın ve daha fazla genetik çeşitlilik outbred tavşan, daha iyi insanlar genetik değişkenliği yaklasik. Genetik çeşitlilik preklinik çalışmaları için özellikle önemli olan-genetik olarak farklı insan nüfus için uygulanan tedaviler geliştirmek için onların doğa amacı tarafından. Eğer tüm diğer birçok model türü ile tavşan genler kolayca klonlanmış veya tavşan genom ile yüksek kapsama sıralı çünkü sentez (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Diğer büyük hayvan modeller (örneğin, köpek, domuz ya da koyun) karşılaştırıldığında, tavşan satın almak nispeten ucuzdur ve ev ve onlar doğurmak ve işlemek daha kolaydır. Tavşanların her belirli vasküler hastalık modelleri bu el yazması8,12,18kapsamı dışındadır insan hastalık modelleri olarak kendi avantajları ve eksiklikleri vardır. Bir araştırmacı bu avantajları ve tavşan deneysel sorularınıza cevap için en iyi modeli olup olmadığını belirlemek için eksiklikleri gözden geçirmelidir.

Giriş endotel hücreleri vivo içinde içine deoksiribonükleik asit (DNA) düzenleyici sıralarının soruşturma bu dizilere karmaşık bir fizyolojik ortamda faaliyet sağlar. Vitro çalışmalar transfected endotel hücrelerindeki DNA düzenleyici dizileri ilk değerlendirme için yararlı olabilir; çalışmalar tekrarlanan vivo içinde5,19,20olduğunda ancak, doku kültürü modelleri seviyelerinde ifade bazen çoğaltılabilir değil. Vitro sistemleri de kültürlü vasküler hücreler arasında protein sinyal ve endotel fizyolojisi hem de iletişim temel yolları keşfetmek için yararlı olabilir; Ancak, daha karmaşık yollar veya karmaşık nüfus komşu vasküler hücre veya bağışıklık sistemi tarafından etkilenmiştir düzenleyici ağları en iyi bir vivo içinde sistem6,20dakikaya okudu. Burada açıklanan yöntemi, düzenleme çerçevesinde endotel transgene ifadesinde veya hastalık olmadan sağlam bir geminin, keşfetmek için bir platform sağlar. Vivo sistem aynı zamanda fizyolojik ve patolojik hücresel crosstalk incelenmesi ve katkıları için düzenleme gen ifade6, bağışıklık sisteminin tanımlaması izin verir.

Mikrop-line transgenesis (özellikle farelerde) transgene ifade endotel hücrelere yönetmenlik için alternatif bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım ömür boyu transgene ifade, endotel aracılı belirli organizatörü veya düzenleyici bölgeleri21,22tarafından hedeflemede sağlayabilir. Ancak, transgenik fareler zaman alıcı ve pahalı olduğunu, birkaç transgenik hattı kez istenilen hücre tipi ve başarı yeterli transgene ifade düzeylerinin ve deneysel transgene hedefleme emin olmak için test gerekir fare sistemleri sonuçlarında zorlanma bağımlı olabilir. Endotel hedefli transgenes ile fare transgenik modelleri pek çok avantajı var: cerrahi transgenesis elde etmek için her deneysel hayvan üzerinde gerçekleştirmek için gerek yoktur, deneysel fareler çok sayıda diğer kullanılabilir transgenik farelerde ile yetiştirilmiş genetik ve fenotipik etkileşimleri test etmek için sipariş ve fenotipleri karakterizasyonu kolaylaştırmak fare proteinler ile tepki antikorların geniş bir seçim. Ancak, genellikle transgenes germ hattı üzerinden endotel için hedefleme transgene ifade damarlara, hangi transgene ürün etkili olan siteyi belirlemek üzere22 boyunca sonuç. Transgene ürün salgılanan, damarlara boyunca endotel hücreleri tarafından salgılanan bir transgene ürün içerisindeki bir hayvan sitelerin her noktada biyolojik aktivitesi olabilir çünkü bu özellikle doğrudur. Bu el yazması anlatılan yöntem teknik uzmanlık ve özel İmkanlar gerektirir, ancak daha az zaman alıcı ve bir özel endotel transgenik fare çizgi geliştirme daha ucuz olabilir. Bu işlev, bir kesim büyük arterin endotel hücreleri seçerek bir proteinin değerlendirilmesi için sağlar ve kontralateral ortak karotis kullanımına (deneysel arasında değişebilir sistemik faktörleri ortadan eşleştirilmiş denetimi olarak izin verir hayvanlar-Örneğin, kan basıncı veya kolesterol düzeyleri-kontrolsüz değişkenler olarak).

Gen tedavisi damar hastalıklarının tedavisi için umut verici bir yaklaşımdır özellikle kronik hastalıklar, çünkü tek bir uygulama sürekli ya da büyük olasılıkla ömür boyu ifade bir tedavi gen23sağlayabilir. Gen tedavisi tedavi vaadi somatik gen transferi, sık sık kan yoluyla birçok viral vektörler hepatotropic çünkü nispeten kolay bir hedef olan karaciğer24,25, hedefleme hayvan modellerinde keşfedilmeyi. Ancak, damar hastalıkları üzerinde etkisi olduğu için karaciğere hedef gen tedavisi sistemik overexpression proteinlerin elde etmek gerekir. Bu genellikle büyük dozlarda toksik veya hatta ölümcül26olabilir vektör gerektirir. Ayrıca, sistemik protein zam hedef kapalı yan etkileri, karmaşık veya hatta deneysel sonuçlar yorumlanması karanlık riskini düzeyde arttı. Çünkü infüzyon vektör yaygın olarak transduced Arteryel segment Dissemine değil ve yerel vasküler etkileri olmadan elde edilebilir bu el yazması açıklandığı gibi vasküler endotel hedefleme yerel gen tedavisi sistemik yan etkileri önlemek olabilir Sistemik plazma düzeyleri protein değişimler. 27 vektör çok daha düşük bir miktarda Ayrıca, sağlam hepatik iletim ulaşmak için gerekenden bir Arteryel kesimini transduce gerekiyordu. Karaciğer ifadeden transgene üst düzey transgene ifade saklanması için ise tekrarlanan dozaj gerektiren büyük olasılıkla hücre ciro nedeniyle, zaman içinde azalmaya bildirilmiştir. 28 buna ek olarak, istikrarlı ifade en az 48 hafta chow beslenen tavşanların ve en az 24 hafta kolesterol beslenen tavşanların aterosklerotik lezyonları içinde endotel düşük devir hızı sağlar. 1 , 27

Bu yöntemi, gen transferi tavşan ortak Karotid endotel için uygun olup olmadığını belirlemek için özel araştırma hedefleri bağlamında avantajları ve dezavantajları (Tablo 1) dikkate alınmalıdır. Bu yöntemin avantajları şunlardır: outbred adatavşanı are insan genetik çeşitliliğin daha iyi temsilcisi daha doğuştan fareler (preklinik iş için önemli); Tavşan daha kolay manipülasyon için daha büyük gemiler ve daha fazla doku analizi için sağlar; yöntem endotel hedefli transgene ifade mikrop-line transgenik farelerde hedefleme endotel göründüğünden çok daha hızlı bir şekilde elde edebilirsiniz; vektör doz kolaylıkla modeli çeşitli düzeyleri transgene ifade için ayarlanabilir; büyük damar endotel için belirli işlemleri soruşturma olması; ve yerel vasküler transgenesis ters karotis aynı hayvan kontrolsüz değişkenler olarak sistemik faktörleri ortadan bir denetim olarak kullanılmak üzere izin verir. Dezavantajları şunlardır: Özel İmkanlar ve uzmanlık gereklidir; daha az genetiği değiştirilmiş arka plan hangi deneme tavşan farelerde kullanılabilir; ve tavşan fare proteinler (için immunodetection transgene protein ve deneysel sonuçlar yorumlama önemli olabilir diğer antijenleri) karşı antikorlar daha az kapsamlı bir seçki.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada Washington Office hayvan refahı ve ilişkili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ve uygun olarak ve tüm ile uyum içinde tamamlanmıştır ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri.

Not: Gen transferi için tavşan ortak Karotid arter tavşan bir anestezi uzmanı veya Yardımcısı Yardımı ile bir cerrah tarafından gerçekleştirilir.

1. gen transferi için tavşan ortak Karotid arter: işlem öncesi

  1. Tavşan anestezi. Tavşan tartın. 30 mg/kg ketamin ve 2 mg/kg xylazine bir şırınga birleştirir. Ketamin/xylazine kas içi (IM) anestezi ikna etmek için paraspinous kaslara enjekte.
  2. Anestezi haline tavşan için beklerken, Hazırlık odası ve ameliyathane (OR) tablolar hazırlamak.
    1. OR Hazırlık odasında: oftalmik merhem ve fentanil yama ulaşmak içinde hazırlama tablo; saç kesme makineleri ve tavşan boyun ve kulak tıraş için bir vakum ayarlamak; bir alkol hazırlık pad, kateter 24G x ¾", bir enjeksiyon bağlantı noktasını ve tavşan kulak ven intravenöz (IV) doğrultusunda güvenli cerrahi bant kenara.
    2. Veya: kadar izleme ekipmanları ayarlayın ve sondalar [Elektrokardiyogram (EKG), oksijen doygunluğu (SpO2), sıcaklık] OR masaya; pozisyon oksijen ve isoflurane hazırlamak; tavşan için güvenli ve tablo baş ucunda maske yerleştirmek için yüz maskesi gazlı bez prizine bağlayın.
      Not: yüz maskesi bağlı gazlı bez şeritler 2 kuyrukları yaklaşık 45 cm olmalıdır.
    3. Isınma su battaniye OR tablo açın. Üstünde tepe-in su battaniye, boyun desteği ve (daha sonra tavşan geri altında yer) bir dağıtıcı elektrot plaka rulo havlu getirin.
    4. Bağlı ve 10 mL/h kg başına akış oranını ayarlamak bir 18-19 G iğne ile 100 mL serum fizyolojik bir IV çanta veya IV pompasıyla ayarlayın.
    5. Lidokain HCl 1 mL birleştirmek (% 2'stok çözelti) ve bölgelerelidokain HCl 1 mL (% 0.5 hisse senedi çözüm) içinde yerel bir analjezik kullanılmak üzere bir şırınga.
  3. Tavşan ne zaman tavşan tam anestezi, ameliyat için hazırlayın.
    Not: Onay için pedal refleks (ayak bir tutam; göz bacak çekilmesi için) eksikliği anestezik derinlik sağlamak ve ameliyat boyunca pedal refleks izlemeye devam edin.
    1. Oftalmik merhem gözler için geçerlidir. Dışkı ile alt ön karın (rektum) yukarıda eldivenli parmak ve anüs doğru hareketli parmak basarak tavşan rektum kaldırın. Bu bir rektal sıcaklık probu sonraki yerleşim için izin verir.
    2. Çene kenarına sternal çentik üzerinden boyun ön bölgeyi temiz tutmak için bir vakum kullanırken tıraş. Ayrıca her iki kulak için IV yerleştirme ve fentanil yama eki tıraş ve sol arka orta ayak Nabız oksimetri sonda için tıraş.
      Not: Protokol cerrah bütün prosedür için tavşan sağ tarafında olduğunu varsayar. OR Kur karşı tarafta cerrah yerleştirirse, teller ve cerrah karşısında IV tutmak için bu adımı taraf ters. Gelecekteki adımları taraf da gerektiği şekilde değiştirdim.
    3. Bir alkol hazırlık pad ile sol kulak temizlemek, bir 24 G IV kateter sol kulak damar içine yerleştirin, enjeksiyon bağlantı noktası ile kap ve kateter/bağlantı noktasına güvenli için tavşan kulak teyp. Fentanil yama (25 µg/h) tavşan sağ kulak için geçerlidir.
    4. Tavşan Ameliyathaneye taşıma ve baş altında belgili tanımlık adatavşanı boyun altında haddelenmiş boyun destek havluyla ameliyat masasında sırtüstü yerleştirin. Düz ve yaklaşık yatay kadar yavaşça tavşan boyun uzatmak.
    5. Tavşan en yüz maskesi O2 ile 1 L/dak kanca ve isoflurane Merkezi'ni başlatın. Maske maske boyun destek havlunun altında tavşan çevresinde bağlı gazlı bez şerit uçları sarma tarafından güvenli. (Bağlı olarak kalp atışı, solunum hızı ve pedal refleks) yordamın anımsatıcısını için uygun anestezi korumak gerektiği gibi isoflurane (genellikle % 1-2) ayarlayın.
    6. Dağıtıcı elektrot plaka tavşan geri altında ortalanır emin olun. Sıcaklık ve nabız oksimetre probları yerleştirin ve EKG müşteri adayları için tavşan uygulayın.
    7. IV tuz tuzlu pompa 10 mL/sa kg başına başlayan tavşan kulakta kateter bağlantı noktasına bağlamak.
      Not: 1 h sonra tuzlu su pompası 5 mL/h kg başına azaltılabilir.
    8. Tavşan ön bacaklar gevşek masaya onları bağlayarak dizginlemek. İsteğe bağlı olarak, küçük bir plastik masa tavşan tavşan için göğüs/karın basınç tavşan göğüs/karın bölgesinde eğilerek cerrah üzerinden tabi korumak için üzerine getirin.
      Not: Küçük masa karın içindekiler zorla Regürjitasyon önleyebilir.
    9. Önceden hazırlanmış Lidocaine (% 2'stok) 2 mL enjekte / bupivacaine (% 0.5 hisse senedi) (50/50 mix) lokal anestezi için planlı boyun kesi hattı boyunca subkutan.
    10. Scrubs klorheksidin ve isopropanol ve bir sprey betadin ile dönüşümlü olarak 3 ile cerrahi site hazırlamak yardımcı'yı ver. Bodur, cüppe ve eldiven, uygun aseptik teknik takip.
      Not: Cerrah ameliyat ilk yarısında ile yardım için cerrahi büyüteçler x 2 takmalı. Hayatta kalma ameliyat sırasında cerrah ve cerrahi alan kısırlık korumak için çok önemlidir. Sadece Yardımcısı steril olmayan öğeleri işleme şeklini ve steril malzemeler aseptik cerrah için geçirilen veya gerekir bol dökümlü enstrüman masanın üzerine yerleştirilir. Steril havlu cerrah tarafından mikroskop gibi steril olmayan donanımları manipüle süre kısırlık korumak için kullanılabilir.

2. survival cerrahi (gen transferi)

  1. Aletleri ve steril alan hazırlamak.
    1. Bir masa örtüsü, bir kağıt asmak için tavşan ve birkaç havlu içeren steril örtü Çantayı aç yardımcısı olsun. Aseptik maddeleri cerrah için transfer.
    2. Aracı tablo asmak. Yer 6 Steril havlu ve kağıt bol dökümlü masa üstünü örtmek.
    3. 4 havlu ile tavşan boyun maruz yalnızca cerrahi sitesi (yaklaşık 4 cm x 10 cm) bırakarak, asmak. Kağıt örtüsü tavşan için yatıyordu.
    4. Sterilize edilmiş araç paketi açın ve aseptik alet masaya koyun yardımcı'yı ver.
    5. Aşağıdaki donanımları açın ve aseptik alet masaya yerleştirin ya da el cerrahı için yardımcı'yı izin: üç 1 mL şırınga (ve şırıngaları zaten iğneler ile yüklü değil Eğer bir iğne), bir 20 mL şırınga, bir 21G iğne, bir 19G iğne, 3-0 Poliglikolik asit (PGA) dikiş, 5-0 PGA dikiş, 7-0 polipropilen sütür ve iki 24 G IV-kateter.
    6. Elektrokoter kablo 7,25 sonunda masadan Kantrowitz forseps ve sonra açılan fişi "kullanarak tavşan örtüsü için güvenli. Elektrokoterizasyon birimine kabloyu bağlayın ve yazıcıyı açın yardımcı'yı ver.
    7. 20 mL şırınga steril serum, doldurmak bir IV çanta veya Yardımcısı tarafından düzenlenen şişe çizilmiş. Bu serum maruz doku işlem sırasında nemli tutmak için gerektiği gibi kullanın.
    8. Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM, arter yıkamak için) 1 mL bir 1 mL şırınga hazırla. Her Karotid arter, transduced seyreltilmiş virüs 0,35 mL ihtiyaç vardır. Aynı virüs her iki taraf için kullanılırsa, bir 1 mL şırınga ile DMEM içinde 0.7 mL bir birime seyreltilmiş virüs hazırlayın. Farklı açılardan farklı virüsler [Örneğin bir "Null" virüs kontrolü bir tarafta] alıyorsanız, iki 1 mL şırınga, her biri 0,35 mL virüs çözeltisi hazırlamak. Yardımcı bağımlı adenovirus için virüs konsantrasyonu 2 x 1011 viral parçacıkların (vp) olduğunu / mL.
      Not: virüs hazırlamak yardımcı'yı ver. Cerrah DMEM ve virüs süspansiyon kadar steril şırınga çekiyor.
    9. Örtüsü delik. Deliğin boyutunu havluların içine adım 2.1.3 tarafından çerçeveli tavşan boyun cerrahi ücreti olarak aynı boyutta olması gerekir. Kağıt asmak belgili tanımlık adatavşanı boyun üzerinde havlu Mengeneler ile bol dökümlü temel havlu için delik köşe kelepçe.
  2. Ortak Karotid arter yalıtmak.
    Not: Bu bölümü için 2 x cerrahi büyüteçler kullanılmalıdır.
    1. Yaklaşık 7-9 cm cranially çene doğru uzanan orta çizgi boyunca bir elektrokoter ile deriyi kesme ve cilt aç havlu Mengeneler ile kelepçe.
    2. Kaudal sonunda şerit elektrokoter ile ile kısa bir yanal kesme yapmak. Büyük makas kesim takın ve açık açık tüm orta çizgi boyunca fasya incelemek. Elektrokoter ile orta hat aşağı disseke fasya kesti.
    3. Küçük parçalara makasla V şekilli kaslar (sternocephalic kas) ve sternohyoid kas arasında ortak Karotid arterler, sağından başlayarak ortaya çıkarmak için nefes borusu üzerinde incelemek.
    4. Şu ortak Karotid arter dokular, cranially boyun caudally için faringeal sinir geçiş Bankası üzerinden tüm dalları bölünmesi çevreleyen ücretsiz incelemek. Arter diseksiyonu sırasında geri çeker içinde yardım etmek için cerrahi silikon döngüler kullanın.
      Not: Ortak karotis paralel vagus siniri veya ortak şahdamarı üzerinde çapraz daha küçük sinirler değil rahatsız etmek için özen gösterilmelidir.
    5. Herhangi bir büyük dalları klemple şahdamarına bir 4-5 cm parçasını ücretsiz için dalı kesme önce 5-0 ipek sütür ile ortak Karotid arter (yan başına 1-2) kapalı geliyor ligate. Kravat kapalı kayma değil ve birleştirilmiş dalları 1-2 mm tie uzak kesmek.
    6. Diseksiyon (Adım 2.2.3 - 2.2.5) sol tarafında yineleyin.
  3. Vektörel çizimler ortak Karotid arter süzülür.
    Not: Cerrahi mikroskop (16 X) arteriotomy, vektör/kontrol çözümü ve arteriotomy onarım beslerken gerçekleştirmek için gerektiğinde kullanılır.
    1. Asistan cerrah cerrahi büyüteçler kaldırmak ve cerrahi mikroskop yerini ver. Mikroskop mikroskop manipülasyon steril alan bulaşıcı olmadan izin üzerinde steril bir havlu asmak.
    2. IV kateter içinde [150 uluslararası birimler (IU) /kg] heparin enjekte ve 10 mL serum fizyolojik ile yıkayın.
    3. İzole şu ortak karotis dönersek, seferber Karotid segment orta kısmı etrafında iki ipek kravat koymak ve her - onları sıkma olmadan tek bir yukarıdan aşağı düğüm kravat.
    4. Büyük iğne sürücüyü kullanarak yaklaşık 80 ° ila 19 G iğne hemen üzerinde eğim viraj (eğimi; eğmek değil Şekil 1).
    5. Vasküler klipleri, ilk dolum arter için izin vermek için kafatası klibi yerleştirerek ve sonra Kaudal klip yerleştirerek izole segment her ucundaki arter kelepçe.
    6. Sadece arka veya yan duvarları delmek değil çok dikkat çekici Kaudal vasküler klibine kafatası bükülmüş 19 G iğne ile ortak Karotid arter delik. İğne ucu Lümen ilerlemek ve iki kez arteriotomy tamamen arter duvar erişir emin olmak için geri. O zaman dikkatle iğne geri alıyorum.
      Notlar: Bu arter duvarının tüm katmanları temiz bir şekilde nüfuz eder ve Arter duvar (eksenel adventitia ve medya üzerinden geçerek) incelemek değil bir arteriotomy oluşturmak önemlidir. Bunu yapmak için şahdamarına mümkün olduğunca yakın arter duvarın (şekil 1) 90 ° açıyla yerleştirilmiş iğne ucu ile delinmiş. 90° açıyla Karotid ponksiyon arter adventitia tarafından iyi Forseps ile kapma ve yavaşça iğne ucu sadece Asansör noktasına Kaudal basarken arter yüzey kaldırma destekli. Bu manevra da arka duvar (şekil 1) isabet riskini azaltır.
    7. Açılmak ve grup-birkaç gazlı bez yastıkları bir yuva hangi İnfüzyonlar için kullanılan şırınga bırakmaya kadar. Yuvayı tavşan göğsüne belgili tanımlık kesme Kaudal yerleştirin.
    8. IV-kateter içeren şırıngayı koymak sadece DMEM (çok sıkı değil) ve böylece yayımlandıktan sonra viraj 75 ° tutar ~ 4 mm kateter ucundan viraj.
    9. Arter bend noktaya kadar IV-kateter takın ve Arter DMEM ile tüm kan dışarı yıkamak (~ 0.25 mL x 2). Her yıkama için arter DMEM ile doldurmak ve yavaşça arter ile sadece kafatası vasküler klibine Kaudal başlayan eldivenli bir parmak basarak arta kalan DMEM gemi Lümen kaldır. Hafif basınç korurken, parmak kafatası Kaudal için kaydırın. Luminal içeriği ile arteriotomy yıkama olacak.
    10. Kateter arter içinde tutmak ve virüs solüsyon içeren şırınga DMEM şırınga değişimi. Havasız kateter girer emin olun.
    11. Böylece onlar arter kateter ucu bulunduğu konumda surround, ama onları sıkın değil ipek bağları atardamar aşağı kaydırın.
    12. Kateter dışında kalan DMEM itmek ve Arter boş virüs çözümü 0,03 mL süzülür. Tekrar tüm sıvı bir parmak, kafatası için (aynı derecede içinde adım 2.3.9) Kaudal Lümen kaldırarak daraltın.
    13. Lümen imzalamaya kateter ucu etrafında iki bağları sıkın. Virüs çözümü demlemek (~ 0.25 mL; 2 x 1011 vp/mL adenovirus için) arter fizyolojik kalibre şişmiş kadar basarak şırınga pistonu hafifçe.
      Not: Bu arter fizyolojik kalibre genişletir ve virüs infüzyon sırasında şiş kalır önemlidir. Eğer değilse, gen transferi derecesi önemli ölçüde düşecek.
    14. Şırınga gazlı bez yuva üzerinde yavaşça yere bırak.
    15. 7-0 polipropilen sütür ortak Karotid adventitia sadece Kaudal gen iletim kafatası sınır işaretlemek için beyin damar Clip yer
    16. Virüs içeren çözüm 20 dk arter Lümen olmuştur sonra virüs içeren şırınga kaldırın ve eski yerine koymak o ile boş bir şırınga. Gemi çöker ve şırınga kaldırmak kadar virüs içeren çözüm yavaşça Aspire edin. Kesmek veya ipek kravat geri al ve yavaşça kateter çıkarın.
      Not: izale onları içinde çok kısa AIDS bağları kesme. Dikkatle Karotid endotel zarar önlemek için kateter kaldırın.
    17. Cerrahi mikroskop kullanarak, arteriotomy 7-0 polipropilen ile bir X-desen (Şekil 2) kullanarak kapatın.
      1. Arteriotomy, sağ alt girme ve geminin sol alt köşesinde çıkarken bir ilk geçiş yapmak. Daha sonra açılış çapraz ve sol üst için üst-sağdan ikinci Kur.
      2. Sütür bağlama önce arter çok kısaca beyin damar klip serbest bırakarak floş. Klip yayınlandığında, kan arteriotomy dışarı Lümen hava ve kalan virüs kaldırma akacaktır.
      3. Yavaşça arteriotomy kapatmak ve dikiş ile 2 kare knot kravat için dikişi çekin.
        Not: dikişi çok sıkı çekerek akışı rahatsız etmeyecek dokusunun demetleme, tromboz riski artan ve giden hastalık modelleri içinde önemli bir kontrolsüz değişken olabilen akımı neden olur.
    18. Beyin damar klip ve Kaudal vasküler küçük bir kanama durdurmak için gazlı bez ile hafif basınç kullanarak serbest bırakın. Kanama devam ederse, basınç 1-2 min için devam edin. Arteriotomy düzgün kapattıysanız, kanama her zaman bu zaman dilimi içinde durur.
    19. Buprenorfin [0,02 mg/kg; cilt altı (SQ)], fentanil plazma düzeyleri tedavi olana kadar ameliyat sonrası analjezi sağlamak için bu zaman hakkında enjekte yardımcısı olsun.
      Not: Bir ikinci buprenorfin enjeksiyon (0,02 mg/kg; SQ) 6 h sonra ilk enjeksiyon fentanil plazma düzeyleri tedavi olana analjezi korumak için gerekli olabilir.
    20. Virüs infüzyon protokolü aşağıdaki adımları 2.3.2 - 2.3.19 sol tarafında yineleyin.
  4. Yara kapatma
    1. 5-0 PGA dikiş orta hat şerit sürekli dikiş ile kapatmak için kullanın.
    2. 3-0 PGA dikiş ile gömülü bir düğüm her iki uçta da kullanarak bir intradermal desenli deri kapatın.
  5. Ameliyat sonrası kurtarma ve Temizleme.
    Not: Tavşan sürekli olarak uygun oksijenlenme ve vücut sıcaklık için anesteziden kurtarılırken izlenmesi gerekir. Kurtarma sakin, sessiz bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
    1. İsoflurane ve oksijen akışını ve yüz maskesi tavşan çıkarın.
    2. Serum çöz ama IV bağlantı noktası Acil serum için yer bırak.
    3. Tavşan kurtarma alanına alın ve açık bir ısınma su battaniye (veya bir Bair Hugger ısıtıcı ile isteğe bağlı olarak) bir kafes içinde kendi tarafında yatıyordu.
    4. SpO2 stabil olana O2 maskesiyle ver.
    5. Tavşan tavşan arka ayakları üzerinde oturur ve hareket kadar her 15 dk, diğer tarafa saygısız bir kafese kurtarmak izin.
    6. Tavşan mobil olduğunda, IV kafese dönmeden önce onun kulaktan kaldırın.
      Not: tam anesteziden kurtarılır kadar tavşan diğer hayvanlar şirkete döndürmüyor.
  6. Aşağıdaki uygun biohazard ve "Sharps" protokolleri atık, vektör ile temas veya operatif alanında bir şey atmayın.

3. gen transferi için tavşan ortak Karotid arter: post operatif bakım

  1. Tavşan genel durumu değerlendirmek günlük cerrahi, yara iyileşmesi için kontrol, enfeksiyon, iştah, solunum ve ağrı belirtileri kanıtı sonra.
    1. (Kulakları aşağı bir işareti acı ve sıkıntı, özellikle dağınık bir görünüm ile birleştiğinde olabilir) tavşan kulak konumunu kontrol edin. Tavşan mobil ve etkin kalır kontrol edin. Tavşan stridor olmadan normal solunum için kontrol edin. Yarayı kuru, temiz ve sağlam olup olmadığını kontrol edin. Tavşan için normal vücut ısısı kontrol edin. Tavşan mobil ve aktif, normal vücut sıcaklığı, derli toplu bir görünüm, temiz yara ve normal solunum değilse Veterinerlik Hizmetleri bakın.
    2. Normal gıda alımı ve taze dışkı ve idrar için kontrol edin.
      Not: Gıda alımı ameliyatı takiben azalabilir, ancak 2 gün içinde normale dönmesi gerekir; gerektiğinde ek besin içerir.
  2. Fentanil yama ameliyat sonrası günde 3 kaldırın.
    Not: Buprenorfin fentanil yama tarafından yönetilmiyor operatif ağrı için gerektiğinde veya fentanil yama erken kaldırılır diye yönetilebilir.

4. terminal hasat cerrahi: işlem öncesi

  1. Tavşan anestezi. 1.3 ve 1.3.5 başarı ve bakım anestezi ile ilgili bölümlerine bakın.
    1. Tavşan tartın. 30 mg/kg ketamin ve 2 mg/kg xylazine bir şırınga birleştirir. Ketamin/xylazine IM anestezi ikna etmek için paraspinous kaslarda enjekte.
  2. Hazırlama odası ve veya tablolar anestezi olmak tavşan için beklerken hazırlayın.
    1. OR Hazırlık odasında: Kurulum saç kesme makineleri ve tavşan boyun ve kulak tıraş için bir vakum.
    2. Ameliyathanede: izleme ekipmanları kurulum ve problar (SpO2, sıcaklık) OR masaya; pozisyon oksijen ve isoflurane hazırlamak; tavşan için güvenli ve tablo baş ucunda maske yerleştirmek için yüz maskesi gazlı bez prizine bağlayın.
      Not: sağlamlılık üzerinde bağlı gazlı bez şeritler 2 kuyrukları yaklaşık 45 cm olmalıdır.
    3. Isınma su battaniye OR tablo açın. Üstünde tepe-in su battaniye, boyun desteği ve (daha sonra tavşan geri altında yer) bir dağıtıcı elektrot plaka rulo havlu getirin.
    4. Lidokain HCl 1 mL birleştirmek (% 2'stok) ve bölgelerelidokain HCl 1 mL (% 0.5 hisse senedi) (50/50 mix) içinde yerel bir analjezik olarak bir şırınga.
  3. Tavşan ne zaman tavşan tam anestezi, ameliyat için hazırlayın.
    1. Dışkı rektum 1.3.1 bir sıcaklık probu sonraki yerleşim için izin vermek için açıklandığı gibi kaldırın.
    2. Sternal çentik dan tavşan çene açısı için alan temiz tutmak için bir vakum kullanırken tıraş. Ayrıca sol arka orta ayak Nabız oksimetri sonda için tıraş.
      Not: Protokol cerrah-ecek var olmak belgili tanımlık adatavşanı sağ tarafta varsayar. OR Kur cerrah karşı tarafta yer olacak tarafı karşısında teller cerrah tutmak için bu adımda tersine. Gelecekteki adımları taraf da gerektiği şekilde değiştirdim.
    3. Tavşan Ameliyathaneye taşıma ve baş altında belgili tanımlık adatavşanı boyun altında haddelenmiş boyun destek havluyla ameliyat masasında sırtüstü yerleştirin. Düz ve yaklaşık yatay kadar yavaşça tavşan boyun uzatmak.
    4. Tavşan en yüz maskesi O2 ile 1 L/dak kanca ve isoflurane Merkezi'ni başlatın. Maske maske boyun destek havlunun altında tavşan çevresinde bağlı gazlı bez şerit uçları sarma tarafından güvenli. İsoflurane (genellikle % 1-2) yordamın anımsatıcısını için uygun anestezi korumak için gerektiği şekilde değiştirin.
    5. Dağıtıcı elektrot plaka tavşan geri altında ortalanmış emin olun. Sıcaklık ve nabız oksimetre probları yerleştirin.
    6. Tavşan ön bacaklar gevşek masaya onları bağlayarak dizginlemek.
      Not: İsteğe bağlı olarak, küçük bir plastik masa tavşan tavşan için göğüs/karın basınç tavşan göğüs/karın bölgesinde eğilerek cerrah üzerinden tabi korumak için üzerine getirin. Burada amaç karın içindekiler zorla Regürjitasyon önlemektir.
    7. Lidocaine (% 2'stok çözelti) 2 mL enjekte / bupivacaine (% 0.5 hisse senedi çözüm) (50/50 karıştırın; 2.4 adım) lokal anestezi için planlı boyun kesi hattı boyunca subkutan.
    8. Cerrahi sitesi betadin ile sprey. Cerrahi müdahale için temiz eldiven koymak.

5. terminal cerrahi (gemi hasat)

  1. Aletleri ve cerrahi alan hazırlamak.
    1. Bir masa örtüsü ve bir kağıt asmak için tavşan içeren bir temiz örtüsü paketini açın. Aracı tablo asmak.
    2. Araç paketi açın, enstrüman masaya yerleştirin ve aletler düzenlemek. Aşağıdaki ekipman enstrüman tablo üzerine yerleştirin: bir 20 mL şırınga ve bir 21G iğne.
    3. Elektrokoter kablo 7,25" Kantrowitz forseps kullanarak tavşan örtüsü için güvenli. Elektrokoterizasyon birimine fişi takın ve açın.
    4. 20 mL şırınga steril serum fizyolojik ile doldurun. Bu serum maruz doku işlem sırasında nemli tutmak için gerektiği gibi kullanın.
    5. Tavşan için kağıt örtüsü yerleştirin ve örtüsü tavşan boyun cerrahi sitesi üzerinde delik. Tavşan cilt yere delik köşeleri ile havlu Mengeneler kelepçe.
  2. Ortak Karotid arter yalıtmak.
    Not: Bu bölümü için 2 x cerrahi büyüteçler kullanılmalıdır.
    1. Havlu Mengeneler ile yaklaşık 7-9 cm cranially açık alt çene ve kelepçe cilt doğru uzanan orta çizgi boyunca bir elektrokoter ile deriyi kesme.
      Not: hasat sadece bir kaç gün önceki ameliyat sonrası ise, elektrokoter gerekli değildir. Sadece dikiş kesip ve yavaşça belgili tanımlık kesme önceki ameliyattan açık çekin.
    2. Kaudal sonunda şerit ile bir elektrokoter ile kısa bir yanal kesme yapmak. Büyük makas kesim takın ve açık açık tüm orta çizgi boyunca fasya incelemek. Elektrokoter ile orta hat aşağı disseke fasya kesti.
    3. Küçük parçalara makasla sağ taraftaki başlayan ortak Karotid arter yalıtmak için nefes borusu üzerinde V şekilli kaslar (sternocephalic kas) ve sternohyoid kas arasında incelemek.
    4. Sağ arter boyun tabanının dokulardan faringeal sinir geçiş için caudally cranially çevreleyen ücretsiz incelemek. Arter diseksiyonu sırasında geri çeker içinde yardım etmek için cerrahi silikon döngüler kullanın.
    5. Diseksiyon (Adım 5.2.3 - 5.2.4'ten) sol tarafında yineleyin.
    6. 3-0 ipek sütür ile kafatası (kafatası ölçüde vektör infüzyonu bulmak için ilk cerrahi yerleştirilen kullanım adventitial dikiş. vektör ile infüzyon bölümüne ortak karotis ligate Sonra onarılan arteriotomy Kaudal karotis ligate.
    7. Karotid segment d arasında tüketim ve Lümen serum fizyolojik ile yıkayın. Dış görev aşırı adventitial doku gemisinden trim ve karotis segment farklı için daha küçük parçalar halinde kesilmiş bitiş noktası analizleri (Histoloji, DNA, ribonükleik asit (RNA), protein, explant kültür, vb.).
    8. Beuthanasia ötenazi yapmak IV 1 mL enjekte ve ötenazi tavşan onaylayın.
  3. Aşağıdaki uygun biohazard ve "Sharps" protokolleri atık, vektör ile temas veya operatif alanında bir şey atmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Güven ile bu yöntemi uygulamak için ön deneyler işleci luminal endotel hücreleri ifadede öncelikle transgene ile verimli ve tekrarlanabilir gen transferi elde kurmak gereklidir. Deneyim, bu en kolay β-galaktozidaz ifade eder bir vektör kullanarak değerlendirilir. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) ortak Karotid segmentlerinin boyama 3 gün sonra vektör infüzyon, hem de nicel ters transkripsiyon Polimeraz zincir ile β-galaktozidaz mRNA (mesajcı RNA) ölçümü kaldırıldı reaksiyon (qRT-PCR), verimlilik, tekrarlanabilirlik ve transduced hücrelerin konumunu ortaya çıkarmak. Transgene ifade etkilerini araştırmak veya CIS-oyunculuk transkripsiyon öğeleri etkinliğini ölçmek deneyleri için genellikle transgene ölçmek mRNA düzeyi ilk belirtisi ve tekrarlanabilirlik gen transferi olarak.

Yeni bir işleç bizim laboratuvar yeterlilik Sitomegalovirüs (CMV) tarafından yönlendirilen bir β-galaktozidaz transgene ifade tavşan ortak Karotid arter adenoviral bir vektör (2 x 1011 vp/mL) ile transducing tarafından bu yöntemle kurmak istedi organizatörü. Transduced damar hasat 3 gün sonra vardı ve kemiği kesimleri içine kesilmiş. Bireysel segmentler veya her iki kesim açık eksenel edildi sağlam halkaları için yorum yaptı. Tüm parçaların X-gal microcentrifuge tüplerde lekeli vardı. Eksenel açık kesilmişti kesimleri yatay bir yüzey ve sonuna kadar maruz, pins kıvrık segment önlemek için gerektiği gibi kullanarak luminal yüzeyi Tarih yerleştirildi. Tr yüz görüntüleri luminal yüzeylerin sağlam endotel X kızla (şekil 3A ve 3B) Boyama gösterdi. Sağlam Karotid yüzük luminal yüzeylerinin eksenel görüntüleri X-gal sadece luminal görünüşte (rakamlar 3 c ve 3D) Boyama gösterdi. Eksenel açılmıştı kesimleri parafin işlenmiş, kesitli ve Hematoksilen ve Eozin ya da nükleer hızlı kırmızı ile karşı lekeli. Adventitial katman (rakamlar 3E ve 3F) Boyama az bir miktarda olsa görüntüleri gösterisi X-gal öncelikle endotel, boyama. Adventitial hücre iletim yolu ile vektör arteriotomy sitesi aracılığıyla veya sızıntı küçük dalları sitelere proksimal yan dal ligasyonu ile kaçağı oluşabilir. 29

Ayrı bir deneyde, yeni bir işleç transgene ifade, transgenes biyolojik aktivitelerinin araştırılması amaçlayan deneyler başlangıcı olarak tekrarlanabilir düzeyde elde yeterlik kurmak istedi. Tavşan ortak Karotid arter her iki bir apo A içeren yardımcı bağımlı adenovirus ile (2 x 1011 vp/mL) transduced-ben (HDAdApoAI) veya IL-10 (HDAdIL10) transgene, CMV organizatörü kontrolü altında. Transduced arterler hasat 3 gün sonra iletim vardı ve kemiği kesimleri içine kesti. RNA çıkarılan gemi parçaları ve apo A-IL-10 mRNA ifadeler ve ben qRT-PCR tarafından sayısal, normalleştirme için gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz ile aynı (GAPDH) mRNA (şekil 4) ayıklar. HDAdIL10 transduced arterlerde, yalnızca 1, 6 arterler çok düşük ama algılanabilir apo A vardı-ben mRNA sinyal. Apo A ifade demek-ben mRNA 700-fold büyük damarları HDAdApoAI HDAdIL10 ile transduced damarları ile transduced. Endojen IL-10 mRNA seviyesinin düşük HDAdApoAI transduced arterlerde tespit edildi, ortalama ile ifade 6-fold içinde HDAdIL10 transduced arterler arttı. Not, işte önemli içi ve arası artery değişkenlik iletim verimliliği ve transgene ifade, şekil 3 ve 4, sırasıyla gösterildiği gibi. Hatta deneyimli operatörleri ile bu değişkenliği bul.

Figure 1
Resim 1 . Ortak Karotis arter Arteriotomy. İyi forseps Karotid arter adventitia kavrayın ve yukarı doğru çekiş arter ile uygulamak için kullanılır. Bu manevra gemi Lümen genişletir ve içine bükülmüş 19 G iğne, böylece arter arka duvarına delinme riskini en aza indirerek eklenir dikey bir yüzey oluşturur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Ortak Karotid arteriotomy kapanış. Arteriotomy 7-0 polipropilen dikiş ile bir X-desen kullanarak, kapalı. İğne ve dikiş ilk geçiş arteriotomy (sayfa 1) hemen altındaki arter Lümen girer ve Lümen alt sol (site 2) çıkar. İğne ve dikiş arteriotomy çapraz ve Lümen (sitesi 3) sağ üst yeniden girin. İğne Lümen (site 4) sol üst, sonra çıkar. Nazik çekiş dikişi her iki ucundaki arteriotomy kapatır. (Site 1 ve site 4 çıkmadan) dikiş biter 2 kare knot ile bağlanmıştır. Gri daireler damar duvarından geçen dikiş siteler temsil eder. Kesintisiz mavi çizgiler dikişi damar duvarı dışında nerede alanları belirtir. Noktalı mavi çizgiler dikişi Lümen içinde nerede alanları belirtir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Verimli endotel transgene ifade. Tavşan ortak Karotid arter ile bir adenoviral vektör β-galaktozidaz transgene ve hasat 3 gün sonra ifade transduced. Transduced arter kesimleri X-gal sağlam halkaları veya Aksiyel bir kesim ile açılmasını sonra lekeli edildi. (A-B) Tr yüz görüntüleri eksenel açık kesilmiş Karotid yüzük luminal yüzeylerinin. (C-D) Sağlam Karotid Yüzüklerin luminal uzaya Aksiyel kez dinlendi. (E-F) X-gal lekeli, karotid kesimleri parafin gömülü kesitli ve (E) Hematoksilen ve Eozin ile veya (F) nükleer hızlı kırmızı ile karşı lekeli. Ölçek çubuğu 100 µm =. Ben intima; = M = medya; ve bir adventitia =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Miktar transgene mRNA ifade. Tavşan ortak Karotid arter her iki apo A ifade yardımcı bağımlı adenovirus ile transduced-ben (HDAdApoAI) veya IL-10 (HDAdIL10) CMV organizatörü kontrolü altında. Arterler 3 gün sonra hasat edildi. mRNA ifade(a)Apo a-ben ve (B) IL-10 qRT-PCR tarafından sayılabilir, aynı arter GAPDH mRNA için normalleştirilmiş ve rasgele birimler (AU) ifade. Ortalama değeri gösteren bir çubuk görünür; P değeri sırası toplamlı testidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Avantajları Dezavantajları
Kemirgen modellerle karşılaştırıldığında Filogenetik primatlar daha yakın Daha pahalı satın almak ve ev
Klinik çeviri hareket hızı daha fazla genetik çeşitlilik Doğurmak ve işlemek daha zor
Daha büyük gemiler daha kolay cerrahi işleme izin ve kantitatif analiz için daha fazla doku sağlar Daha kapsamlı düzenleme şartları
İnsanlar için tasarlanmış Endovasküler aygıtları kullanmanıza izin verir Daha az genetiği değiştirilmiş arka planlar
Antikorlar tavşan proteinler için daha az geniş yelpazesi
Büyük hayvan modellerle karşılaştırıldığında Nispeten ucuz satın almak ve ev Muhtemelen daha az klinik olarak ilgili bazı vasküler hastalıklar diğer büyük hayvan modellerinde daha
Doğurmak ve işlemek daha kolay
Mikrop-line Transgenesis karşılaştırıldığında Sadece büyük arter ifade Transgene; özellikle ilgi sitesi, transgene etkisini belirlenebilir Yöntemi uygulamanın dışında endotel hücrelere zordur
Kontralateral karotis eşleştirilmiş bir denetimi olarak kullanabilirsiniz; Sistemik parametreleri ortadan kaldırır (örn., tansiyon, kolesterol düzeyi) kontrolsüz değişkenler olarak Ameliyathane ve cerrahi uzmanlık gerekli; çekirdek özellikleri büyük olasılıkla mevcut değil
DNA düzenleyici sıra etkinliği büyük damar endotel sınama akışı sağlayarak daha yüksek Transgene en damar yataklarında ifade edemiyor
Potansiyel olarak daha hızlı ve daha ucuz
Sistemik transgenik protein olası maruz — hedef kapalı etkileri en aza indirir
Sistemik gen terapisi yaklaşımlar karşılaştırıldığında
(örneğin. Karaciğer iletim yolu ile periferik ven enjeksiyon)		 Daha kararlı transgene ifade sistemik (karaciğer) gen tedavisi daha Vektör teslim cerrahi müdahale gerektirir
Arter duvarında ifade Transgene transgenik protein yüksek seviyede yerel teslimat sağlayan Ameliyathane ve gereken cerrahi uzmanlık
Sistemik transgenik protein olası maruz — hedef kapalı etkileri en aza indirir Müdahale için özellikle hedef arterler sınırlı tedavi; sistemik faktörler muamele etmez (örn., lipidler)
Kontralateral karotis eşleştirilmiş bir denetimi olarak kullanabilirsiniz; Sistemik parametreleri (örneğin, tansiyon, kolesterol düzeyi) kontrolsüz değişkenleri ortadan kaldırır.
Çok daha düşük vektör doz gerekli

Tablo 1. Avantajları ve dezavantajları tavşan ortak Karotid arter seçici endotel gen transferi modeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cerrahi tekniğin bazı yönlerini özellikle dikkat hak. Tam pozlama ve gen transferi ve arteriotomy onarım kolaylaştırmak seferberlik ortak Karotid arter yolu ile dikkatli diseksiyon. Ancak, vasospasm önlemek için doğrudan manipülasyon Karotid arter diseksiyonu sırasında indirilmelidir. Buna ek olarak, herhangi bir arter ile bitişik kanama gazlı bezle hafif basınç uygulayarak durdurulması gerektiğini ve extravasated kan hemen normal salin alanıyla durulama ile temizlenmelidir. Ortak Karotid arter ile paralel vagus siniri zarar görmesini önlemek önemlidir. Planlı arteriotomy alanında adventitia kırparak operatör temiz ve işlevsel arteriotomy gerçekleştirmek ve arteriotomy onarmak için yardımcı olacaktır. Son olarak, kapalı ortak Karotid arter dalları tespit ve karotis Lümen öğesinden kaçağı önlemek için güvenli bir şekilde bakmaksızın gerekir.

Ayrıca vektör infüzyon ve arteriotomy onarım kritik yönleri vardır. Vektör infüzyon sırasında etkin iletim ulaşmak için fizyolojik veya biraz daha fazla kalibre için ortak karotis distend önemlidir. Arteriotomy tamirinde dikişi arteriotomy kenarlarına mümkün olduğunca yakın gemi duvar nüfuz ve temiz bir şekilde girin ve Lümen çıkmak yerine gerektiğini eksenel gemi duvardan geçmek. Eğer sadece dikişi eksenel yerine Radyal duvarın içinden geçen ve Lümen girerek, bir boşluk intima içinde kalır ve tromboz riskini artıracak damar duvarından geçer çünkü damar duvarının dış katmanlarını birlikte alınır. Dikiş penetrations çok geniş aralıklandırılmış veya dikişi aşırı sıkılır bağlı ise, doku kıvrımlar arteriotomy sitesinde oluşturulur. Bu kıvrımlar da tromboz riski artan normal Laminer kan akışını kesintiye uğratmak. Tutarlı akış özellikleri korumak önemli hastalıkların hayvan modellerinde gerçekleştirilen deneyler için (örn., ateroskleroz) değiştirilmiş akış için hastalık süreci30katkıda bulunabilir çünkü.

Yeni operatörler genellikle thrombosed arterler hasat, karşılaşma. Luminal trombozu arter deneysel bir örnek olarak kullanılamaz işleme yıkıcı bir komplikasyondur. Trombozu önlemek için düzenli olarak gen transferi önce IV heparin yönetmek. Tromboz da yukarıda açıklandığı gibi arteriotomy dikkatli kapatılması tarafından engellenir. Trombozu önlemek için heparin dozu artmış veya aspirin postoperatively verilebilir. Ancak, daha yüksek doz heparin de kanama Komplikasyonlar olasılığını artıracak ve özellikle iltihap okudu Eğer aspirin deneysel bitiş noktaları ile engelleyebilir. Bu nedenle, tromboz önleme aracı olarak geliştirilmiş cerrahi tekniğin odaklanmayı tercih edilir.

Çok şiddetle manipüle, Karotid arter trombozu için akışı azaltarak da katkıda bulunabileceğini spazm meydana gelebilir. Vasospasm karşılaşılırsa, topikal papaverin uygulama tarafından rahatlamış. Gemi hasat fazla 2-3 gün sonra iletim için planlanmıştır ve tromboz bir husustur, transkütanöz ultrason Noninvazif gemi a_ılabilinirse değerlendirmek için kullanılabilir. Thrombosed damar keşfi ötenazi için Konut maliyetleri kaydetmek için neden olabilir. Ek hayvanlar da derhal, deneysel grupları doldurmak için kayıtlı. Bu yöntemle ilişkili Peri ve sonrası intervention ölüm-meli var olmak < % 1 (i.e. sağlıklı tavşan gerçekleştirilen diğer ameliyatlar ile ilgili mortalite farklı değil)31.

Bir işleç cerrahi protokolü, bölümde açıklanan temsilcisi sonuçlarına yaklaşımları kullanarak verimli gen transferi endotel ihtiyaçlarına doğrulanması için gerçekleştirmek için bir yetenek teknik yönleri ile rahat olduktan sonra. Tekrarlanabilir gen transferi sağlanması ile sorunlar ortaya çıkarsa, suçlu iki bölgelerinden birinde olasıdır. Gemi izole ve kan Lümen yıkanmış sonra infüzyon vektör çözüm iletim sırasında seyreltilmiş değil DMEM yıkama arabellek kaldırmak önemlidir. Diğer önemli fizyolojik veya biraz daha fazla kalibre gemi vektör infüzyon sırasında distend için olanıdır. Distansiyonu arter fizyolojik kalibre ile iletim geliştirir olasıdır çünkü deneyim, düşük transgene ifadesi değil tam şişmiş ya da 20 dakika infüzyon sırasında güvenilir şişmiş kalmaz bir Şah damarı olan, verimlilik. Ancak, biz bu sistematik olarak eğitimi hiç. Bu fizyolojik seviyelerinin üzerinde infüzyon basınç artmakta, iletim verimliliği artırın ve ayrıca iletim hücre vasküler ortamda yüksek düzeyde izin mümkündür. Ancak, endotel bariyer bozulma büyük olasılıkla gemi zarar ve tromboz riski artar. Gemi genelinde 20 dakika vektör-kuluçka dönemi için şişmiş kalmazsa, vektör ortak Karotid arter dalları sızdırıyor olasıdır. Belirlemek ve karotis Lümen öğesinden kaçağı önlemek için tüm dalları ligate diseksiyonu sırasında dikkatli olun.

Bu yöntem tavşan kullanımı ile ilgili bazı sınırlamaları vardır. Tavşan ev ve diğer büyük hayvanlar (köpek, domuz, koyun); beslemek daha ucuz olduğu Ancak, satın alma maliyetleri, konut ve tavşan besleme önemli ölçüde daha fazla fare ve sıçanlar için vardır. Operasyon odası imkanları ve yönetmelikleri tavşan ameliyatlarında da kemirgen için çok daha geniş vardır. Buna ek olarak, önemli teknik uzmanlık cerrahi gen Aktarım Protokolü etkin bir şekilde gerçekleştirmek için gereklidir. Bu bilgi birikimi hiçbir resmi cerrahi eğitim gördü mü işleçleri tarafından elde edilebilir. En az 2 (Bu el yazması birincil yazar da dahil olmak üzere) bizim grup bireylerde cerrahi teknikleri öğrendim ve bunları üretken uyguladı. Yine de, operatör yüksek kaliteli veri oluşturmaya başlamadan önce titiz eğitim ve bir işleç'ın gen transfer verimi ve (temsilcisi sonuçları bölümünde açıklandığı gibi) tekrarlanabilirlik dikkatli bir doğrulama gereklidir.

Doğumdan transgene ifade neredeyse sadece bu yöntem29,32,33,34,35,36,37 ile endotel için olduğunu yararlı transgene etkileri endotel hücrelerinde araştırılması ve CIS etkili DNA düzenleyici dizilerinin endotel hücrelerinde etkinlik ölçümü sağlar. Adventitial veya medial hücre az sayıda transduced; Ancak, bu yöntem ve yetersizlik verimli bir şekilde nonendothelial hücre transduce diğer türleri (örneğin, düz kas hücreleri ve makrofajlar) vasküler duvar hücrelerinin çalışma yönteminin uygulanması engeller. Overexpression transduced endotel hücrelerinden salgılanan proteinlerin incelenmesi bu proteinlerin etkisi diğer vasküler hücre izin verebilirsiniz, ancak türleri, bu diğer vasküler hücre türleri içinde sigara salgılanan proteinlerin rolleri (örn. reseptörleri ya da proteinler sinyal iletimi dahil) bu yöntem ile araştırıldı.

Arter duvar hedefli gen terapisi test etmek için bir araç olarak yöntem preklinik diğer yöntemleri iki önemli şekilde farklıdır. İlk olarak, yöntem bir tavşan modeli yerine gen tedavisi test daha yaygın olarak kullanılan kemirgen modelleri8,12,15,38,39 in vivo için kullanır. Tavşan kullanımı insan genetik çeşitliliğin doğuştan kemirgenler sayısından daha fazla temsilcisi olan bir outbred hayvan modelinde, transgene ifade değerlendirme ve transgene ürün biyolojik rolü sağlar. Model gen terapisi ya normal tavşan arterler veya hastalıklı insan arterlerde bulundu benzer Arteryel patoloji var tavşan arterler değerlendirmek için kullanılabilir. Tavşan arterler de kemirgen arterler ve kemirgen arterler bulunandan daha analiz için çok daha fazla doku sağlamak için insan arterler boyutunda daha yakın. İkinci önemli fark bu yöntem cerrahi yaklaşım transgene vektör vasküler endotel sunmak için kullanmasıdır. Somatik gen tedavisi genellikle sistemik, en sık karaciğer transgene protein25,40plazma düzeylerini değiştirme amacı ile hedef alarak teslim edilir. Vasküler endotel hedefleyerek, yöntem tam damar hastalığı tedavisi için gerekli arter duvar içinde onun en yüksek konsantrasyon ile tedavi transgene ürün yerel olarak sağlar. Yalnızca yerel olarak transgene sunarak, yöntem Ayrıca transgene ürün sistemik yan etkileri ortadan kaldırır. Diğer gruplar peptidler, antikorlar veya başka kapsid sağlıklı ya da hasta endotel sistemik enjekte vektörlerinin hedefleme için yerel vasküler gen terapisi41,42 sağlamak için kullanma yöntemleri gelişmekte olan , 43. ancak, bu yöntemleri hedefleme geliştirme altında kalır ve hala başta karaciğer42,43,44önemli sistemik iletim tarafından karmaşık. Transgenes kesin ve etkili getirilmesi için diğer yerlerde de en az - varsa - iletim ile vasküler endotel bizim cerrahi yöntemdir. 1 yöntem aynı zamanda daha uygun olur, verimli ve yüksek-boyunca etkinlik düzenleyici DNA dizilerinin büyük gemi testleri için ortalama (mikrop-line transgenesis ya da endotel hedefli vektörlerin sistemik enjeksiyon ile karşılaştırıldığında) endotel, test transgene protein fonksiyonunda arter duvar ve damar duvar hedeflenmiş gen terapisi test etmek için.

Büyük damar endotel ifade edilir zaman herhangi bir transgene biyolojik rolünün incelenmesi bu yöntem sağlar. Hızlı kaybı--fonksiyonu reaktifler baskın olumsuz reseptörleri veya kısa saç tokası RNA gibi değişikliklerde, endojen endotel proteinler ve sinyal yolları rollerinin incelenmesi izin vermem. Yöntem aynı zamanda herhangi bir CIS etkili DNA dizisi büyük damar endotel hücreleri5,6,7transkripsiyon etkinliğini ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, yöntem gen transferi vektör verimlilik ve yerel olarak endotel için teslim ne zaman güvenlik için her türlü test sağlayan ve dayanıklı transgene ifade ulaşmak için vektör yeteneklerini ortaya çıkaracaktır. Son olarak, yöntemi geliştirme ve vektörel çizimler ve vasküler duvar hedefli gen terapisi sunmak için tasarlanmış transgenes kombinasyonları test sağlar. Yöntem olabilir-in gelecek tedavi edici genlerin tanımlamak için bir tarama aracı olarak hizmet verebilir-iğneyle enjekte vasküler duvar hedefli vektörel çizimler tarafından tüm büyük arterler (veya tüm hastalıklı büyük arterler) endotel teslim edilecektir. Adenovirus tür 545insanlarda önceden varolan dokunulmazlık nedeniyle, adenovirus türü 5 tabanlı vektörel çizimler klinik uygulamalarında kullanmak için zor. AAV vasküler gen terapisi kliniğe getirmek için gerekli olabilecek gibi adenovirus 5 kapsid mühendislik, alternatif adenovirus serotipleri46veya daha az immünojenik vektörel çizimler kullanımı kullanın. Deneysel bir aracı olarak, ancak, biz kan damarları1ifadesinde verimli ve dayanıklı transgene ulaşmada yardımcı bağımlı adenovirus 5 ile rekabet edebilecek herhangi bir vektör farkında değiller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Ve destek AdVec, Inc. ve karşılaştırmalı tıp bölümü Veterinerlik Hizmetleri için cerrahi tavsiye HDAd reaktifler, Julia Feyk yönetim yardım için kullanmak için izin için teşekkür ederiz. Bu eser HL114541 ve John L. Locke, Jr. hayırsever güven tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24G x 3/4" Terumo Medical Products SROX2419V
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery only
21G needle Becton Dickinson 305165 For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4" Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182 Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A Gene transfer surgery only
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498 Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 05098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine HCl, 2% Pfizer 00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5% Pfizer 00409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL  Patterson Veterinary 12496075705 Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr  Apotex Corp. NDC 60505-7006-2 Gene transfer surgery only
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
Gene transfer vector Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900 Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412 Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496 Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm Roboz 2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Forced air warming unit 3M Bair Hugger Model 505 Gene transfer surgery only
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2 Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 Needs ~16x magnification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
  2. Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
  3. Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
  4. Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
  5. Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
  6. Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
  7. Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
  8. Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
  9. Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
  10. Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
  11. Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
  12. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
  13. Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
  14. Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
  15. Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
  16. Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J. Experimental atherosclerosis in rabbits. Arq Bras Cardiol. 95 (2), 272-278 (2010).
  17. Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
  18. Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
  19. Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
  20. Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
  21. Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
  22. Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
  23. Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
  24. Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
  25. Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
  26. Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
  27. Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
  28. Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
  29. Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
  30. Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
  31. Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
  32. Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A. Endothelium-specific in vivo gene transfer. Circ Res. 77, 475-485 (1995).
  33. Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
  34. Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
  35. Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
  36. Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
  37. Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
  38. Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
  39. Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
  40. Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
  41. Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
  42. Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
  43. White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
  44. Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
  45. Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
  46. Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).

Tags

Tıp sorunu 135 insan hastalık ateroskleroz endotel gen tedavisi translasyonel çalışmalar tavşan Karotid arter damar hastalıkları adenovirus hayvan modelleri
<em>Vivo</em> Gen transferi için tavşan ortak Karotid arter endotel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wacker, B. K., Bi, L., Dichek, D. A. … More

Wacker, B. K., Bi, L., Dichek, D. A. In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium. J. Vis. Exp. (135), e56982, doi:10.3791/56982 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter